Name: Utilizzando umani indotti dellepatocita-come di derivati da cellule staminali pluripotenti per scoperta della droga (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 40 s
Description: Scopri come differenziare cellule staminali pluripotenti indotte umane in epatociti-like per screening ad alto rendimento. Questo metodo consente di generare modelli personalizzati per la scoperta di farmaci contro le malattie epatiche.

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Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health (DK55743, DK087377, DK102716 e HG006398 a Sad). Vorremmo ringraziare il Dr. Behshad Pournasr, Dr. James Heslop e Ran Jing per i loro contributi.

1. la cultura dell'essere umano ha indotto le cellule staminali pluripotenti indotte
<ol><li>
Rivestimento di altre matrici adatti a coltura hPSC o ricombinante umano proteina di fusione di E-caderina Fc (E-cad-Fc) 6<ol>
<li>Diluire E-cad-Fc a 15 μg/mL con soluzione fisiologica Phosphate-Buffered di Dulbecco contenente calcio e magnesio (DPBS (+)).</li>
		<li>Cappotto piatti di coltura del tessuto di sospensione 100 mm con 5 mL di diluito E-cad-Fc e incubare a 37 ° c per almeno 1 h. substrato di rimuovere e sostituire con 5 mL di terreno (ad es., mTeSR1 di cui d'ora in poi come M-medium)7. Nota: Il terreno di coltura utilizzato in questo protocollo è preparato seguendo protocolli pubblicati7. Tuttavia, parecchie altre preparazioni di media sono state descritte, o sono disponibili in commercio, che sono probabilmente compatibile con la procedura.</li>
		<li>Recuperare una fiala di iPSCs crioconservati da azoto liquido. Scongelare a 37 ˚ c, fino a quando rimane un cristallo di ghiaccio. Pipettare delicatamente le cellule in una provetta conica sterile di 15 mL contenente 4 mL di M-terreno.</li>
		<li>Centrifugare a 300 x g per 5 min. eliminare il surnatante e Risospendere delicatamente cellule con 5 mL di terreno completato con 10 µM di Y-27632, un inibitore selettivo della chinasi di proteina Rho-collegata, arrotolato-arrotola contenente (ROCK).</li>
		<li>Togliere la soluzione di M dal punto 1.1.2 e trasferire 5 mL di cellule da passo 1.1.4 a piatti di coltura del tessuto E-cad-Fc-coated 100 mm sospensione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mantenere iPSCs umane nella cultura
	<ol>
<li>Una volta iPSCs raggiungere intorno 80% confluency, rimuovere il terreno di coltura e lavare una volta con calcio e magnesio libero DPBS (-). Aspirare il DPBS (-) e aggiungere una quantità sufficiente di soluzione di EDTA 0.02% per coprire le piastre, quindi incubare fino a 3 min a temperatura ambiente. Nota: Confluenza di 80%, il piatto dovrebbe contenere circa 2 x 107 celle. È importante di non invadere le cellule e per garantire che le cellule conservano una morfologia indifferenziata. La pluripotenza delle cellule può essere determinato mediante colorazione con indicatore delle cellule staminali Tra-1-60 o equivalente8.</li>
		<li>Non appena le cellule cominciano a rilasciare, rimuovere la soluzione di EDTA 0.02% e inondare il piatto con 10 mL di M-medio e rilasciare le cellule. Facilitare il distacco delle iPSCs pipettando delicatamente. Nota: Il tempo medio di incubazione per le cellule staccare è circa 3 min, ma questo deve essere determinato empiricamente per ciascuna riga di iPSC. Le cellule devono essere rilasciate come piccoli cluster contenente circa 5-10 iPSCs per ogni cluster.</li>
		<li>Trasferire 1/10 delle cellule sospese per fresco piatto di coltura del tessuto sospensione di rivestite con 100 mm di E-cad-Fc contenente 5 mL di M-medio. Incubare le colture a 37 ˚ c sotto il 4% O25% CO2 e cambio medio giornaliero. Nota: Anche se iPSCs ordinariamente sono coltivate in condizioni fisiologiche di ossigeno per promuovere la pluripotenza, iPSCs possono anche essere coltivate utilizzando ossigeno ambientale.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. differenziazione delle iPSCs umane per Hepatocyte-come le cellule in piastre da 96 pozzetti
Nota: Questa sezione descrive la differenziazione delle iPSCs in un formato che è compatibile con lo screening. Utilizzando questo approccio, è possibile indurre iPSCs umane per differenziare e formare degli epatociti-come le cellule in 20 giorni. Mentre questo è adatto per la maggior parte dei saggi, la lunghezza della cultura può essere estesa per migliorare la maturazione delle cellule.
<ol><li>
Rivestimento piastre di coltura del tessuto 96 pozzetti con matrice della membrana basale ridotto fattore di crescita
	<ol>
<li>Preparare il brodo diluendo la matrice a 2 mg/mL con mezzo di coltura tissulare DMEM/F12 sterile ghiacciata. Dividere la matrice in 250 aliquote del μL e conservare a-80 ˚ fino a quando richiesto. Chill 10ml di DMEM/F12 su ghiaccio per 30 min. recuperare un 250 μL aliquotare di 2 mg/mL di brodo di matrice e disgelo sul ghiaccio.</li>
		<li>Combinare la matrice con 10 mL di DMEM/F12 freddo mescolando delicatamente con una pipetta pre-refrigerata per ottenere la concentrazione finale di 0,05 mg/mL.</li>
