Name: Un sistema di Microbiomechanical per lo studio della formazione del Varicosity e del recupero in centrale del neurone assoni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Scopri un sistema fluido pressurizzato per indurre varicosità reversibili in neuroni ippocampali coltivati. Questo metodo consente di studiare la plasticità neuronale indotta da stress meccanico e di identificare nuove strategie terapeutiche per lesioni cerebrali traumatiche.

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Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con gli istituti nazionali di salute animale uso orientamenti. Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalle concessioni dal National Institutes of Health (R01NS093073 e R21AA024873) a C. Gu.

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

La procedura di questo test di microbiomechanical è dritto in avanti. Esso produrrà risultati affidabili, se tutti i suoi passaggi sono eseguiti con attenzione. Ci sono diversi passaggi chiave che, se correttamente eseguita, ostacolerà la raccolta dei dati di successo. I passaggi critici cominciano a monte dell'effettiva applicazione dello stimolo puffing. La dissezione attenta, coltura e cura della cultura primaria del neurone sono di primaria importanza. Se i neuroni coltivati non sono sani, non reagiranno in modo coer...

Formazione del varicosity, o gonfiore/bordatura, lungo gli assoni, è una caratteristica prominente di neurodegenerazione osservata in molti disturbi o lesioni del sistema nervoso centrale, tra cui la sclerosi multipla, morbo di Alzheimer, morbo di Parkinson e traumatica brain injury1,2. Nonostante gli impatti fisiologici significativi dei varicosities axonal sulla propagazione del potenziale d'azione e trasmissione sinaptica3, come vengono generati i varicosities rimane sconosciuto. Recentemente, usando un'analisi di nuova costituzione microbiomechanical su colture di neuroni ippocampali da roditori, abbiamo trovato che stimoli meccanici possono indurre varicosità in questi neuroni con altamente interessanti caratteristiche. In primo luogo, l'induzione del varicosity è rapida (< 10 s) e questo processo è reversibile in modo imprevisto. In secondo luogo, l'inizio del varicosity dipende dalla forza sbuffando pressione: maggiore è la pressione, più veloce all'avvio. In terzo luogo, l'inizio del varicosity dipende dall'età neuronale. Gli assoni dei neuroni più giovani appaiono più reattivi alle sollecitazioni meccaniche, rispetto a quelle dei neuroni più anziani. In quarto luogo, il modulo di varicosità lungo gli assoni dei neuroni ippocampali, mentre i segmenti di assone iniziale di questi neuroni e dendriti non visualizzare nessun cambiamento nella stessa circostanza puffing. Così, il nostro studio ha rivelato una caratteristica novella di polarità di un neurone. Questi risultati con il sistema in vitro sono fisiologicamente rilevanti. Utilizzando un modello in vivo per trauma cranico lieve (mTBI), abbiamo mostrato che varicosities axonal sviluppato in modo multi-focale nella corteccia somatosensoriale dei topi immediatamente dopo l'impatto di Chiudi-cranio, coerenza con il nostro in vitro Risultati4. È importante notare che la nostra colorazione e imaging dei topi mTBI forniscono solo un'istantanea di un neurone cambiamenti morfologici, da eseguire in vivo imaging time-lapse della morfologia neuronale durante un impatto meccanico è ancora non è fattibile.
Questo sistema fluido-sbuffando ci ha permesso non solo di catturare caratteristiche uniche associate alla formazione di varici indotta da stress meccanico, ma anche per determinare il meccanismo di fondo. Provando diverse soluzioni extracellulare, bloccanti e apribottiglie di diversi candidati di canali ionici mechanosensitive ed elettrofisiologia cellulare, abbiamo identificato che il catione potenziale transitorio del ricevitore canale membro subfamily V 4 (TRPV4) canale che è permeabile per Ca2 + e Na+ e attivato da sbuffando è principalmente responsabile per la rilevazione iniziale stress meccanico durante la formazione di varici axonal4. Questo è stato ulteriormente confermato con un approccio di knockout di siRNA. Presi insieme, questo nuovo sistema di dosaggio che abbiamo sviluppato con la cultura di Neurone ippocampale, è altamente utile per studiare le proprietà di micromeccanica dei neuroni centrali, specialmente in combinazione con altre tecniche.
Questo sistema di micromeccanica che abbiamo stabilito è unico e si differenzia dai sistemi già esistenti in diversi aspetti importanti. In primo luogo, in questo sistema, i neuroni esperienza fuori del piano sollecitazioni meccaniche nelle forme di compressione e taglio. Durante l'impatto meccanico, processi neuronali rimangono attaccati alla superficie del vetrino coprioggetto e non si muovono. Questo è diverso da altri sistemi che si occupa principalmente di flessione e stretching in piano sperimentale (o tensione), per esempio, la deflessione degli assoni in bundle come stringhe5,6 in movimento o stretching assoni coltivati su bioerodibili canali e membrane estensibile7,8. Inoltre, sebbene varicosities axonal possono anche essere indotti questi saggi come nel nostro sistema fluido-sbuffando, il processo in queste impostazioni richiede molto più tempo (da 10 minuti a parecchie ore6,7,8) e viene visualizzato irreversibile. Infine, il nostro sistema utilizzando sbuffando fluido locale consente l'esame delle caratteristiche spaziali della formazione del varicosity (ad es., dendriti, spine dendritiche, soma, axonal segmenti iniziali e terminali axonal), oltre alle sue caratteristiche temporali. Utilizzando questo sistema, abbiamo scoperto diverse caratteristiche inaspettate e unici di formazione del varicosity assonale, particolarmente rapida insorgenza, lenta reversibilità e polarità di assone-dendrite.
Il sistema che discutiamo in questa carta è compatibile con molte tecniche di molecolare e biologia cellulare. Per esempio, per studiare gli effetti dello stress meccanico sulla morfologia neuronale e funzione, può essere utilizzato insieme a coculture di mielina, time-lapse di imaging di fluorescenza di riflessione interna totale (TIRF) e di trasferimento di energia di risonanza fluorescente (FRET) formazione immagine del calcio e registrazione di patch clamp. In questa carta, ci concentriamo sui componenti di base del sistema. Cultura di neuroni ippocampali, il fluido-sbuffando installazione, imaging ad alta risoluzione time-lapse per trasporto assonale e calcio imaging sono illustrate passo passo qui di seguito.

