Utilizzando umani indotti dell'epatocita-come di derivati da cellule staminali pluripotenti per scoperta della droga

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di differenziare le cellule staminali pluripotenti indotte umane in cellule simili agli epatociti in un modo che sia adatto per lo screening ad alto rendimento. Le cellule epatiche sono difficili da coltivare in laboratorio, tuttavia possono essere generate da cellule staminali pluripotenti indotte che forniscono una piattaforma di screening per identificare i trattamenti per le malattie del fegato. Il vantaggio principale di questa tecnica è che un numero illimitato di epatociti può essere generato da qualsiasi paziente con malattia del fegato che ricapitola la malattia in laboratorio.

La procedura è relativamente facile da stabilire, anche senza una vasta conoscenza della biologia delle cellule staminali. La sua riproducibilità consente ai ricercatori di esaminare migliaia di composti senza la necessità di una robotica complessa. Ray Liu, un borsista post-dottorato, e Paige Lamprecht, una studentessa laureata, dimostreranno oggi la procedura.

Innanzitutto, diluire la proteina di fusione Ecad a 15 microgrammi per millilitro con soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco, o DPBS, che contiene calcio e magnesio. Rivestire piastre di coltura tissutale in sospensione da 100 millimetri con cinque millilitri di matrice diluita e incubare a 37 gradi Celsius per almeno un'ora. Dopo l'incubazione, rimuovere il substrato e sostituirlo con cinque millilitri di terreno di coltura iPSC.

Recupera una fiala di cellule staminali pluripotenti indotte umane crioconservate da azoto liquido. Scongelare a 37 gradi Celsius fino a quando rimane un piccolo cristallo di ghiaccio. Quindi, pipettare delicatamente le cellule in una provetta conica sterile da 15 millilitri contenente quattro millilitri di terreno di coltura.

Centrifugare le celle a 300 g per cinque minuti. Rimuovere il surnatante e risospendere delicatamente le cellule con cinque millilitri di terreno integrati con dieci micromolari di Y-27632, un inibitore selettivo di una proteina chinasi associata a Rho, contenente bobine a spirale. Ora, rimuovere il terreno di coltura dalle piastre di coltura tissutale in sospensione da dieci millimetri rivestite di Ecad e aggiungere cinque millilitri di cellule.

Una volta che le iPSC raggiungono circa l'80% di confluenza, rimuovere il terreno di coltura e lavare una volta con DPBS privo di calcio e magnesio. Aspirare il DPBS e aggiungere una quantità sufficiente di soluzione EDTA allo 0,02% per coprire le stoviglie. Quindi, incubare le cellule per un massimo di tre minuti a temperatura ambiente.

Non appena le cellule iniziano a rilasciarsi, rimuovere la soluzione di EDTA allo 0,02% e inondare il piatto con dieci millilitri di terreno M per rilasciare le cellule. Facilitare il distacco delle iPSC mediante pipettaggio delicato. Trasferire 1/10 delle cellule sospese in una piastra di coltura tissutale rivestita in Ecad contenente cinque millilitri di terreno M.

Incubare le colture a 37 gradi Celsius sotto il 4% di ossigeno e il 5% di anidride carbonica, cambiando il terreno ogni giorno. Recuperare una fiala da 250 microlitri di brodo di matrice ghiacciata con concentrazione di due milligrammi per millilitro e scongelarla con ghiaccio. Successivamente, combinare la matrice scongelata con dieci millilitri di DMEM/F12 freddo mescolando delicatamente con una pipetta pre-raffreddata per ottenere una concentrazione finale di 0,05 milligrammi per millilitro.

Trasferire 100 microlitri della matrice diluita in ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale da 96 pozzetti. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius sotto il 4% di ossigeno e il 5% di anidride carbonica per almeno un'ora. Dopo l'incubazione, scartare la matrice e sostituirla con 50 microlitri di terreno M per pozzetto, ripetendo la stessa procedura di rivestimento con il resto delle piastre.

Ora, coltivate le iPSC su piastre da 100 millimetri fino a quando le cellule non si avvicinano all'80% di confluenza. Per raccogliere le iPSC da ogni piastra da 100 millimetri, aspirare il terreno di coltura e sciacquare con cinque millilitri di DPBS. Sostituire il risciacquo con tre millilitri di soluzione per il distacco cellulare, come l'Accutase.

Quindi, incubare per circa due minuti a 37 gradi Celsius sotto il 4% di ossigeno e il 5% di anidride carbonica. Non appena le cellule iniziano a staccarsi, raccogliere aggiungendo sette millilitri di terreno M. Pipettare più volte per dissociare le colonie cellulari in piccoli gruppi di circa tre-sei cellule.

Quindi, raccogliere le iPSC in una provetta da centrifuga sterile da 15 millilitri e centrifugare a 300 G per cinque minuti. Al termine, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet di cella in cinque millilitri di terreno M. Distribuire uniformemente le cellule su piastre rivestite con matrice a 96 pozzetti pipettando 50 microlitri di cellule in sospensione in ciascun pozzetto utilizzando una pipetta multicanale.

Quindi, coltivare le cellule durante la notte a 37 gradi Celsius sotto il 4% di ossigeno e il 5% di anidride carbonica e ripetere le procedure di semina cellulare con il resto delle piastre. Esaminare le piastre da 96 pozzetti al microscopio per assicurarsi che le cellule coprano almeno il 70% della superficie di ogni singolo pozzetto. Per il primo o il secondo giorno di differenziazione, sostituire il terreno di coltura con 100 microlitri di terreno di differenziazione basato su RPMI per pozzetto.

