Raccolta e trattamento dei linfonodi da grandi animali per l'analisi del RNA: preparazione per gli studi di trascrittomica di linfonodo di grandi specie animali

Ciao, mi chiamo Dr.Robert Schaut e sono uno scienziato presso il National Animal Disease Center di Ames, Iowa. In questo video di JoVE, condivideremo con voi informazioni sulla raccolta e l'elaborazione di linfonodi da animali di grandi dimensioni per l'uso in esperimenti di RNA a valle. Ad esempio, questi esperimenti potrebbero includere la PCR quantitativa su prodotti trascritti inversamente o studi di sequenziamento dell'RNA dei trascrittomi.

I linfonodi sono campioni utili per la valutazione delle risposte immunitarie dell'ospite, ma possono anche fornire una fonte di RNA patogeno per lo studio, come nel caso dei patogeni intracellulari presenti nelle cellule immunitarie all'interno dei linfonodi. I campioni di animali di grossa taglia, tra cui sia il bestiame che le specie selvatiche, sono di interesse per lo studio delle malattie zoonotiche. Qui, al National Animal Disease Center, studiamo le infezioni del bestiame con specie come la brucella abortus, che causa la brucellosi nei bovini e nei bisonti, e l'E.Coli O157:H7 come fuoriuscita dalle tracce intestinali dei bovini.

Recupereremo anche campioni di tessuto da specie selvatiche, come cervi e alci. Una serie di linfonodi può essere raccolta da animali infetti da diverse malattie. Gli studi sui tessuti di queste specie ospiti naturali sono generalmente più rilevanti per la progressione naturale della malattia rispetto ai modelli murini.

Tuttavia, il processo di raccolta dei tessuti da specie di grandi dimensioni è necessariamente più complicato rispetto ai topi, compreso il ritardo più lungo tra l'eutanasia e la raccolta dei tessuti e una dimensione maggiore dei linfonodi. Qui, presenteremo un protocollo per l'isolamento di linfonodi di grandi animali per lo studio dell'RNA che sarà informativo per i biologi molecolari coinvolti negli studi trascrittomici delle infezioni di grandi animali, così come per i ricercatori veterinari che iniziano gli studi trascrittomici. In questo video, dimostreremo le procedure sui linfonodi per i bovini.

Prima dell'autopsia, si consiglia di assemblare i seguenti materiali specifici per la procedura di isolamento dei tessuti. Provette per microfugi riempite con circa 1 ml di conservante tissutale a base di RNA, come RNAlater, bisturi monouso, pinze pulite e per autoclave, aghi per biopsia, un contenitore per oggetti taglienti per bisturi e aghi usati e un tagliere o un vassoio monouso, a seconda del livello di infettività dei materiali coinvolti. In questo caso, dimostreremo gli elementi chiave della procedura utilizzando i linfonodi che generalmente raccogliamo dai bovini.

Sono infettati da batteri che causano la brucellosi. Questi sono i linfonodi prescapolari e il linfonodo parotide. Quando si conduce un'autopsia di un animale di grandi dimensioni per il recupero dell'RNA, è utile avere almeno tre partecipanti che lavorano sui tessuti animali.

Il primo dissettore si occuperà del sezionamento di diversi pezzi dell'animale, il secondo recupererà i linfonodi da diverse sezioni di animali sul tavolo principale dell'autopsia e il terzo lavorerà su un tavolo separato per isolare le sezioni da ciascun linfonodo e trasferirle in tubi con soluzione conservante. Inizieremo con l'identificazione e la rimozione del linfonodo prescapolare. Idealmente, la palpazione di un linfonodo, prima della dissezione, aiuterà a identificare la posizione del linfonodo.

Sebbene non sia sempre possibile da rilevare, il linfonodo prescapolare è tipicamente palpabile in un animale sano. Inizia mettendo l'animale in decubito laterale. Estendi la spalla spostando indietro l'arto anteriore all'altezza del ginocchio.

Questo movimento riporterà indietro la spalla e consentirà una facile palpazione del linfonodo. Sentire la presenza del linfonodo come mostrato. Una volta individuata, e con la spalla ancora estesa, utilizzare un bisturi o un coltello da necroscopia per praticare un'incisione cutanea lungo il contorno della spalla.

Ritrarre la pelle per rivelare il punto della muscolatura della spalla e del collo. A volte si osserva una sezione di grasso sottocutaneo, soprattutto negli animali sovracondizionati. Il linfonodo prescapolare si trova spesso con sezioni di grasso sottocutaneo.

Qui puoi vedere i tre strati della pelle, dei muscoli e del grasso sottocutaneo. Ancora una volta, palpare la posizione di un linfonodo. A differenza del grasso sottocutaneo, il linfonodo manterrà la sua forma quando viene palpato.