<table><tbody><tr><td>Vetrini coprioggetti da 12 mm&nbsp;</td><td>Strumenti Warner&nbsp;</td><td>64-0702</td><td>per piastra a 24 pozzetti&nbsp;</td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti da 25 mm&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>12-545-102&nbsp;</td><td>per piastra a 6 pozzetti&nbsp;</td></tr><tr><td>Acido acetico</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lisina</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Collagene coda di ratto&nbsp;</td><td>Roche&nbsp;</td><td>11 179 179 001&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>10X PBS&nbsp;</td><td>Diagnostica nazionale&nbsp;</td><td>CL-253</td><td></td></tr><tr><td>Na2SO4</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>S373-500</td><td></td></tr><tr><td>K2SO4</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>P304-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP410-500</td><td></td></tr><tr><td>D-glucosio&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>Enzima proteasi</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P4032</td><td></td></tr><tr><td></td><td>FBS Gibco&nbsp;</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>25030081</tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina 100x (P/S)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>15140122</tr><tr><td>MEM I sali di Earle</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>11090</td><td></td></tr><tr><td>Supplemento B27</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasale</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Arabinosilcitosina (Ara-C)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>147-94-4</td><td></td></tr><tr><td>Supporti Opti-MEM&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>1854313</td><td>reagente di trasfezione&nbsp;</td></tr><tr><td>Barre in borosilicato&nbsp;</td><td>World Precision Instruments Inc.</td><td>PG52151-4</td><td>per pipetta a soffio&nbsp;</td></tr><tr><td>tubi di gomma&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>14-169-1A</td><td></td></tr><tr><td>Siringa e stantuffo in plastica da 10 cc</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>micromanipolatore&nbsp;</td><td>Strumenti Sutter&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>S640-3</td><td></td></tr><tr><td>KCl&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>C70-500</td><td></td></tr><tr><td>Piatto per colture cellulari (35 mm x 10 mm)</td><td>Corning&nbsp;</td><td>3294</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Sonde molecolari</td><td>F14201</td><td>per imaging del calcio&nbsp;</td></tr><tr><td>Costrutto Mito-YFP&nbsp;</td><td>Takara Bio Inc.</td><td></td><td>per trasfezione cellulare&nbsp;</td></tr><tr><td>Costrutto YFP-N1</td><td>Takara Bio Inc.</td><td></td><td>per trasfezione cellulare&nbsp;</td></tr><tr><td>Modello P-1000 Estrattore per micropipette fiammeggiante/marrone&nbsp;</td><td>Strumenti Sutter&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mcroscopio Eclipse TE2000-U&nbsp;</td><td>Obiettivo Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan Fluor ELWD 20x&nbsp; &nbsp;</td><td>Nikon</td><td>062933</td><td>obiettivo&nbsp;</td></tr><tr><td>Lente ad olio Apo TIRF 100x/1.49</td><td>Nikon</td><td>MRD01991</td><td>obiettivo&nbsp;</td></tr></tbody></table>

