Name: Endomicroscopia confocale confocale a scansione laser accoppiata a fibre in vivo (pCLE) dei capillari dellippocampo in topi svegli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Impara la microscopia confocale a scansione laser accoppiata a fibre per visualizzare la dinamica microvascolare nell'ippocampo di topi svegli. Questa tecnica consente registrazioni elettrofisiologiche simultanee e imaging ad alta risoluzione a qualsiasi profondità cerebrale.

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Il progetto è stato finanziato da un premio per l'iniziativa di ricerca dell'American Epilepsy Society e da un premio della Commissione per la ricerca biomedica dell'Arizona a SLM, nonché da una sovvenzione di sfida da Research to Prevent Blindness Inc. al Dipartimento di Oftalmologia della SUNY Downstate Health Sciences University, il New York State Empire Innovation Program. e ulteriori sovvenzioni dalla National Science Foundation (0726113, 0852636 e 1523614), dalla Barrow Neurological Foundation, dai premi Mrs. Marian Rochelle, Mrs. Grace Welton e Dignity Health SEED, e da sovvenzioni federali dalla National Science Foundation (0726113, 0852636 e 1523614) e dal National Institute of Health (Awards R01EY031971 E R01CA258021), a SLM e S.M.C. <span lang="EN-US" style="font-size: 12pt; line-height: 107%; font-family: Calibri, sans-serif; color: rgb(34, 34, 34); background-image: initial; background-position: initial; background-size: initial; background-repeat: initial; background-attachment: initial; background-origin: initial; background-clip: initial;">Questo lavoro è stato sostenuto anche dall'Ufficio dell'Assistente del Segretario alla Difesa per gli Affari Sanitari con il Premio n. W81XWH-15-1-0138, a S.L.M..<span lang="EN-US" style="font-size: 12pt; line-height: 107%; font-family: Calibri, sans-serif; color: red; background-image: initial; background-position: initial; background-size: initial; background-repeat: initial; background-attachment: initial; background-origin: initial; background-clip: initial;"> <span lang="EN-US" style="font-size: 12pt; line-height: 107%; font-family: Calibri, sans-serif; color: rgb(34, 34, 34); background-image: initial; background-position: initial; background-size: initial; background-repeat: initial; background-attachment: initial; background-origin: initial; background-clip: initial;">L.-C. è stato sostenuto da una borsa di studio José Castillejo del Ministero dell'Istruzione spagnolo. Si ringraziano O. Caballero e M. Ledo per la consulenza tecnica e l'assistenza.

Il protocollo segue le linee guida NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali del Barrow Neurological Institute.
1. Posizionamento stereotassico per craniotomia
<ol><li>Pesare e poi anestetizzare il topo con un cocktail ketamina-xilazina (100 mg/kg-10 mg/kg i.p.). Assicurarsi che l'animale sia completamente anestetizzato osservando la sua mancanza di reazione al pizzicamento della coda e/o delle dita dei piedi.</li>
	<li>Posizionare un termoforo sotto il mouse e utilizzare un termometro rettale per monitorare continuamente la temperatura corporea durante l'intervento chirurgico di impianto anestetizzato iniziale (Figura 2A).</li>
	<li>Applicare un unguento oftalmico per prevenire la secchezza oculare.</li>
	<li>Stabilizzare la testa dell'animale in una cornice stereotassica per roditori, dotata di un adattatore per mouse. Per orientare correttamente il topo nel telaio stereotassico, posizionare i denti dell'animale all'interno del foro della barra del morso (Figura 2A e Figura 3A, punto g). Serrare il nasello clamp fino a quando non è aderente (Figura 2A,B e Figura 3A, elemento h). Il posizionamento del corpo del mouse deve essere il più dritto possibile (come nella Figura 2A).<ol><li>Fissare ulteriormente la testa dell'animale utilizzando barre auricolari di topo con polsini portamascelle (Figura 2A e Figura 3A, punto i), per bloccare saldamente i processi zigomatici del cranio. NOTA: Una volta fissata, la testa del mouse non dovrebbe avere un raggio di movimento orizzontale.</li>
	</ol></li>
