Name: Un sistema di Microbiomechanical per lo studio della formazione del Varicosity e del recupero in centrale del neurone assoni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Scopri un sistema fluido pressurizzato per indurre varicosità reversibili in neuroni ippocampali coltivati. Questo metodo consente di studiare la plasticità neuronale indotta da stress meccanico e di identificare nuove strategie terapeutiche per lesioni cerebrali traumatiche.

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Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con gli istituti nazionali di salute animale uso orientamenti. Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalle concessioni dal National Institutes of Health (R01NS093073 e R21AA024873) a C. Gu.

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

La procedura di questo test di microbiomechanical è dritto in avanti. Esso produrrà risultati affidabili, se tutti i suoi passaggi sono eseguiti con attenzione. Ci sono diversi passaggi chiave che, se correttamente eseguita, ostacolerà la raccolta dei dati di successo. I passaggi critici cominciano a monte dell'effettiva applicazione dello stimolo puffing. La dissezione attenta, coltura e cura della cultura primaria del neurone sono di primaria importanza. Se i neuroni coltivati non sono sani, non reagiranno in modo coer...

Formazione del varicosity, o gonfiore/bordatura, lungo gli assoni, è una caratteristica prominente di neurodegenerazione osservata in molti disturbi o lesioni del sistema nervoso centrale, tra cui la sclerosi multipla, morbo di Alzheimer, morbo di Parkinson e traumatica brain injury1,2. Nonostante gli impatti fisiologici significativi dei varicosities axonal sulla propagazione del potenziale d'azione e trasmissione sinaptica3, come vengono generati i varicosities rimane sconosciuto. Recentemente, usando un'analisi di nuova costituzione microbiomechanical su colture di neuroni ippocampali da roditori, abbiamo trovato che stimoli meccanici possono indurre varicosità in questi neuroni con altamente interessanti caratteristiche. In primo luogo, l'induzione del varicosity è rapida (< 10 s) e questo processo è reversibile in modo imprevisto. In secondo luogo, l'inizio del varicosity dipende dalla forza sbuffando pressione: maggiore è la pressione, più veloce all'avvio. In terzo luogo, l'inizio del varicosity dipende dall'età neuronale. Gli assoni dei neuroni più giovani appaiono più reattivi alle sollecitazioni meccaniche, rispetto a quelle dei neuroni più anziani. In quarto luogo, il modulo di varicosità lungo gli assoni dei neuroni ippocampali, mentre i segmenti di assone iniziale di questi neuroni e dendriti non visualizzare nessun cambiamento nella stessa circostanza puffing. Così, il nostro studio ha rivelato una caratteristica novella di polarità di un neurone. Questi risultati con il sistema in vitro sono fisiologicamente rilevanti. Utilizzando un modello in vivo per trauma cranico lieve (mTBI), abbiamo mostrato che varicosities axonal sviluppato in modo multi-focale nella corteccia somatosensoriale dei topi immediatamente dopo l'impatto di Chiudi-cranio, coerenza con il nostro in vitro Risultati4. È importante notare che la nostra colorazione e imaging dei topi mTBI forniscono solo un'istantanea di un neurone cambiamenti morfologici, da eseguire in vivo imaging time-lapse della morfologia neuronale durante un impatto meccanico è ancora non è fattibile.
Questo sistema fluido-sbuffando ci ha permesso non solo di catturare caratteristiche uniche associate alla formazione di varici indotta da stress meccanico, ma anche per determinare il meccanismo di fondo. Provando diverse soluzioni extracellulare, bloccanti e apribottiglie di diversi candidati di canali ionici mechanosensitive ed elettrofisiologia cellulare, abbiamo identificato che il catione potenziale transitorio del ricevitore canale membro subfamily V 4 (TRPV4) canale che è permeabile per Ca2 + e Na+ e attivato da sbuffando è principalmente responsabile per la rilevazione iniziale stress meccanico durante la formazione di varici axonal4. Questo è stato ulteriormente confermato con un approccio di knockout di siRNA. Presi insieme, questo nuovo sistema di dosaggio che abbiamo sviluppato con la cultura di Neurone ippocampale, è altamente utile per studiare le proprietà di micromeccanica dei neuroni centrali, specialmente in combinazione con altre tecniche.
Questo sistema di micromeccanica che abbiamo stabilito è unico e si differenzia dai sistemi già esistenti in diversi aspetti importanti. In primo luogo, in questo sistema, i neuroni esperienza fuori del piano sollecitazioni meccaniche nelle forme di compressione e taglio. Durante l'impatto meccanico, processi neuronali rimangono attaccati alla superficie del vetrino coprioggetto e non si muovono. Questo è diverso da altri sistemi che si occupa principalmente di flessione e stretching in piano sperimentale (o tensione), per esempio, la deflessione degli assoni in bundle come stringhe5,6 in movimento o stretching assoni coltivati su bioerodibili canali e membrane estensibile7,8. Inoltre, sebbene varicosities axonal possono anche essere indotti questi saggi come nel nostro sistema fluido-sbuffando, il processo in queste impostazioni richiede molto più tempo (da 10 minuti a parecchie ore6,7,8) e viene visualizzato irreversibile. Infine, il nostro sistema utilizzando sbuffando fluido locale consente l'esame delle caratteristiche spaziali della formazione del varicosity (ad es., dendriti, spine dendritiche, soma, axonal segmenti iniziali e terminali axonal), oltre alle sue caratteristiche temporali. Utilizzando questo sistema, abbiamo scoperto diverse caratteristiche inaspettate e unici di formazione del varicosity assonale, particolarmente rapida insorgenza, lenta reversibilità e polarità di assone-dendrite.
Il sistema che discutiamo in questa carta è compatibile con molte tecniche di molecolare e biologia cellulare. Per esempio, per studiare gli effetti dello stress meccanico sulla morfologia neuronale e funzione, può essere utilizzato insieme a coculture di mielina, time-lapse di imaging di fluorescenza di riflessione interna totale (TIRF) e di trasferimento di energia di risonanza fluorescente (FRET) formazione immagine del calcio e registrazione di patch clamp. In questa carta, ci concentriamo sui componenti di base del sistema. Cultura di neuroni ippocampali, il fluido-sbuffando installazione, imaging ad alta risoluzione time-lapse per trasporto assonale e calcio imaging sono illustrate passo passo qui di seguito.