un sistema di microbiomechanical per lo studio della formazione del varicosity e del recupero in centrale del neurone assoni

A Microbiomechanical System for Studying Varicosity Formation and Recovery in Central Neuron Axons

Varicosities axonal sono allargate strutture lungo i fasci di assoni con un elevato grado di eterogeneità. Sono presenti non solo nei cervelli con malattie neurodegenerative o lesioni, ma anche nel cervello normale. Qui, descriviamo un sistema di nuova costituzione micromeccanici per in modo rapido, affidabile ed reversibilmente indurre varicosities axonal, permettendoci di comprendere i meccanismi che regolano la formazione del varicosity e la proteina eterogenea composizione. Questo sistema rappresenta un mezzo romanzo per valutare gli effetti dello sforzo di compressione e taglio su diversi compartimenti cellulari dei neuroni, diversi da altri sistemi in vitro che si concentrano principalmente sull'effetto di stretching. Cosa importante, a causa delle caratteristiche uniche del nostro sistema, abbiamo recentemente effettuato una scoperta di nuovi risultati che l'applicazione del fluido pressurizzato può indurre rapidamente e reversibilmente varicosities axonal attraverso l'attivazione di un canale potenziale transitorio del ricevitore. Il nostro sistema biomeccanico può essere utilizzato comodamente in combinazione con aspersione di droga, live cell imaging, imaging del calcio e registrazione di patch clamp. Pertanto, questo metodo può essere adottato per lo studio di canali ionici meccanosensibili, regolamento di trasporto assonale, dinamica del citoscheletro assonale, segnalazione calcio e cambiamenti morfologici correlati a traumatico cranico.

Prima sbuffando, assoni normalmente mostrano poca formazione di varici. Seguente sbuffando con la nostra pressione standard (190 mmH2O altezza), l'inizio di assoni di sviluppare molti tallone-come varicosità. La formazione di varicosità è parzialmente reversibile, come mostrato dalle regioni dell'assone tornando al loro stato pre-soffiato in seguito a un periodo di recupero di 10 min (Figura 2A-B). Dopo un periodo di recupero più l...

Questo protocollo descrive un approccio fluido pressurizzato, fisiologicamente rilevante per induzione rapida e reversibile di varicosità in neuroni.

Un sistema di Microbiomechanical per lo studio della formazione del Varicosity e del recupero in centrale del neurone assoni

Axonal varicosities are enlarged structures along the shafts of axons with a high degree of heterogeneity. They are present not only in brains with ...