		<li>Trasferire 100 μL di matrice diluito in ciascun pozzetto di una piastra di coltura del tessuto 96 pozzetti. Incubare a 37 ° c, 4% O25% CO2 per almeno 1 h. scartare la matrice e sostituire con 50 μL di M-medium per pozzetto. Conservare a 37 ° C, 4% O25% CO2 fino a quando necessario.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cellule di piastra per differenziazione
	<ol>
<li>Fino a quando le cellule si avvicinano 80% confluenza della coltura iPSCs sulle piastre di 100 mm. Assicurarsi che la piastra contiene circa 2 x 107 cellule. Determinare i numeri di cellulare di citometro a flusso delle cellule o un emocitometro. Nota: Con esperienza, la qualità delle cellule iPSCs può essere giudicata da microscopia; Tuttavia, quasi il 98% delle cellule dovrebbe esprimere marcatori di pluripotenza come l'epitopo di TRA-1-60 quando misurati mediante FACS o immunostaining. È importante che le cellule rimangono attivamente divisione e non sono invasi.</li>
		<li>Per raccogliere le iPSCs da ogni 100 mm di spessore, aspirare il terreno di coltura e sciacquare con 5 mL di DPBS (-). Sostituire il risciacquo con 3 mL di soluzione di distacco delle cellule (per esempio, accutase) e incubare per circa 2 min a 37 ° C,24% O 5% CO2. Nota: È importante seguire il distacco delle cellule da microscopia. Non eccessivamente digest con accutase. L'obiettivo è quello di rilasciare le cellule come piccoli grappoli con trattamento minimo.</li>
		<li>Non appena le cellule iniziano a staccare, raccolto con l'aggiunta di 7 mL di M-terreno. Pipettare diverse volte per dissociare le colonie di cellule in piccoli grappoli di intorno 3-6 celle (Figura 1A).</li>
		<li>Raccogliere le iPSCs in una provetta sterile di 15 mL e centrifugare a 300 x g per 5 min. eliminare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 5ml M-medio.</li>
		<li>Distribuire uniformemente le cellule in piastre da 96 pozzetti rivestite con matrice di pipettaggio 50 μL di cellule in sospensione in ciascun pozzetto. Per impostare ogni piastra a 96 pozzetti, utilizzare una piastra di 100 mm di iPSCs con celle al circa 80% confluency, che contiene circa 5 x 106 cellule per la differenziazione di installazione. Utilizzare una pipetta multicanale per accelerare questo processo. Coltura le cellule durante la notte a 37 ° c, 4% O25% CO2. Nota: È importante che un numero uguale di cellule è depositato in ogni pozzetto per garantire differenziazioni riproducibile.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Indurre la differenziazione delle cellule
	<ol>
<li>Esaminare le piastre da 96 pozzetti da microscopia per garantire che le cellule coprono almeno il 70% della superficie di ogni singolo bene. Se la copertura è inferiore al 70%, sostituire il mezzo con mezzo fresco e incubare per altre 24 h a 37 ˚ c,24% O 5% CO2. Nota: Incubando le cellule per più di 48 h dopo il placcaggio senza indurre differenziazione comunemente riduce l'efficienza della differenziazione. La differenziazione si verifica anche utilizzando ossigeno ambientale, anche se l'efficienza può essere interessato.
</li>
		<li>Per 1 giorno per giorno 2 di differenziazione, sostituire il terreno di coltura con RPMI supplementato con 2% B27 (senza insulina), 20 ng/mL FGF2 activina A 100 ng/mL e 10 ng/mL BMP4. Aggiungere 100 μL di mezzo ogni pozzetto e incubare a 37 ° c, in ambiente O25% CO2 con un cambio medio giornaliero per 2 giorni. Nota: Trattare con un numero elevato di piastre da 96 pozzetti richiedono l'uso di una pipetta assistita o robot. 12 canali e 96 pipette sono ideali per il cambio medio giornaliero.</li>
		<li>Per giorno 3 al giorno 5 di differenziazione, Sostituisci il terreno di coltura con RPMI completato con 2% B27 (senza insulina) e 100 ng/mL Activin A. Culture cellule a 37 ˚ c, in ambiente O25% CO2 con cambio giornaliero medio per 3 giorni.</li>
		<li>Giorno di differenziazione 5, prima di sostituire con terreno di coltura fresco, delizia ogni bene con 100 μL 0,02% di soluzione di EDTA per 30 s, quindi rimuovere e sostituire con terreno di coltura fresco. Nota: Se la differenziazione di endoderma è efficiente, il monostrato di differenziazione delle cellule è incline al peeling dalla piastra. Un breve trattamento con una soluzione di EDTA 0.02% aiuta ad alleviare distacco cellulare. Questo trattamento non influenza la differenziazione di epatociti.</li>
		<li>Per la differenziazione tra 6 giorni a 10, sostituire il terreno di coltura con RPMI / 2% B27 (con insulina) completati con 20 ng/mL BMP4 e 10 ng/mL FGF2 e incubare a 37 ° c, 4% O25% CO2 per 5 giorni con cambio medio giornaliero. Questa fase induce le cellule a differenziarsi in cellule progenitrici epatiche.</li>
		<li>Per la differenziazione tra 11 giorni al 15, sostituire il terreno di coltura con RPMI / 2% B27 (con insulina) completati con 20 ng/mL HGF. Incubare a 37 ° c, 4% O25% CO2 per 5 giorni con cambio medio giornaliero.</li>