<table><tbody><tr><td>Vetrini coprioggetti da 12 mm&nbsp;</td><td>Strumenti Warner&nbsp;</td><td>64-0702</td><td>per piastra a 24 pozzetti&nbsp;</td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti da 25 mm&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>12-545-102&nbsp;</td><td>per piastra a 6 pozzetti&nbsp;</td></tr><tr><td>Acido acetico</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lisina</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Collagene coda di ratto&nbsp;</td><td>Roche&nbsp;</td><td>11 179 179 001&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>10X PBS&nbsp;</td><td>Diagnostica nazionale&nbsp;</td><td>CL-253</td><td></td></tr><tr><td>Na2SO4</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>S373-500</td><td></td></tr><tr><td>K2SO4</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>P304-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP410-500</td><td></td></tr><tr><td>D-glucosio&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>Enzima proteasi</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P4032</td><td></td></tr><tr><td></td><td>FBS Gibco&nbsp;</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>25030081</tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina 100x (P/S)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>15140122</tr><tr><td>MEM I sali di Earle</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>11090</td><td></td></tr><tr><td>Supplemento B27</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasale</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Arabinosilcitosina (Ara-C)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>147-94-4</td><td></td></tr><tr><td>Supporti Opti-MEM&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>1854313</td><td>reagente di trasfezione&nbsp;</td></tr><tr><td>Barre in borosilicato&nbsp;</td><td>World Precision Instruments Inc.</td><td>PG52151-4</td><td>per pipetta a soffio&nbsp;</td></tr><tr><td>tubi di gomma&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>14-169-1A</td><td></td></tr><tr><td>Siringa e stantuffo in plastica da 10 cc</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>micromanipolatore&nbsp;</td><td>Strumenti Sutter&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>S640-3</td><td></td></tr><tr><td>KCl&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>C70-500</td><td></td></tr><tr><td>Piatto per colture cellulari (35 mm x 10 mm)</td><td>Corning&nbsp;</td><td>3294</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Sonde molecolari</td><td>F14201</td><td>per imaging del calcio&nbsp;</td></tr><tr><td>Costrutto Mito-YFP&nbsp;</td><td>Takara Bio Inc.</td><td></td><td>per trasfezione cellulare&nbsp;</td></tr><tr><td>Costrutto YFP-N1</td><td>Takara Bio Inc.</td><td></td><td>per trasfezione cellulare&nbsp;</td></tr><tr><td>Modello P-1000 Estrattore per micropipette fiammeggiante/marrone&nbsp;</td><td>Strumenti Sutter&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mcroscopio Eclipse TE2000-U&nbsp;</td><td>Obiettivo Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan Fluor ELWD 20x&nbsp; &nbsp;</td><td>Nikon</td><td>062933</td><td>obiettivo&nbsp;</td></tr><tr><td>Lente ad olio Apo TIRF 100x/1.49</td><td>Nikon</td><td>MRD01991</td><td>obiettivo&nbsp;</td></tr></tbody></table>

un sistema di microbiomechanical per lo studio della formazione del varicosity e del recupero in centrale del neurone assoni