Dopo aver individuato il linfonodo prescapolare, sezionare con cura il grasso sottocutaneo e sezionare il linfonodo. L'aspetto di questi linfonodi nei bisonti, che abbiamo usato negli studi sulla brucellosi a causa della suscettibilità dei bisonti nell'area di Greater Yellowstone alla brucella, è simile. Qui, dimostriamo l'aspetto del linfonodo prescapolare, come sezionato dalla spalla destra di un bisonte americano.

Successivamente passeremo all'isolamento del linfonodo della parotide. Con l'animale in decubito laterale, localizzare l'articolazione temporo-mandibolare. Usando un bisturi o un coltello da necroscopia, praticare con cura un'incisione sulla pelle.

Inizia dorsalmente all'articolazione ed estendilo verticalmente lungo la linea della mascella. Sezionare la pelle per rivelare il tessuto sottocutaneo. La ghiandola salivare parotide sarà visibile, in primo luogo a causa delle sue grandi dimensioni, dell'aspetto superficiale lobulato e della colorazione rossa.

Usando una pinza e un bisturi, sposta la ghiandola salivare parotide da parte per trovare il linfonodo parotideo che si trova appena craniale e mediale rispetto alla ghiandola salivare. Quando si isola il linfonodo della parotide, è fondamentale separare il tessuto linfonodale dal tessuto della ghiandola salivare della parotide. I tipi di tessuto sembrano distinti, anche all'interno della sezione trasversale del tessuto.

Questo può essere osservato qui, con il linfonodo parotide a sinistra e la ghiandola salivare parotide a destra. Assicurati di esaminare attentamente il tessuto linfonodale della parotide per la consistenza prima di un'ulteriore elaborazione. In alcuni casi, può essere necessario asportare la ghiandola salivare parotide per localizzare il linfonodo parotideo.

Ecco un esempio di una ghiandola parotide asportata da un manzo, in cui il linfonodo era incorporato all'interno della ghiandola salivare e non visibile prima della rimozione della ghiandola. Ulteriori informazioni sull'identificazione dei linfonodi selezionati sono fornite nel manoscritto principale. Una volta raccolti i linfonodi, sei pronto per asportare le sezioni per la conservazione.

Usa un bisturi o un bisturi per necroscopia, rimuovi una sezione del linfonodo e fai un taglio sagittale per aprire il linfonodo. Esamina l'interno del linfonodo, specialmente in campioni di animali infetti, alla ricerca di asimmetrie, lesioni, differenze di colore, ecc. In questo linfonodo prescapolare bovino, molteplici caratteristiche sono visibili ad occhio nudo.

Questi includono i follicoli, che ospitano i linfociti B, e le unità corticali profonde, che ospitano le cellule T. Queste ragioni appaiono più scure dei seni midollari, che sono più chiari. Qui è raffigurato un altro esempio di linfonodo non infetto.

Questo linfonodo proviene da un bisonte più giovane. Si noti che i follicoli sono meno distinti in questo esempio. Al fine di sezionare i tessuti per la lavorazione, un'opzione è quella di raccogliere piccoli pezzi di tessuto da ciascun linfonodo con un bisturi per il successivo recupero dell'RNA.

Tuttavia, una delle principali sfide nel confrontare i profili di espressione tra i campioni è la grande dimensione dei linfonodi animali di grandi dimensioni, rispetto a un linfonodo di topo che può essere facilmente estratto intero per l'estrazione dell'RNA. Di conseguenza, piccole sezioni di tessuto non cattureranno uniformemente il profilo delle cellule attraverso un linfonodo. Invece di catturare le cellule attraverso il profilo di un linfonodo, asportare un cuneo a forma di torta dal linfonodo, tagliarlo in piccoli pezzi non più spessi di 5 mm e posizionarlo, con una pinza, in tubi contenenti RNAlater.

In alternativa, utilizzare metodologie di biopsia per asportare sezioni di tessuto da ciascun linfonodo. Selezionare lo strumento per la biopsia del punzone se si desidera prelevare sezioni specifiche, come follicoli specifici dal nodo, e quindi trasferire, con una pinza, a RNAlater. Una volta che i campioni sono stati trasferiti a RNAlater, trasferirli nuovamente in laboratorio e conservarli a 4 gradi Celsius durante la notte per consentire la penetrazione nei tessuti.

Successivamente, eliminare l'RNAlater in eccesso e conservare i campioni di tessuto a 80 gradi Celsius. Un vantaggio dell'utilizzo della soluzione conservante di RNA è che l'azoto liquido non è richiesto durante l'autopsia, né al momento della raccolta di campioni dal campo. Prima di accedere ai campioni, pre-aliquotare il reagente Trizol nelle provette per l'omogeneizzazione.