		<li>Per la differenziazione tra i giorni 16 a 20, è necessario sostituire il terreno di coltura con un mezzo di coltura cellulare dell'epatocita (HCM) completato con 20 ng/mL di Oncostatin M (OSM). Incubare le cellule a 37 ˚ c, in ambiente O25% CO2 con cambio medio giornaliero per 5 giorni. Nota: La riproducibilità della differenziazione tra singoli pozzetti in modo efficiente può essere determinata misurando il livello relativo di albumina, AFP o APOB secernuta nel mezzo di ELISA (Vedi 3.2).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. piccola molecola Screening
Nota: Quanto segue descrive la procedura utilizzata per identificare i composti che possono essere utilizzati per abbassare il livello di APOB nel mezzo dell'epatocita-come delle cellule derivate da ipercolesterolemia familiare iPSCs. Una descrizione del modello e suo uso nell'identificazione di farmaci ipocolesterolemizzanti è stata descritta in dettaglio in precedenza5,9. Nell'esempio corrente, sono stati proiettati 1.000 composti dalla libreria Collection Compound South Carolina (SC3). Ogni composto è stato testato ad una concentrazione di 2 μg/mL.
<ol><li>
Trattamento di iPSC - derivati epatociti con piccole molecole
	<ol>
<li>Diluire la libreria principale composta per generare piastre delle scorte di lavoro con composti ad una concentrazione di 20 μg/mL in 2% DMSO e conservare a-20 ˚ c.</li>
		<li>Preparare abbastanza piastre da 96 pozzetti degli epatociti iPSC-derivati per consentire ogni composto da testare. Nota: Il numero di composti che saranno proiettati a dettare il numero di piastre da 96 pozzetti necessari. In generale, un singolo dovrebbe essere ben preparato per ogni composto, oltre a ulteriori pozzi per eventuali campioni di controllo. Ultraperiferiche pozzetti della piastra sono comunemente evitati per ridurre la possibilità di effetti di bordo che può corrompere l'interpretazione. Risultati di ricerca trovati possono essere identificati utilizzando il metodo di punteggio z senza la necessità di utilizzare la replica. Se replica è inclusi, è più opportuno utilizzare il test t.</li>
		<li>Al completamento di differenziazione (Vedi 20, giorno 2.3.7), sostituire il terreno di coltura con 100 μL di HCM frescoaddizionata di 20 ng/mL di Oncostatin M. Incubare a 37 ° c, 4% O25% CO2 per esattamente 24 h. recuperare il terreno di coltura in un fresco piastra a 96 pozzetti e conservare a-20 ˚ c. Utilizzare questo esempio per calcolare il livello di APOB nel medium prima dell'aggiunta di droga.</li>
		<li>Aggiungere 90 μL di fresco HCM addizionata di 20 ng/mL di Oncostatin M in ciascun pozzetto. Aggiungere 10 μL di ogni composto dallo stock di lavoro dopo la miscelazione di pipettaggio. Aggiungere DMSO allo 0,2% per il controllo pozzi per abbinare la concentrazione finale nei campioni trattati e incubare a 37 ° c, ambiente O25% CO2 per esattamente 24 h. il terreno di coltura di raccogliere e conservare a-20 ˚ c. Utilizzare questo esempio per determinare il livello di APOB dopo trattamento con composti.</li>
		<li>Opzionale - le cellule restanti possono essere elaborate per immunostaining, attuabilità delle cellule o le analisi dei livelli di mRNA usando approcci standard. Nota: Questo schermo è stato progettato per identificare farmaci che ha avuto un rapido effetto sui livelli di APOB. Tuttavia, a seconda del modello di malattia, le analisi a valle o meccanismo di azione della droga, può essere utile per il trattamento del campione per più giorni.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Determinare i livelli di APOB da ELISA
	<ol>
<li>Determinare la concentrazione di apolipoproteina B (APOB) da entrambi i pre- e post-droga campioni trattati usando un kit di sviluppo di APOB ELISA umano seguendo protocolli del produttore.</li>
		<li>
Preparare le seguenti soluzioni
		<ol>
<li>Tampone di lavaggio, composto di 0.05% Tween 20 in PBS, pH 7,4. Conservare a 4 ° c fino all'utilizzo.</li>
			<li>Tampone di incubazione, è composto da 0.05% Tween 20 e 0,1% albumina di siero bovino (BSA) in PBS, pH 7,4. Conservare a 4 ° c fino all'utilizzo.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Preparare l'anticorpo APOB (mAB 20/17) diluendo a 2 µ g/mL in PBS, pH 7,4. Aggiungere 100 μL di anticorpo diluito per pozzetto e incubare a 4 ˚ c durante la notte.</li>
		<li>Rimuovere l'anticorpo delle placche di dosaggio e lavare ogni ben due volte con 200 μL di PBS, pH 7,4.</li>
		<li>Aggiungere 200 µ l/pozzetto di 0.05% Tween 20, 0,1% di albumina di siero bovino (BSA) in PBS, pH 7.4 e incubare su una piattaforma d'agitazione per 1 h a temperatura ambiente.</li>
		<li>Preparare una curva standard di 8 punti usando 0.05% Tween 20 e 0.1% BSA in PBS, pH 7.4 con le seguenti concentrazioni di APOB: 300 ng/mL, 200 ng/mL, 175 ng/mL, 150 ng/mL, 125 ng/mL, 100 ng/mL, 75 ng/mL e 50 ng/mL.</li>
		<li>Diluire i campioni di prova 1:4 con 0.05% Tween 20 e 0.1% BSA in PBS, pH 7.4.</li>
		<li>Dopo 1 h di blocco con tampone di incubazione, scartare il buffer e lavare le piastre di dosaggio cinque volte con 200 μL di 0.05% Tween 20 in PBS, pH 7,4.</li>