A Microbiomechanical System for Studying Varicosity Formation and Recovery in Central Neuron Axons

Varicosities axonal sono allargate strutture lungo i fasci di assoni con un elevato grado di eterogeneità. Sono presenti non solo nei cervelli con malattie neurodegenerative o lesioni, ma anche nel cervello normale. Qui, descriviamo un sistema di nuova costituzione micromeccanici per in modo rapido, affidabile ed reversibilmente indurre varicosities axonal, permettendoci di comprendere i meccanismi che regolano la formazione del varicosity e la proteina eterogenea composizione. Questo sistema rappresenta un mezzo romanzo per valutare gli effetti dello sforzo di compressione e taglio su diversi compartimenti cellulari dei neuroni, diversi da altri sistemi in vitro che si concentrano principalmente sull'effetto di stretching. Cosa importante, a causa delle caratteristiche uniche del nostro sistema, abbiamo recentemente effettuato una scoperta di nuovi risultati che l'applicazione del fluido pressurizzato può indurre rapidamente e reversibilmente varicosities axonal attraverso l'attivazione di un canale potenziale transitorio del ricevitore. Il nostro sistema biomeccanico può essere utilizzato comodamente in combinazione con aspersione di droga, live cell imaging, imaging del calcio e registrazione di patch clamp. Pertanto, questo metodo può essere adottato per lo studio di canali ionici meccanosensibili, regolamento di trasporto assonale, dinamica del citoscheletro assonale, segnalazione calcio e cambiamenti morfologici correlati a traumatico cranico.

Prima sbuffando, assoni normalmente mostrano poca formazione di varici. Seguente sbuffando con la nostra pressione standard (190 mmH2O altezza), l'inizio di assoni di sviluppare molti tallone-come varicosità. La formazione di varicosità è parzialmente reversibile, come mostrato dalle regioni dell'assone tornando al loro stato pre-soffiato in seguito a un periodo di recupero di 10 min (Figura 2A-B). Dopo un periodo di recupero più l...

Questo protocollo descrive un approccio fluido pressurizzato, fisiologicamente rilevante per induzione rapida e reversibile di varicosità in neuroni.

Un sistema di Microbiomechanical per lo studio della formazione del Varicosity e del recupero in centrale del neurone assoni

Axonal varicosities are enlarged structures along the shafts of axons with a high degree of heterogeneity. They are present not only in brains with ...

L'obiettivo generale di questa configurazione di fluido pressurizzato è quello di produrre rigonfiamenti ripetibili e coerenti lungo gli assoni dei neuroni in coltura. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle lesioni cerebrali, come i meccanismi alla base dei cambiamenti morfologici subcellulari nei neuroni dopo una lesione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il metodo produce cambiamenti morfologici coerenti e ripetibili che si riprendono nel tempo.Questa è una tecnica molto importante che abbiamo sviluppato in laboratorio. Questo perché non solo possiamo utilizzare il sistema per identificare il meccanismo molecolare che governa il cambiamento della morfologia degli assoni indotto dallo stress meccanico come una nuova forma di plasticità neuronale, ma anche utilizzare il sistema come strumento di screening per identificare nuovi farmaci e la strategia di trattamento per lesioni cerebrali lievi o traumatiche. Per iniziare questa procedura, posizionare una o più scatole di vetrini coprioggetti da 12 millimetri o 25 millimetri in un becher di vetro contenente il 70% di acido nitrico e incubare i vetrini coprioggetti a temperatura ambiente

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Induzione di varici assonali con uno stimolo micromeccanico sui neuroni

Anche se il sistema nervoso periferico (PNS) è in grado di riparare significativo dopo l'infortunio, poco si sa circa i meccanismi cellulari e molecolari che regolano questo fenomeno. Utilizzando vivo, zebrafish transgenico e riproducibile saggio resezione del nervo, siamo in grado di studiare i comportamenti delle cellule gliali dinamici durante la degenerazione dei nervi e la rigenerazione.

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