Inclusione in paraffina e sezionamento sottile di biofilm di colonie microbiche per l'analisi al microscopio

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di generare sezioni di biofilm incluse in paraffina che possono essere utilizzate per valutare la distribuzione dell'espressione genica riportata dalla produzione di proteine fluorescenti all'interno di morfologie native intatte. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nello studio delle comunità microbiche, come l'espressione di geni specifici nella produzione di sostanze esopolimeriche distribuite nel contesto dell'architettura del biofilm nativo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'analisi dell'espressione genica all'interno della morfologia conservata delle sezioni trasversali del biofilm, pur essendo suscettibile di trattamenti a valle come la colorazione di caratteristiche distinte e l'imaging ad alta risoluzione come la microscopia confocale o elettronica.

Dopo aver preparato la soluzione di agar triptone secondo il protocollo di testo, utilizzare un tubo conico da 50 millilitri per versare 45 millilitri di soluzione in un piatto quadrato di 100 millimetri per 100 millimetri. Lasciare solidificare l'agar per circa 20-30 minuti. Versare un secondo strato di 15 millimetri sopra il primo strato, quindi lasciarlo solidificare per una notte e, se necessario, utilizzare un fazzoletto privo di lanugine per rimuovere la condensa dai coperchi.

Successivamente, per individuare i biofilm delle colonie, dopo aver coltivato una singola colonia isolata di P.Aeruginosa da un ceppo congelato secondo il protocollo di testo, pipettare da 2,5 a 10 microlitri di sospensione cellulare su una piastra media a doppio strato. Le colonie possono essere incubate al buio a 25 gradi Celsius con un'umidità relativa compresa tra l'80 e il 100% per un massimo di quattro giorni. Versare delicatamente 15 millilitri di soluzione di agar sul terreno di coltura e sulla colonia e lasciare che l'agar formi un gel a temperatura ambiente per cinque minuti.

Quindi, usa una lama di rasoio affilata per tagliare un mandrino quadrato a tre strati con la colonia laminata tra i due strati superiori. Se si preparano più campioni, assicurarsi che ogni mandrino sia tagliato a una dimensione comparabile. Rimuovere delicatamente l'agar in eccesso dalla colonia contenente il mandrino.

Quindi, bagnare la testa piatta di una spatola in PBS o acqua e inserirla delicatamente tra gli strati superiore e inferiore di agar. Trasferire immediatamente la colonia laminata in una cassetta di inclusione etichettata con un pennarello resistente agli agenti chimici. Posizionare la cassetta di inclusione in un vetrino contenente il fissativo precedentemente preparato.

Elaborare i campioni. Usa 1X PBS per lavarli due volte per un'ora ciascuno. Per ottenere i migliori risultati, automatizzare l'omogeneizzazione dei reagenti utilizzando l'impostazione bassa della funzione di centrifuga di un processatore automatico di tessuti.

Per incorporare i campioni, riempire uno stampo in cera con cera di paraffina fusa riscaldata a 55 gradi Celsius, quindi utilizzare una spatola piatta riscaldata per trasferire rapidamente il mandrino infiltrato dalla cassetta di inclusione nello stampo in cera, assicurandosi che il mandrino poggi parallelamente alla base dello stampo. Lasciare solidificare la cera per una notte a quattro gradi Celsius. I campioni stampati in cera solida possono essere conservati a tempo indeterminato a questa temperatura.

Una volta che la cera si è solidificata, asportare il campione dallo stampo e utilizzare una lama di rasoio per tagliare la cera in eccesso intorno al campione. Lasciare un po' di cera che si estende da un'estremità del campione che può essere utilizzata per fissarlo nel microtomo. È importante tagliare il campione incorporato in cera in modo tale che la sua forma faciliti la raccolta di nastri lineari lisci.

Piccole imperfezioni nella rifilatura possono produrre artefatti nel nastro e compromettere l'integrità della sezione. Quindi, riscalda un bagnomaria a 42 gradi Celsius. Quindi, bloccare il campione nel microtomo con la superficie della colonia orientata perpendicolarmente al bordo della lama.

Tagliare il campione a intervalli di 50 micrometri fino a raggiungere il piano desiderato della colonia, da cui verranno raccolte le sezioni, utilizzando un microtomo impostato su una velocità di sezionamento compresa tra 75 e 80 giri/min e un angolo di spoglia compreso tra 6 e 10 gradi. Taglia un nastro del numero desiderato di sezioni spesse 10 micrometri. Quindi, usa un pennello a punta fine per staccare il nastro dalla lama.