		<li>Rimuovere qualsiasi buffer di lavaggio residua completamente e trasferire 90 µ l dei campioni diluiti e gli standard APOB per le piastre di dosaggio. Incubare a temperatura ambiente in un agitatore per 1 h.</li>
		<li>Scartare il campione e lavare con 200 μL 0.05% Tween 20 in PBS, pH 7.4 per pozzetto. Ripetere i lavaggi per un totale di 5 volte. Aggiungere 100 μL per pozzetto di mAB LDL 11-biotina 1:1,000 diluito in 0.05% Tween 20 e 0.1% BSA in PBS, pH 7,4. Incubare a temperatura ambiente su una piattaforma d'agitazione per 1 h.</li>
		<li>Gettare il reagente e lavare con 200 µ l per bene il tampone di lavaggio 5 volte. Aggiungere 100 μL per pozzetto di anticorpo streptavidina-HRP (1:1, 000 diluizione mediante tampone di incubazione), poi incubare a temperatura ambiente su una piattaforma d'agitazione per 1 h.</li>
		<li>Gettare il reagente e lavare con 200 μL 0.05% Tween 20 in PBS, pH 7.4 per pozzetto. Ripetere i lavaggi per un totale di 5 volte. Completamente rimuovere il tampone di lavaggio residua delle placche di dosaggio e aggiungere 100 μL per pozzetto di tetrametilbenzidina (TMB) e incubare a temperatura ambiente per 8 min.</li>
		<li>Senza rimuovere il substrato TMB, direttamente aggiungere 100 μL per pozzetto di soluzione di arresto (HCl 1N).</li>
		<li>Determinare l'assorbanza a 450 nm utilizzando un lettore di piastra.</li>
		<li>Una curva standard può essere stabilita, utilizzando il metodo di quattro parametri di regressione logistica, poi utilizzato per definire la concentrazione di APOB in ogni esempio10.</li>
		<li>Esaminare il pre-droga: post-droga rapporto di APOB in ogni campione per identificare i composti con il potenziale per abbassare APOB livelli nel mezzo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Sampaziotis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholangiocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+for+disease+modeling+and+drug+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cholangiocytes derived from human induced pluripotent stem cells for disease modeling and drug validation.</a> Nat Biotechnol. 33 (8), 845-852 (2015).</li>
<li>Mallanna, S. K., Duncan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+hepatocytes+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of hepatocytes from pluripotent stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 26 (Unit 1G 4), (2013).</li>
<li>Song, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+hepatocyte-like+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Res. 19 (11), 1233-1242 (2009).</li>
<li>Cai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+functional+hepatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional hepatic cells.</a> Hepatology. 45 (5), 1229-1239 (2007).</li>
<li>Si-Tayeb, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+generation+of+human+hepatocyte-like+cells+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells.</a> Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).</li>
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<li>Davidson, M. D., Ware, B. R., Khetani, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-derived+liver+cells+for+drug+testing+and+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Discov+Med%22%5BJournal%5D)">Stem cell-derived liver cells for drug testing and disease modeling.</a> Discov Med. 19 (106), 349-358 (2015).</li>
<li>Choi, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+drug+screening+and+gene+correction+for+treating+liver+disease+using+patient-specific+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Efficient drug screening and gene correction for treating liver disease using patient-specific stem cells.</a> Hepatology. 57 (6), 2458-2468 (2013).</li>
<li>Tafaleng, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+model+personalized+variations+in+liver+disease+resulting+from+alpha1-antitrypsin+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells model personalized variations in liver disease resulting from alpha1-antitrypsin deficiency.</a> Hepatology. 62 (1), 147-157 (2015).</li>
<li>Jing, R., Duncan, C. B., Duncan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-molecule+screen+reveals+that+HSP90beta+promotes+the+conversion+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+endoderm+to+a+hepatic+fate+and+regulates+HNF4A+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A small-molecule screen reveals that HSP90beta promotes the conversion of induced pluripotent stem cell-derived endoderm to a hepatic fate and regulates HNF4A turnover.</a> Development. 144 (10), 1764-1774 (2017).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Obiettivo basata scoperta di nuovi farmaci, dove vengono identificate piccole molecole che influenzano l'attività di una proteina specifica, è stato al centro di molti sforzi di selezione esistente. Anche se questo approccio ha fornito numerosi prodotti farmaceutici, schermi basati sull'inversione di un fenotipo, la farmacologia classica, hanno avuto più successo nell'individuazione di composti di first-in-class che sono stati clinicamente efficace1. Uno svantaggio di scoperta della droga fenotipi...

