Trapianto di cellule staminali di tessuto adiposo-derivato foglio per ridurre le perdite dopo la colectomia parziale in un modello del ratto

Poiché presuppongono un effetto positivo sulla guarigione dei tessuti, i fogli ASC sono stati testati in molti modelli di malattia, come l'infarto del miocardio. Questo esperimento mostra che i fogli ASC possono essere utilizzati per via intra-addominale e applicati all'intestino. Il vantaggio principale delle lastre ASC è che non sono necessari materiali sintetici.

Inoltre, il trapianto di fogli ASC è relativamente facile da eseguire, con solo una piccola quantità di pratica. Questa nuova applicazione del trapianto di fogli ASC è stata sviluppata per prevenire le perdite dopo la resezione intestinale e offre un primo passo verso una nuova strategia terapeutica. I fogli ASC applicati all'anastomosi intestinale si sono dimostrati promettenti nella prevenzione delle perdite.

I fogli ASC possono essere applicati anche ad altri organi intra-addominali, come il tratto urinario. Iniziare sezionando il tessuto adiposo addominale sottocutaneo umano in pezzi di 0,5 cm, con una lama chirurgica sterile di misura 10, una pinza per tessuti Adson-Brown e forbici Metzenbaum. Pesare la quantità totale di tessuto sezionato in un flacone di vetro sterile.

Aggiungere 30 ml di terreno isolante per bottiglia. E digerire il tessuto adiposo sezionato in un incubatore shaker a 150 giri/min e 37 gradi Celsius per un'ora. Dopo un'ora, dividere la soluzione tissutale digerita in provette da 50 ml e centrifugare le provette per 10 minuti a 390 G. Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante.

Aggiungere il terreno per risospendere i pellet cellulari e aggiungere altro terreno di coltura, fino a 45 ml. Centrifugare le cellule combinate per cinque minuti a 390 G e rimuovere il surnatante. Risospendere il pellet cellulare con 10 ml di terreno di coltura.

E filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro da 100 micron. Aggiungere 50 l di soluzione di acido acido acido al 3% di blu di metilene, a 50 l di sospensione cellulare, ai globuli rossi dei pidocchi. Dopo aver miscelato la soluzione, pipettare 10 l su un emocitometro e contare le cellule.

Piastra le cellule a una densità di 40000 cellule per cm quadrato, in un pallone T175 contenente terreno di coltura. E incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un'atmosfera umida con il 5% di CO2 per 24 ore. Il giorno successivo, lavare le cellule con soluzione salina tamponata con fosfato caldo per rimuovere i detriti cellulari.

Quindi, sostituire il terreno con il terreno di coltura FBS al 10%, oltre all'acido-2-fosfato ascorbico appena aggiunto e al fattore di crescita dei fibroblasti ricombinanti umani due. Incubare fino a quando le cellule raggiungono il 90% di confluenza. Subcoltura delle cellule staminali adipose alla confluenza al 90%, utilizzando una soluzione standard di tripsina-EDTA allo 0,25%.

Dopo tre-cinque minuti, neutralizzare la soluzione di tripsina-EDTA allo 0,25% con 10 ml di terreno di coltura. Trasferire in una provetta da centrifuga e centrifugare le cellule per otto minuti a 250 g.Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 1 ml di terreno di coltura. Dopo aver contato le cellule con un emocitometro, piastrarle in fiasche di coltura T175, ad una densità di 8000 cellule per cm quadrato.

Congelare le ASC rimanenti in azoto liquido, con il 10% di dimetilsolfossido nel terreno di coltura prima di un ulteriore utilizzo. Precoat di piastre di coltura termoreattive da 3,5 cm di diametro, con 1 ml di siero fetale bovino. Quindi posizionare i piatti in un'incubatrice a 37 gradi Celsius, per almeno 30 minuti prima di seminare.

Per favorire l'adesione dell'ASC alla piastra termoreattiva e ridurre il rischio di distacco prematuro del foglio ASC in coltura, la piastra termoreattiva deve essere prerivestita con siero fetale bovino prima della semina cellulare. Tripsinizzare le ASC come prima, se ci sono grumi di cellule dopo la tripsinizzazione, filtrare le cellule attraverso un filtro da 100 micron prima di contare. Togliete i piatti dall'incubatrice e trasferiteli su una piastra riscaldante a 37 gradi Celsius.

Rimuovere l'FBS dal piatto. Dopo aver risospeso il pellet cellulare in LG DMEM, con il 10% di FBS, e aver contato le cellule, diluire 3,52 volte 10 al 6° ASC in 2 ml di terreno di coltura per piatto, per seminare 400000 cellule per cm quadrato in ogni piatto da 3,5 cm. Distribuire con cura le cellule nel modo più uniforme possibile, facendo oscillare delicatamente il piatto.

Quindi, coltivare i fogli ASC per 48 ore a 37 gradi Celsius in un'atmosfera umida con il 5% di CO2. Il giorno del trapianto, lasciare raffreddare i piatti di coltura a temperatura ambiente 40 minuti prima del trapianto in vivo per facilitare il distacco del foglio ASC. Una volta raffreddato, rimuovere il terreno di coltura e sostituirlo con 1 ml di LG DMEM senza siero.

Per trapiantare il foglio cellulare, afferrare delicatamente il bordo del foglio ASC con una pinza atraumatica e posizionare il lato del piatto del foglio ASC sopra la linea anastomotica. Una manipolazione delicata dei fogli e un corretto posizionamento dei fogli sono essenziali per garantire il successo del trapianto di fogli intatti. Stendere con cura il foglio ASC a circa 0,25 cm sopra e sotto la linea anastomotica.

Avvolgi il foglio attorno al colon, sollevando il colon, per avvolgere il foglio ASC attorno al lato dorsale. Gli animali di controllo, che non hanno ricevuto fogli ASC trapiantati, mostrano perdite fecali vicino alla linea anastomotica, indicate dalla freccia bianca al terzo giorno post-operatorio. Gli animali con fogli ASC trapiantati, indicati dalla freccia nera, hanno mostrato una ridotta perdita fecale e la formazione di ascessi al terzo giorno post-operatorio.

Lo stesso risultato è stato osservato sette giorni dopo l'intervento. Questa immagine mostra una sezione trasversale rappresentativa del sito di anastomosi colorettale in un animale trapiantato colorato con H ed E.La struttura del foglio potrebbe essere identificata nel sito di anastomosi, fino a sette giorni dopo l'intervento. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in pochi minuti se eseguita correttamente.

foglio ASC aderisce spontaneamente alla superficie cellulare zero del colon, non è necessario utilizzare colla o sutura per adattarsi al foglio ASC. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come preparare e trapiantare i fogli ASC sull'anastomosi colorettale nei ratti, per prevenire perdite dopo la colectomia parziale.