	<li>Una volta che il topo è stato adattato alla struttura stereotassica (Figura 3B, punto j), pulire e sterilizzare il cuoio capelluto strofinandolo con uno scrub a base di cloro-esodio 2-3 volte, ogni volta seguito da un risciacquo alcolico. Quindi, applicare la lidocaina topica sulla parte superiore della testa.</li>
	<li>Praticare un'incisione lungo la linea mediana da posteriore ad anteriore (iniziare l'incisione alla base del cranio e completarla tra gli occhi; 12-15 mm) lungo la linea mediana sagittale del cranio, utilizzando forbici sottili o una lama. Ritrarre i bordi del cuoio capelluto con quattro pinze per serrefine bulldog da 28 mm per esporre il cranio e massimizzare l'area di lavoro (Figura 2B e Figura 3C).</li>
	<li>Utilizzare un bisturi o una microspatola (Figura 3C) per raschiare il periostio fino ai bordi dell'incisione. Utilizzare una forbice o una pinza per separare i tessuti (Figura 3C) per ritrarre con cautela i muscoli nella parte posteriore del collo (Figura 2B).</li>
	<li>Asciugare la parte superiore del cranio con un applicatore con punta di cotone, inumidito con alcol o perossido di idrogeno al 30%, per ottimizzare la visualizzazione delle suture craniche. Applicare soluzione fisiologica sul cranio una volta rimosso il tessuto connettivo.</li>
	<li>Una volta che la testa del topo è stabilizzata nell'apparato stereotassico, posizionare la punta dell'ago della siringa (21 G) nel portaelettrodo (Figura 3B, elemento l) e collegare il portaelettrodo al micromanipolatore stereotassico, abbassando la punta dell'ago a livello del cranio (Figura 2D).</li>
	<li>Regolare la direzione mediale-laterale del cranio misurando l'altezza del cranio a qualsiasi distanza posteriore al bregma (cioè -2,0 mm) e due distanze uguali lateralmente dalla linea mediana su entrambi i lati del cranio (cioè ± 1,5 mm) (Figura 2D). Puntare a una differenza di altezza tra i punti inferiore a 0,05 mm in direzione dorso-ventrale.<ol><li>Se maggiore di 0.05 mm, ruotare il cranio del mouse utilizzando la barra del morso o riposizionare la testa del mouse allentando con attenzione le barre auricolari, spostando lateralmente la testa e le barre auricolari secondo necessità, quindi serrando nuovamente le barre auricolari.</li>
	</ol></li>
	<li>Una volta che il cranio è posizionato nel dispositivo stereotassico, determinare e registrare le coordinate stereotassiche delle suture del cranio bregma e lambda lungo gli assi anteroposteriore (AP), laterale mediale (ML) e ventrale dorsale (DV).</li>
	<li>Identificare il punto target (ippocampo destro) con l'aiuto di un atlante stereotassico. Quindi, trova sul cranio le coordinate del punto bersaglio rispetto al bregma (AP: -2,7 mm, ML: -2,7 mm) (Figura 2E).</li>
	<li>Utilizzando un marcatore chirurgico, contrassegnare i quattro angoli di una finestra di imaging di 1,4 mm x 2 mm sul cranio con punti, centrati attorno al punto bersaglio direttamente sopra l'ippocampo (Figura 2F), per la successiva craniotomia.</li>
	<li>Utilizzare il marcatore chirurgico per disegnare due punti aggiuntivi: uno sopra l'osso parietale in alto a sinistra (Figura 2G) e un altro sopra l'osso frontale destro (Figura 2H), per indicare il futuro posizionamento di due viti ossee (Figura 3A, elemento b) che ancoreranno la calotta (Figura 3B, elemento m) al cranio.</li>
	<li>Utilizzare il pennarello chirurgico per disegnare altri tre punti che indicano dove verranno inseriti gli elettrodi di registrazione EEG epidurale: un punto posizionato 1 mm su entrambi i lati della linea mediana e un punto aggiuntivo sulla linea mediana posizionato 1 mm dietro Lambda (Figura 2E, Figura 4A e Figura 5B).</li>
</ol>2. Installazione del cappuccio della testa
<ol><li>Utilizzando una fresa di 0,7 mm di diametro (Figura 3C), praticare con cautela due piccoli fori nel cranio, in corrispondenza delle posizioni dei punti che indicano il posizionamento delle viti ossee (vedere il passaggio 1.15 sopra). Quindi, prendere due viti ossee (con intaglio in acciaio inossidabile, lunghezza: 4 mm; diametro: 0,85 mm) precedentemente disinfettate con etanolo al 70-80% e avvitarle al cranio per una maggiore stabilità del cappuccio della testa (Figura 2I-J e Figura 3A, elemento b).<ol><li>Assicurarsi che le punte delle viti non sporgano oltre la parte inferiore dell'osso nella cavità cranica, rischiando di danneggiare il cervello. Si noti che una delle due viti ossee sarà anteriore alle due viti a testa cilindrica e l'altra posteriore ad esse (Figura 2G-J).</li>