Successo nell'identificazione di farmaci che possono essere utilizzati per indirizzare una malattia rara si basa sullo sviluppo di analisi che può essere utilizzato per lo screening. Ipotesi o schermi basati su destinazione (inversa farmacologia) sono utili, ma richiedono una dettagliata comprensione delle basi molecolari della malattia. Fenotipici schermi (farmacologia classica) evitano la necessità di una comprensione dettagliata delle vie biochimiche, ma invece si basano sullo sviluppo di modelli che rispecchiano esattamente la patofisiologia della malattia. Nonostante l'entusiasmo per gli approcci basati su target, analisi delle droghe first-in-class approvato dalla FDA rivelano che schermi fenotipici sono state molto più successo1. L'obiettivo generale di questo metodo è di stabilire una piattaforma per high throughput screening che può essere utilizzato per identificare piccole molecole per il trattamento della malattia epatica metabolica. Diversi modelli in vitro sono stati descritti compreso epatociti primari, cellule del tumore epatico e di cellule progenitrici del fegato2. Tuttavia, la maggior parte di questi modelli hanno dei limiti, e c'è bisogno di nuovi modelli che possono ricapitolare con precisione la patofisiologia delle carenze metaboliche del fegato nella cultura. Recentemente, le cellule staminali pluripotenti umane combinate con gene editing hanno offerto l'opportunità di modellare anche il più raro di malattie rare in cultura senza la necessità di accesso pazienti direttamente3. Mentre l'uso di paziente-specific iPSCs come uno strumento per scoprire piccole molecole per il trattamento delle malattie del fegato è concettualmente ragionevole, ci sono soltanto alcuni rapporti che dimostrano la fattibilità di questo approccio4. Tuttavia, recentemente abbiamo stabilito una piattaforma che utilizzato epatociti iPSC-derivati per identificare con successo farmaci che possono essere riproposto per il trattamento delle carenze nel metabolismo del fegato5.
Questo protocollo viene illustrato il processo di differenziazione umana iPSCs dell'epatocita-come le cellule in piastre da 96 pozzetti e il loro utilizzo per lo screening di una libreria di piccole molecole. Viene inoltre descritto l'analisi dell'endpoint utilizzando ipercolesterolemia come un esempio di malattia epatica metabolica. Questo approccio dovrebbe essere utile per studiare il ruolo e l'applicazione di piccole molecole nel contesto della malattia infettiva del fegato, malattia epatica metabolica, tossicità dei farmaci e altri disturbi del fegato.