Dopo aver tolto i campioni dal congelatore, trasferirli immediatamente nel reagente Trizol per la successiva elaborazione, in base alle raccomandazioni del produttore. Qui, un pezzo di 50-100 mg di tessuto viene trasferito al reagente Trizol. Limitare il più possibile lo scongelamento prima dell'aggiunta di Trizol.

La conservazione su ghiaccio secco può essere utilizzata quando più campioni vengono rimossi dal congelatore per la lavorazione. Posizionare le provette sull'omogeneizzatore e omogeneizzare nel reagente Trizol. In questo caso, viene utilizzata un'impostazione di estrazione dell'RNA di due minuti.

Al termine, verificare la presenza di un aspetto torbido. Ripetere se necessario. Seguire il protocollo del produttore per generare strati acquosi e organici per ogni campione.

Rimuovere la fase acquosa limpida superiore con un puntale per pipetta. Trasferire in una nuova provetta per microcentrifuga. Quindi, mescolare con un volume uguale di etanolo al 100%.

Mescolare accuratamente. Il tubo apparirà spesso torbido. Con un puntale per micropipette, trasferire il liquido in una colonna di centrifuga commerciale a base di silice per purificare ulteriormente e quindi eluire l'RNA.

Per valutare la qualità dell'RNA, caricare uno o due l del campione di RNA eluito su uno spettrofotometro per l'analisi. Dopo il completamento della procedura, osserviamo rapporti di assorbanza di circa due per il rapporto 260-280 e il rapporto 260-230, indicando un'elevata purezza con un minimo carryover chimico. La contaminazione da fenolo sarebbe osservabile da una diminuzione del rapporto di assorbanza di 260-230 nm.

Durante la procedura di necroscopia nel caso di animali come il bisonte, abbiamo osservato un periodo di tempo di almeno 20 minuti tra l'eutanasia e il trasferimento del primo campione di tessuto al conservante. Al contrario, i linfonodi di topo possono essere rimossi e conservati dopo l'eutanasia in pochi minuti. Pertanto eravamo interessati a caratterizzare il profilo di degradazione dei linfonodi nel tempo.

Nel manoscritto principale abbiamo anche compilato un riassunto dei profili di stabilità dell'RNA in una serie di altri tipi di tessuto che sono stati testati in altre pubblicazioni. In esperimenti rappresentativi, condotti con linfonodi di bisonte, la stabilità dell'RNA è stata relativamente costante nel corso di un'ora dopo l'eutanasia. Qui, rappresentiamo un'immagine su gel di RNA totale purificato da pezzi di tessuto linfonodale sopramammario di un bisonte americano.

Questo risultato è coerente con i dati precedenti per altri tipi di tessuto compilati dalla letteratura. Ciò suggerisce che i campioni di qualità accettabile per l'analisi a valle dell'espressione genica possono essere raccolti anche da specie più difficili come il bisonte e l'alce. Tuttavia, è importante comprendere che tempi più lunghi tra la morte e la conservazione del campione possono comportare cambiamenti nei profili di espressione dell'RNA, incluso un aumento della degradazione da tre estremità prime dei trascritti di mRNA.

Pertanto, è ancora importante utilizzare un flusso di lavoro rapido e semplificato per il recupero dei tessuti, al fine di ridurre ulteriormente il ritardo una volta che l'animale è disponibile per l'autopsia, al fine di ottenere i profili di RNA biologicamente più validi. Inoltre, notiamo che è necessario prestare attenzione durante tutta la procedura per evitare l'introduzione di contaminanti RNA nei campioni durante tutto il processo, oltre a quelli già presenti all'interno dei tessuti. Ciò include l'uso di guanti come parte degli altri dispositivi di protezione individuale richiesti.

Aliquotiamo anche il prodotto finale dell'RNA in più provette per limitare il più possibile lo stallo libero dei campioni di RNA. Ad esempio, è possibile memorizzare aliquote separate per l'uso nei test di controllo qualità. In sintesi, in questo video abbiamo fornito informazioni importanti per l'uso nell'identificazione, nella raccolta, nel campionamento rappresentativo e nell'elaborazione dei linfonodi per l'analisi dell'espressione genica a valle.

Mentre il nostro video rappresentativo è stato dimostrato con esempi di bovini e bisonti, abbiamo anche lavorato con linfonodi di altre specie di grandi dimensioni, tra cui capre e alci. Ci auguriamo che questo video ti sia utile nel tuo lavoro, sia che tu sia uno scienziato veterinario che sta valutando l'uso di metodi trascrittomici nel suo lavoro, sia che tu sia un biologo molecolare interessato ad avventurarsi nel campo della scienza dei grandi animali.