L'obiettivo generale di questa configurazione di fluido pressurizzato è quello di produrre rigonfiamenti ripetibili e coerenti lungo gli assoni dei neuroni in coltura. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle lesioni cerebrali, come i meccanismi alla base dei cambiamenti morfologici subcellulari nei neuroni dopo una lesione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il metodo produce cambiamenti morfologici coerenti e ripetibili che si riprendono nel tempo.Questa è una tecnica molto importante che abbiamo sviluppato in laboratorio. Questo perché non solo possiamo utilizzare il sistema per identificare il meccanismo molecolare che governa il cambiamento della morfologia degli assoni indotto dallo stress meccanico come una nuova forma di plasticità neuronale, ma anche utilizzare il sistema come strumento di screening per identificare nuovi farmaci e la strategia di trattamento per lesioni cerebrali lievi o traumatiche. Per iniziare questa procedura, posizionare una o più scatole di vetrini coprioggetti da 12 millimetri o 25 millimetri in un becher di vetro contenente il 70% di acido nitrico e incubare i vetrini coprioggetti a temperatura ambiente per una notte.Il giorno successivo, trasferisci tutti i vetrini coprioggetti in un becher da quattro litri riempito con 2,5 litri di acqua bidistillata. Agitare il becher contenente i vetrini coprioggetti per un'ora a 100 giri/min e non dimenticare di utilizzare degli elastici per tenere il becher durante l'agitazione. Successivamente, trasferire i vetrini coprioggetti puliti in un pallone asciutto con il coperchio metallico.Cuocete i vetrini in forno a 225 gradi Celsius per sei ore. Quindi, lasciali raffreddare a temperatura ambiente e conservali in un contenitore di plastica sterilizzato fino al momento dell'uso. Ora, posizionare un vetrino coprioggetti in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti.Aggiungere 30 microlitri di soluzione di rivestimento per vetrini coprioggetti su un vetrino coprioggetti da 12 millimetri e agitare. Successivamente, aggiungi un millilitro di PBS sterile a ciascun pozzetto. La piastra può essere utilizzata immediatamente o conservata a quattro gradi Celsius in PBS sterile per un massimo di una settimana.Il giorno della dissezione, rimuovere il PBS dalla piastra. Asciugare all'aria e posizionare la piastra sotto la luce UV per due o quattro ore. Per dissociare i neuroni dell'ippocampo per la coltura, scongelare la soluzione dell'enzima proteasi e preriscaldare il mezzo di placcatura a 37 gradi Celsius.Quindi, sciacquare l'ippocampo sezionato con SLDS. Quindi, rimuoverlo e aggiungere due millilitri di soluzione di enzima proteasi e incubare il campione a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Successivamente, lavare due volte gli espianti di ippocampo con da cinque a 10 millilitri di terreno di placcatura e aggiungere cinque millilitri di terreno di placcatura.Dissociare gli espianti ippocampali in singole cellule generando un piccolo vortice utilizzando una pipetta con punta di plastica da un millilitro. Pipettare su e giù circa 40 volte evitando la formazione di bolle di ossigeno fino a quando la soluzione diventa torbida e non rimangono grossi pezzi di espianto. Quindi, centrifugare le celle a 1, 125 volte la gravità per tre minuti.Rimuovere il surnatante con le celle immerse nel terreno e risospendere le cellule in 145 millilitri di terreno di placcatura. Quindi, aggiungere un millilitro di sospensione cellulare per pozzetto a una piastra a 24 pozzetti. Incubare le cellule nel mezzo di placcatura a 37 gradi Celsius per due o quattro ore.Successivamente, rimuovere il mezzo di placcatura e sostituirlo con un nuovo mezzo di manutenzione. Dopo due giorni, sostituire metà del terreno con due micromolari di RSC disciolti nel terreno di mantenimento per inibire la crescita dei fibroblasti, delle cellule endoteliali e gliali. Quindi, dopo aver esposto le cellule all'RSC per due giorni, sostituire il terreno con un nuovo terreno di mantenimento.Per la trasfettazione per la visualizzazione della morfologia cellulare, diluire il costrutto da stock a un microgrammo per microlitro in terreno Opti-MEM e vortex. Quindi, diluire il reagente di trasfezione mediato da liposomi in terreno Opti-MEM e vortex. Successivamente, preparare una diluizione di costruzione e una diluizione di trasfezione per ciascun pozzetto.Quindi, preparare una miscela uno-a-uno del costrutto e del mezzo Opti-MEM e del reagente di trasfezione e del terreno e del vortice Opti-MEM. Incubare la miscela a temperatura ambiente per 20 minuti. Dopo 20 minuti, rimuovere metà del terreno da ciascun pozzetto e trasferirlo in un tubo conico pulito.Conservare la provetta nell'incubatrice, quindi aggiungere 100 microlitri della miscela preparata nel passaggio precedente al terreno rimanente nel pozzetto. Lasciare incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 20-30 minuti. Durante l'incubazione, aggiungere un volume di terreno di mantenimento fresco al terreno nel tubo conico e posizionare la miscela nella stessa incubatrice.Dopo l'incubazione, rimuovere i terreni contenenti la soluzione di trasfezione dai pozzetti e sostituirli con la miscela uno a uno di terreno di manutenzione vecchio e fresco nella provetta conica. In questa procedura, inserire la pipetta nella parte superiore della vite del micromanipolatore per tenerla in posizione. Avvitare la vite metallica a sommità piatta fissata al braccio del micromanipolatore in modo che tenga l'estremità non tirata della pipetta appena sopra il punto in cui è fissato il tubo di gomma.Inclinare la pipetta di 45 gradi con la superficie del neurone contenente i vetrini. Attiva il filtro di florescenza. Apri l'apertura e assicurati che un punto fluorescente possa essere visto attraverso l'obiettivo.Utilizzando il micromanipolatore, spostare la pipetta in una posizione che allinei la punta con il punto fluorescente e abbassare la pipetta in una posizione appena sopra l'altezza della capsula per colture cellulari. Una volta in posizione, accendere la luce trasmessa e spegnere la fioritura. Usando una pinzetta, trasferire un vetrino coprioggetti con le cellule rivolte verso la pipetta dalla piastra di coltura cellulare alla piastra di coltura cellulare contenente 2 millilitri di tampone di Hank a temperatura ambiente.Utilizzando la manopola di messa a fuoco fine e l'obiettivo a 20 pieghe, mettere a fuoco su un piano di circa quattro giri completi sopra le celle. Successivamente, utilizzare il micromanipolatore per posizionare la punta della pipetta in modo che sia focalizzata e al centro sul lato sinistro del piano come visto attraverso gli oculari. Una volta che la pipetta è in posizione, mettere a fuoco il microscopio su un piano che contenga la regione di interesse.Nell'imaging di sette div, i neuroni ippocampali di topo trasfettati con GFP hanno mostrato un assone prima e dopo lo sbuffo, nonché un successivo periodo di recupero di 10 minuti. Ecco il chimografo dell'imaging time-lapse dello stesso neurone. Le frecce rosse indicano le varicosità che si sono formate dopo 150 secondi di sbuffo di H2O da 190 millilitri, a partire da 30 secondi.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre ore se eseguita correttamente. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la registrazione di intere cellule, l'imaging FRET e TIRF time-lapse e l'imaging del calcio per rispondere a ulteriori domande come l'impatto dello stress meccanico sulla segnalazione neurale ed elettrica e del calcio, il traffico proteico e le interazioni. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle lesioni cerebrali fototraumatiche per spiegare i meccanismi molecolari alla base della formazione di varici assonali nei neuroni viventi.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire gli esperimenti per studiare le meccanosensazioni dei neuroni centrali.