<table><tbody><tr><td>Piastre sterili per colture tissutali da 100 mm x 20 mm.</td><td>Piastre di coltura in</td> sospensione sterile Corning <td>430167</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 20 mm</td><td>Piastra</td><td></td> di coltura tissutale Corning 430591 <td></td></tr><tr><td>96 pozzetti&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Albumina anti-umana</td><td>Dako</td><td>A 0001</td><td></td></tr><tr><td>Anti-umano FOXA2 (6C12)</td><td>Novus Biological</td><td>H00003170-M12</td><td></td></tr><tr><td>Anti-umano HNF4 alfa</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-6556</td><td></td></tr><tr><td>Anti-umano Oct-3/4 anticorpo</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-9081</td><td></td></tr><tr><td>Anti-umano SOX17</td><td>R& D</td><td>AF1924</td><td></td></tr><tr><td>Millipore</td><td>coniugato anti-umano TRA-1-60 FITC</td><td>FCMAB115F</td><td></td></tr><tr><td>Activina A Proteina umana ricombinante&nbsp;</td><td>Integratore Invitrogen</td><td>PHC9563</td><td></td></tr><tr><td>B-27, meno insulina&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>0050129SA</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Integratore, senza siero</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>proteina umana ricombinante BMP4</td><td>Invitrogen</td><td>PHC9533</td><td></td></tr><tr><td>reagente per dissociazione cellulare StemPro&nbsp; Accutase&nbsp;</td><td>Saggio</td> di vitalità cellulare luminescente <td>Invitrogen A1110501</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo&nbsp;</td><td>Promega</td><td>7572</td><td></td></tr><tr><td>DPBS+(calcio, magnesio)</td><td>Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>DPBS-(senza calcio, senza magnesio)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES&nbsp;</td>Kit <td></td> di sviluppo ELISA APOB umano <td>Invitrogen</td> 11330057 <td></td></tr><tr><td></td><td>Mabtech</td><td>3715-1H-20</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di crescita dei fibroblasti 2 (FGF2)</td>Terreno <td></td> di coltura per epatociti PHG0023 <td></td><td>Invitrogen</td></tr><tr><td>(HCM Bullet Kit)&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>CC-3198</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di crescita degli epatociti&nbsp; (HGF)</td><td>Invitrogen</td><td>PHC0321</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina&nbsp;</td><td>Soluzione di</td> aminoacidi non essenziali Invitrogen <td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td> Proteine umane ricombinanti <td>Invitrogen</td><td>11140076</td><td></td></tr><tr><td>oncostastatina M (OSM)&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>PHC5015</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td></td> Terreno di cellule staminali pluripotenti senza <td>feeder Invitrogen</td> 15140163<td></td></tr><tr><td>: mTesR1&nbsp;</td><td>Tecnologie STEMCELL</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Matrice della membrana basale con fattore di crescita ridotto&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A1413301</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medio, HEPES&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>22400105</td><td></td></tr><tr><td>StemAdhere Matrice definita per hPSC (E-cad-Fc)</td><td>Primorigen Biosciences</td><td>S2071</td><td></td></tr><tr><td>TMB-ELISA Soluzione di substrato</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>34022</td><td></td></tr><tr><td>Millipore</td><td>coniugato anti-TRA-1-60 FITC</td><td>FCMAB115F</td><td></td></tr><tr><td>Versene (EDTA) 0,02%&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>17-711E</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 inibitore ROCK</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72302</td><td></td></tr></tbody></table>