	</ol></li>
	<li>Spruzzare soluzione fisiologica sul cranio per raffreddarlo e pulirlo. Quindi asciugare completamente il cranio e applicare un sottile strato di cianoacrilato attorno alle viti.</li>
	<li>Utilizzare un pezzo di allineamento personalizzato (Figura 3A, elemento c) fissato al microdrive montato sul dispositivo stereotassico (Figura 2F-J e Figura 3A, elemento d), in modo che la posizione della cuffia sia allineata lungo la linea mediana, con la cresta anteriore sovrastante il bregma. Questo pezzo in acciaio inossidabile personalizzato è a forma di L (angolato a 90°), con due fori separati da 4 mm (Figura 2F-J e Figura 3A, elemento c).<ol><li>Utilizzare il manipolatore stereotassico per posizionare il pezzo di allineamento a forma di L, con due viti di azionamento con intaglio a testa bombata montate (M1,6 x 0,35 metrico grossolano, lunghezza 12 mm; Figura 3A, punto a) sopra il bregma, fino a quando la base delle viti non si appoggia sul cranio, facendo attenzione a non esercitare pressione sul cranio (Figura 2I-J).</li>
	</ol></li>
	<li>Applicare cianoacrilato seguito da cemento dentale per fissare la base delle viti al cranio. Fare attenzione a non ostruire i segni di riferimento della finestra di imaging sopra l'ippocampo (Figura 2K).</li>
</ol>3. Chirurgia craniotomica con finestra di imaging
<ol><li>In ciascuna delle posizioni dei segni di riferimento per craniotomia che indicano gli angoli della finestra di imaging (vedere il passaggio 1.14 sopra), praticare un foro di sbavatura di 0,7 mm di diametro, quindi delineare delicatamente la periferia della finestra craniotomica di 1,4 mm x 2 mm con il trapano, con tagli iterativi più profondi (Figura 2L).</li>
	<li>Fare attenzione a non forare troppo in profondità o con troppa forza il cranio, che è sottile e fragile, avendo uno spessore di circa 300 μm. Una volta completato il lembo osseo, sollevare il lembo allentato con la punta di un bisturi, facendo attenzione a non danneggiare la dura madre sottostante.</li>
	<li>Coprite la finestra aperta con cera per ossa (Figura 2M).</li>
	<li>Utilizzando una fresa di 0,9 mm di diametro, praticare tre fori per il futuro posizionamento degli elettrodi EEG epidurale (vedere il passaggio 1.15 sopra) facendo attenzione a non tagliare la dura madre (Figura 2E,L).</li>
	<li>Copri i tre fori con cera per ossa.</li>
	<li>Applicare delicatamente il cianoacrilato attorno ai bordi della finestra di imaging ricoperta di cera ossea e dei fori EEG, facendo attenzione a non sigillare le craniotomie (Figura 2L).</li>
	<li>Costruire una parete di cemento dentale che racchiuda la finestra di imaging e i fori EEG e la leghi al cappuccio della testa precedentemente cementato (Figura 2M e Figura 3B, elemento m).</li>
	<li>Lasciare asciugare il cemento per almeno 10 minuti.</li>
	<li>Chiudere i margini sciolti della ferita con semplici suture interrotte, utilizzando seta intrecciata nera 4-0 o 5-0 (Figura 2N e Figura 3C).</li>
</ol>4. Post-operatorio
<ol><li>Utilizzare un applicatore con punta di cotone per applicare l'unguento alla lidocaina intorno alla pelle esposta per attutire la sensazione intorno al bordo della ferita.</li>
	<li>Utilizzare un applicatore sterile con punta in cotone per applicare Neosporin sulla pelle esposta.</li>
	<li>Rimuovere l'animale dal telaio stereotassico (Figura 2N).</li>
	<li>Iniettare ketoprofene (5 mg/kg) IP o IM per l'analgesia post-chirurgica.</li>
	<li>Osserva l'animale fino a quando non è vigile e si muove (questo di solito avviene in pochi minuti).</li>
	<li>Metti l'animale in una gabbia calda e continua a monitorare il suo recupero fino a quando non beve o mangia ed è pronto per essere trasferito nella stabulazione dell'animale.</li>
	<li>Controllare l'animale almeno una volta al giorno per circa una settimana dopo l'intervento, osservando eventuali segni di comportamento svogliato e/o di alimentazione/consumo inadeguato (Figura 2O).</li>