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Qui vi presentiamo un protocollo che si basa su fette midollo spinale coltivate su array multi-elettrodo per studiare la rigenerazione funzionale delle connessioni propriospinali in vitro.

Indagare rigenerazione funzionale in organotipiche midollo spinale Co-culture Grown in array multi-elettrodo

Questo manoscritto specifica la realizzazione di reti neurali rivelate micro-tessuto: costruzioni tridimensionali di dimensioni microniche costituite da tratti longitudinali allineati allineati che comprendono la popolazione neuronale aggregata racchiuse in un idrogel tubolare. Questi impalcature viventi possono servire come relè funzionali per ricostruire o modulare la circuiteria neurale o come test-letti biofidelici che imitano la neuroanatomia della materia grigio-bianca.

Le reti neurali ricalcolate anatomicamente tridimensionali dei micro-tessuti per la ricostruzione, la modulazione e la modellazione del sistema nervoso

Il trasporto assonale è un meccanismo cruciale per la salute dei motoneuroni. In questo protocollo forniamo un metodo dettagliato per tracciare il trasporto assonale di compartimenti acidi e mitocondri negli assoni dei motoneuroni utilizzando camere microfluidiche.

Trasporto assonale di Organanelle nelle colture del motoneurone utilizzando il sistema di camere microfluidiche

Questo protocollo descrive un sistema microfluidico che modella le dinamiche metaboliche neuronali post-danno assonale, consentendo l'imaging, l'analisi multi-omica e gli studi meccanicistici del rimodellamento metabolico intrinseco.

Chip microfluidico per la costruzione di modelli di lesioni assonali e l'abilitazione dell'analisi multi-omica

Scopri un sistema fluido pressurizzato per indurre varicosità reversibili in neuroni ippocampali coltivati. Questo metodo consente di studiare la plasticità neuronale indotta da stress meccanico e di identificare nuove strategie terapeutiche per lesioni cerebrali traumatiche.

Un sistema di Microbiomechanical per lo studio della formazione del Varicosity e del recupero in centrale del neurone assoni

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