Ora, con una pinza o una goccia d'acqua sulla punta di una pipetta Pasteur, trasferisci delicatamente il nastro a bagnomaria. Inserire immediatamente un vetrino nel bagnomaria e posizionarlo sotto il nastro con un angolo di 45 gradi. Toccare il bordo stretto del nastro con la diapositiva appena sotto l'etichetta smerigliata.

Il nastro dovrebbe aderire. Estrarre lo scivolo dal bagnomaria e regolare l'angolo in modo che sia perpendicolare alla superficie dell'acqua, consentendo al nastro di appoggiarsi piatto contro lo scivolo per tutta la sua lunghezza. Evitare di intrappolare l'acqua in eccesso sotto il nastro.

Appoggiare delicatamente il vetrino su un tessuto assorbente privo di lanugine che assorbe l'acqua in eccesso dalla sezione. Quindi, stendere il vetrino su un tovagliolo di carta e lasciarlo asciugare al buio a temperatura ambiente per una notte. Riscaldare una piastra riscaldante livellata a 45 gradi Celsius e posizionare il vetrino sulla piastra per 30-60 minuti.

La cera diventerà semifusa e si appiattirà contro il vetrino. Sollevare delicatamente il vetrino dalla piastra riscaldante e appoggiarlo su una superficie liscia e piana a temperatura ambiente per circa un minuto fino a quando la cera non si solidifica. Assicurarsi che la cera fusa non tiri su entrambi i lati del vetrino.

Con i campioni all'interno di una busta di vetro, decerare i vetrini in quattro lavaggi di agente schiarente per cinque minuti ciascuno. Utilizzare un aspiratore Buchner per rimuovere la soluzione tra un lavaggio e l'altro. Utilizzare etanolo al 100% per lavare i vetrini tre volte per un minuto ciascuno.

Quindi, dopo aver reidratato i vetrini secondo il protocollo di testo, montare immediatamente le sezioni in un mezzo di montaggio tris-bufferizzato e applicare un vetrino coprioggetti. L'agar di riporto attorno alla sezione non reagisce con il fissativo, quindi non aderisce al vetrino della bietola. Questo agar può staccarsi durante la reidratazione e danneggiare la sezione, quindi è necessario prestare attenzione a non agitare la soluzione durante la reidratazione.

Lasciare che il mezzo di montaggio polimerizzi a temperatura ambiente per una notte. Una volta polimerizzato, utilizzare uno smalto trasparente per sigillare il vetrino coprioggetti al vetrino. Infine, conservare i vetrini sigillati a tempo indeterminato al buio a quattro gradi Celsius.

Mentre l'imaging DIC con un obiettivo a immersione in olio 40 volte può essere sufficiente per mostrare alcune caratteristiche morfologiche delle sezioni sottili del biofilm, la microscopia a fluorescenza di ceppi ingegnerizzati per esprimere costitutivamente proteine fluorescenti fornisce una migliore visualizzazione della distribuzione cellulare all'interno dei campioni. Come mostrato in questi pannelli, le immagini delle singole sezioni possono essere cucite insieme per generare una sezione trasversale dell'intera colonia e fornire un contesto per la localizzazione delle caratteristiche strutturali all'interno della morfologia complessiva a livello macroscopico. L'utilizzo di un ceppo ingegnerizzato per esprimere una proteina fluorescente sotto il controllo di un promotore specifico consente la visualizzazione della distribuzione dell'espressione genica.

Inoltre, le colonie possono essere coltivate su terreni contenenti coloranti, oppure i coloranti possono essere aggiunti dopo la sezionamento ai polisaccaridi specifici dei coloranti. Infine, i campioni possono anche essere preparati e riprodotti a una risoluzione più elevata utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione, come presentato qui. Quando si tenta questa procedura, è importante prestare attenzione alla variabilità dei campioni e al potenziale di introdurre artefatti fluorescenti e strutturali attraverso la fissazione, il sezionamento o la reidratazione che possono influenzare l'interpretazione dei dati.

Questa procedura consente un'analisi quantitativa dell'immagine, come la correlazione dei profili di espressione dei reporter fluorescenti con le caratteristiche morfologiche e l'asse Z di un biofilm. Questo protocollo può essere applicato a diverse specie di microbi che formano biofilm con significato medico e industriale come Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae e Bacillus subtilis. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come coltivare e preparare i biofilm delle colonie per il sezionamento tramite inclusione di paraffina.