</ol>5. Iniezione di colorante e registrazione EEG
<ol><li>Attendere almeno un giorno dopo l'intervento chirurgico di impianto del cappuccio per iniziare le registrazioni.</li>
	<li>Posizionare il mouse in un dispositivo di contenimento in schiuma modellato sul suo corpo, all'interno della cornice stereotassica (Figura 3B, elementi n e j).</li>
	<li>Fissare il cappuccio della testa (Figura 3 B-I, elemento m) a una barra di montaggio personalizzata fissata al telaio stereotassico (Figura 3A, B, elementi e e j e Figura 4A). La sezione lunga dell'elemento e (Figura 3A,B) deve avere una lunghezza compresa tra 9,4 e 13 mm. Fissare l'elemento f (una piastra di montaggio con dimensioni 1.5 cm x 0.5 cm, con due fori separati di 4 mm dal centro al centro) all'elemento e (Figura 3A, B, elementi e, f e k). Questo sistema di allineamento posizionerà il topo sveglio in modo sicuro al frame stereotassico durante le sessioni di imaging (Figura 4).</li>
	<li>Inserire gli elettrodi di registrazione EEG epidurale (Figura 5A), posizionando gli elettrodi di terra (fili bianchi) all'interno del foro centrale posteriore e gli elettrodi di registrazione (fili rossi) nei fori anteriori sinistro e destro (Figura 2E, Figura 4E e Figura 5E). Posizionare ciascuno dei fili a forma di L tra il cranio e la dura madre (Figura 5C) per ottimizzare il contatto elettrico.</li>
	<li>Iniettare nella vena caudale destrano fissabile con fluoresceina verde lisina (0,2 ml/25 g di fluoresceina 5% p/p), per visualizzare il flusso sanguigno all'interno dell'ippocampo.<ol><li>Per migliorare la dilatazione della vena centrale della coda del topo prima dell'iniezione, utilizzare una o più delle seguenti strategie: a) Applicare etanolo al 70% sulla vena centrale utilizzando un applicatore con punta di cotone; b) Immergere la coda in acqua tiepida (35-40 °C) per 1-3 minuti; c) Esporre la coda a una lampada riscaldante per alcuni minuti.</li>
		<li>Fissa la coda del topo con due dita e individua la vena centrale, che si trova immediatamente sotto la pelle. Inserire l'ago (siringa da insulina ultrafine con ago integrato 30G), con lo smusso rivolto verso l'alto, nella vena, a circa metà o due terzi dalla base della coda. Tenere l'ago parallelo alla coda durante l'iniezione.</li>
		<li>Iniettare il colorante lentamente e costantemente, facendo attenzione a evitare qualsiasi cambiamento nella posizione dell'ago o della coda. NOTA: Non dovrebbe esserci resistenza quando si preme lo stantuffo della siringa.</li>
		<li>Dopo aver completato l'iniezione, estrarre l'ago e applicare una leggera pressione sul sito di puntura per sigillare il vaso.</li>
		<li>Lasciare che si verifichi la coagulazione.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Endomicroscopia confocale a scansione laser confocale accoppiata a fascio ottico in fibra ottica in vivo (pCLE)
<ol><li>Subito dopo l'iniezione della vena caudale (passaggio 5.5.3 sopra), bloccare il fascio di fibre ottiche smussate da 300 μm (contenente 5000-7000 fibre da 3 μm in ciascun fascio) con orientamento verso il basso rispetto al braccio mobile dell'azionamento stereotassico robotico.</li>
	<li>Rimuovere la cera ossea dalla craniotomia.</li>
	<li>Rimuovere la dura, usando la punta piegata di un ago da siringa.</li>
	<li>Utilizzando il sistema di posizionamento robotico, spostare prima l'obiettivo in fibra nella posizione stereotassica anteriore-posteriore e sinistra-destra appropriata, con la punta azzerata sull'asse z sulla superficie della corteccia.</li>
	<li>Avviare la registrazione EEG (Figura 5D).</li>
	<li>Avviare la scansione laser confocale del piano posteriore dell'obiettivo in fibra, seguita direttamente dalla discesa lenta dell'obiettivo sull'asse z utilizzando i controlli z del microdrive robotico, fino a raggiungere la profondità del bersaglio all'interno del cervello (Figura 4C). Visualizzare i risultati dell'imaging nel software microscopico durante la discesa.<ol><li>Se la punta della fibra si trova all'interno della regione di registrazione X-Y-Z target e due o più vasi entrano nel campo visivo della finestra di imaging, interrompere la discesa e avviare le registrazioni video. Ottieni filmati time-lapse in tempo reale a tutto campo del flusso sanguigno a 11,7 Hz utilizzando il software di imaging di Cellvizio Lab. (Velocità più elevate possono essere ottenute con un FOV inferiore). Le registrazioni possono avvenire per 4-5 ore alla volta, in giorni consecutivi se necessario.</li>