utilizzando umani indotti dell'epatocita-come di derivati da cellule staminali pluripotenti per scoperta della droga

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

La possibilità di differenziare le cellule staminali umane pluripotenti indotte (iPSCs) in epatociti-come le cellule (HLCs) offre nuove opportunità per studiare gli errori innati di metabolismo epatico. Tuttavia, per fornire una piattaforma che supporta l'identificazione di piccole molecole che potenzialmente può essere utilizzato per trattare la malattia del fegato, la procedura richiede un formato di impostazioni cultura che è compatibile con migliaia di composti di screening. Qui, descriviamo un protocollo utilizzando condizioni di cultura completamente definita, che consentono la differenziazione riproducibile delle iPSCs umane dell'epatocita-come le cellule in piastre a 96 pozzetti tessuto coltura. Forniamo anche un esempio di utilizzo della piattaforma ai composti di schermo per la loro capacità di abbassare l'apolipoproteina B (APOB) prodotta dagli epatociti iPSC-derivato generati da un paziente di ipercolesterolemia familiare. La disponibilità di una piattaforma che è compatibile con la scoperta della droga dovrebbe consentire ai ricercatori di identificare approcci terapeutici per le malattie che colpiscono il fegato.

Generazione degli epatociti - come cellule: Figura 1 descrive l'intervallo di tempo dei cambiamenti che si verificano durante la differenziazione delle iPSCs umane dell'epatocita-come le cellule. La cultura di iPSCs su E-Cad-Fc fornisce circa 2mm colonie di diametro che esprimono il marcatore di pluripotent OCT4 (Figura 1A-B). La morfologia delle cellule cresciut...

Il protocollo presentato qui descrive una piattaforma per identificare piccole molecole per il trattamento dell'affezione epatica. Una descrizione dettagliata è presentata dettagliare come differenziarsi iPSCs in cellule con le caratteristiche dell'epatocita in piastre da 96 pozzetti e per utilizzare le celle per schermo per piccole molecole con potenziale attività terapeutica.

Utilizzando umani indotti dell'epatocita-come di derivati da cellule staminali pluripotenti per scoperta della droga

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di differenziare le cellule staminali pluripotenti indotte umane in cellule simili agli epatociti in un modo che sia adatto per lo screening ad alto rendimento. Le cellule epatiche sono difficili da coltivare in laboratorio, tuttavia possono essere generate da cellule staminali pluripotenti indotte che forniscono una piattaforma di screening per identificare i trattamenti per le malattie del fegato. Il vantaggio principale di questa tecnica è che un numero illimitato di epatociti può essere generato da qualsiasi paziente con malattia del fegato che ricapitola la malattia in laboratorio.La procedura è relativamente facile da stabilire, anche senza una vasta conoscenza della biologia delle cellule staminali. La sua riproducibilità consente ai ricercatori di esaminare migliaia di composti senza la necessità di una robotica complessa. Ray Liu, un borsista post-dottorato, e Paige Lamprecht, una studentessa laureata, dimostreranno oggi la procedura.Innanzitutto, diluire la proteina di fusione Ecad a 15 microgrammi per millilitro con soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco, o DPBS, che contiene calcio e magnesio. Rivestire pia

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Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Questo articolo si concentrerà sulla creazione di endoderma epatiche umane da popolazioni di cellule staminali embrionali.