Quindi, incubare le cellule a 37 gradi Celsius in ossigeno ambiente e anidride carbonica al 5% per due giorni con un cambio giornaliero del mezzo. Dal terzo al quinto giorno di differenziazione, sostituire il terreno di coltura con 100 microlitri di terreno di differenziazione basato su RPMI integrato con il 2% di B27 e 100 nanogrammi per millilitro di NA attivo. Coltivare le cellule a 37 gradi Celsius in ossigeno ambiente e 5% di anidride carbonica per tre giorni con un cambio giornaliero del mezzo. Al quinto giorno di differenziazione, trattare ogni pozzetto con 100 microlitri di soluzione di EDTA allo 0,02% per 30 secondi e rimuovere immediatamente la soluzione.

Aggiungere 100 microlitri di terreno di differenziazione fresco a base di RPM e ripetere la stessa procedura per il resto delle piastre. Per la differenziazione tra il sesto e il decimo giorno, sostituire il terreno di coltura con 100 microlitri di terreno di differenziazione basato su RPMI. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius sotto il 4% di ossigeno e il 5% di anidride carbonica per cinque giorni con un cambio giornaliero del mezzo.

Per la differenziazione tra i giorni da 11 a 15, sostituire il terreno di coltura con 100 microlitri di terreno di differenziazione a base di RPMI, integrati con il 2% di B27 e 20 nanogrammi per millilitro di HGF. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius sotto il 4% di ossigeno e il 5% di anidride carbonica per cinque giorni con un cambio giornaliero del mezzo. Per la differenziazione tra i giorni 16 e 20, sostituire il terreno di coltura con un terreno di coltura cellulare di epatociti integrato con 20 nanogrammi per millilitro di oncostatina-M.

Incubare le cellule a 37 gradi Celsius in ossigeno ambiente e anidride carbonica al 5% per cinque giorni con un cambio giornaliero del mezzo. Al termine della differenziazione il giorno 20, sostituire il terreno di coltura con 100 microlitri di terreno di coltura cellulare di epatociti freschi integrati con 20 nanogrammi per millilitro di oncostatina-M. Dopo l'incubazione per 24 ore, recuperare il terreno di coltura in una nuova piastra a 96 pozzetti e conservare a 20 gradi Celsius.

Ripetere la stessa procedura di raccolta per il resto delle piastre. Aggiungere 90 microlitri di terreno di coltura cellulare di epatociti freschi integrato con oncostatina-M in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti. Aggiungere dieci microlitri di ciascun composto scelto da una soluzione di lavoro precedentemente preparata.

Aggiungere DMSO allo 0,2% ai pozzetti di controllo in modo che corrisponda alla concentrazione finale nei campioni trattati. Dopo l'incubazione per 24 ore, raccogliere il terreno di coltura in una piastra fresca a 96 pozzetti e conservare a 20 gradi Celsius. Ripetere la stessa procedura di raccolta per il resto delle piastre.

Dopo cinque giorni di trattamento, le cellule esprimono proteine che sono tipicamente espresse nell'Endoderma Definitivo. Dopo altri cinque giorni di differenziazione, l'endoderma si converte a un destino epatico e le cellule esprimono FOXA2 e HNF 4a. Dopo l'aggiunta di HGF, le cellule esprimono le proteine presenti negli epatociti fetali e, al termine del differenziamento, le cellule adottano una morfologia cuboidale con un nucleo contenente nucleoli prominenti e un grande citoplasma con più goccioline lipidiche.

L'immunocolorazione per rilevare HNF 4a e albumina al giorno 20 di differenziazione mostra che la distribuzione di queste proteine degli epatociti è simile in tutti i pozzetti. Le iPSC sono state utilizzate per lo screening dei composti che abbassano l'APOB per fornire un esempio di utilizzo di epatociti derivati da iPSC per lo screening di piccole molecole. Il fattore z del test APOB è 0,73, il che conferma l'idoneità dell'utilizzo della piattaforma per la scoperta di farmaci.

Per ciascun composto è stato determinato il rapporto post-farmaco e pre-farmaco di APOB. L'identificazione dei risultati è stata ottenuta mediante l'analisi z-score. Sono stati identificati 24 potenziali colpi con un rapporto APOB compreso tra 0,86 e 0,44.

Dopo aver escluso i composti che avevano un impatto negativo sulla vitalità cellulare, due composti sono risultati riproducibili per ridurre l'APOB. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 25 giorni se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di preparare un terreno fresco ogni giorno.

Una concentrazione errata dei componenti dovuta alla degradazione cambierà la capacità delle cellule di differenziarsi. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della scoperta di farmaci per esplorare il trattamento terapeutico per le malattie del fegato utilizzando cellule staminali pluripotenti indotte umane. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come coltivare e mantenere le cellule staminali pluripotenti indotte umane e di eseguire la differenziazione epatica in una piccola forma pressata in superficie per lo screening ad alto rendimento.

Non dimenticare che lavorare con cellule staminali pluripotenti indotte umane può essere estremamente pericoloso e i dispositivi di protezione individuale, come guanti e camice da laboratorio, devono essere sempre indossati durante l'esecuzione di questa procedura.