Generazione robusta di epatociti-come le cellule da popolazioni di cellule staminali embrionali

Il metodo presentato qui descrive una soluzione scalabile e buone pratiche di fabbricazione (GMP) sistema di differenziazione -ready per generare cellule epatociti-come l'essere umano da cellule staminali pluripotenti. Serve come un sistema economico e standardizzato per generare cellule epatociti-come l'essere umano per la ricerca di base e applicata fegato umano.

Definito e Generazione scalabile di cellule epatociti-come da cellule staminali umane pluripotenti

Questo protocollo descrive un approccio semi-automatizzato per produrre dell'epatocita-come le cellule da cellule staminali pluripotenti umane in un formato ben 96 PORTATARGA. Questo processo è rapido ed economico, permettendo che la produzione di qualità ha assicurato lotti dell'epatocita-come delle cellule per la ricerca umana di base e applicata.

Produzione semi-automatizzata di Hepatocyte come cellule staminali pluripotenti

Questo protocollo descrive in dettaglio un metodo monostrato e privo di siero-per generare in modo efficiente cellule simili a epatociti da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) in 18 giorni. Ciò comporta sei passaggi in quanto gli hPSC si differenziano in sequenza in tipi di cellule intermedie come la striscia primitiva, l'endoderma definitivo, il foregut posteriore e i progenitori del germoglio epatico prima di formare cellule simili a epatociti.

Differenziazione efficiente delle cellule staminali pluripotenti umane nelle cellule del fegato

Questo protocollo descrive un approccio per produrre epatosfere da cellule staminali pluripotenti umane utilizzando un sistema di coltura definito e l'autoassemblaggio delle cellule. Questo protocollo è riproducibile in un certo numero di linee cellulari, conveniente e consente la produzione di epatosfere umane stabili per l'applicazione biomedica.

Produzione senza siero di epofere umane tridimensionali da cellule staminali pluripotenti

L'obiettivo di questo articolo è quello di fornire un approccio standardizzato per indurre la differenziazione del progenitore epatico umano dalle cellule staminali pluripotenti. Lo sviluppo di questa procedura con formulazioni di media pronti all'uso offre all'utente un sistema facile per generare cellule epatiche umane per la ricerca e la traduzione biomedica.

Specifica del progenitore epatico da cellule staminali pluripotenti utilizzando un sistema di differenziazione definito

Questo manoscritto descrive un protocollo dettagliato per la differenziazione delle cellule staminali embrionali umane (hESC) in cellule funzionali simili a epatociti (HHC) completando continuamente Activin A e CHIR99021 durante la differenziazione hESC in endoderma definitivo (DE).

Un metodo efficiente per l'induzione di cellule simili a epatociti diretti da cellule staminali embrionali umane

Qui presentiamo un metodo non genetico per generare sferoidi epatici autologhi umani usando cellule mononucleate isolate dal sangue periferico allo stato stazionario.

Sferoidi epatici umani da sangue periferico per studi sulle malattie del fegato

Questo protocollo descrive la generazione di organoidi epatici endodermici (eHEPO) veloci e riproducibili. Con questo protocollo, gli eHEPO possono essere prodotti entro 2 settimane e ampliati a lungo termine (più di 1 anno) senza perdere la loro differenziazione e funzionalità.

Generazione di organoidi epatici endodermici funzionali

Gli epatociti derivati da cellule staminali pluripotenti possono essere purificati attraverso la selezione cellulare, utilizzando una combinazione di colorazione con molecole di adesione alle cellule mitocondriali e leucocitarie attivate (ALCAM, nota anche come CD166).

Applicazione della colorazione dei mitocondri vivi nella selezione cellulare per purificare gli epatociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane

Scopri come differenziare cellule staminali pluripotenti indotte umane in epatociti-like per screening ad alto rendimento. Questo metodo consente di generare modelli personalizzati per la scoperta di farmaci contro le malattie epatiche.

Utilizzando umani indotti dell'epatocita-come di derivati da cellule staminali pluripotenti per scoperta della droga

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