	</ol></li>
	<li>Utilizzando una siringa da 10 mL con tubo di silicone smussato fissato alla punta dell'ago, nutrire l'animale durante le registrazioni fornendo periodicamente pasta a base di pellet di topi macinati con acqua.</li>
	<li>Al termine della sessione di imaging, terminare le registrazioni.</li>
	<li>Rimuovere delicatamente gli elettrocateteri EEG e pulirli con Tergazyme.</li>
	<li>Rimuovere lentamente il fascio di fibre ottiche dal cervello dell'animale invertendo la fibra lungo l'asse z di ingresso.</li>
	<li>Sganciare l'animale dal montante della testa e dai sistemi di ritenuta per il corpo.</li>
	<li>Se appropriato, seguire i protocolli di eutanasia e di trattamento dei tessuti necessari per visualizzare i vasi sanguigni ed eseguire l'immunoistochimica.</li>
	<li>Se si prevede di registrare dallo stesso animale in una sessione futura, coprire la finestra di imaging con cera ossea o silastico.</li>
</ol>

<ol><li>Denk, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+and+functional+imaging+of+neurons+using+2-photon+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy.</a> Journal of Neuroscience Methods. 54 (2), 151-162 (1994).</li>
<li>Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuations+and+stimulus-induced+changes+in+blood+flow+observed+in+individual+capillaries+in+layers+2+through+4+of+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 15741-15746 (1998).</li>
<li>Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+miniature+head-mounted+two-photon+microscope.+High-resolution+brain+imaging+in+freely+moving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A miniature head-mounted two-photon microscope. High-resolution brain imaging in freely moving animals.</a> Neuron. 31, 903(2001).</li>
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<li>Hirase, H., Creso, J., Buzsaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+level+imaging+of+local+cerebral+blood+flow+in+bicuculline-induced+epileptic+foci%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Capillary level imaging of local cerebral blood flow in bicuculline-induced epileptic foci.</a> Neuroscience. 128, 209-216 (2004).</li>
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<li>Yemisci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericyte+contraction+induced+by+oxidative-nitrative+stress+impairs+capillary+reflow+despite+successful+opening+of+an+occluded+cerebral+artery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pericyte contraction induced by oxidative-nitrative stress impairs capillary reflow despite successful opening of an occluded cerebral artery.</a> Nature Medicine. 15, 1031-1037 (2009).</li>
<li>Fernandez-Klett, F., Offenhauser, N., Dirnagl, U., Priller, J., Lindauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+in+capillaries+are+contractile+in+vivo%2C+but+arterioles+mediate+functional+hyperemia+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Pericytes in capillaries are contractile in vivo, but arterioles mediate functional hyperemia in the mouse brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 22290-22295 (2010).</li>
<li>Leal-Campanario, R., Alarcon-Martinez, L., Martinez-Conde, S., Calhoun, M., Macknik, S. Blood Flow Analysis in Epilepsy Using a Novel Stereological Approach. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLeal-Campanario%2C+R+%22Neurostereology%3A+Unbiased+Stereology+of+Neural+Systems%22">Neurostereology: Unbiased Stereology of Neural Systems</a>. Mouton, P. R. , John Wiley & Sons, Inc. Ames, USA. (2013).</li>
<li>Smart, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+the+K%28V%291.1+potassium+channel+causes+epilepsy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Deletion of the K(V)1.1 potassium channel causes epilepsy in mice.</a> Neuron. 20, 809-819 (1998).</li>
<li>Zuberi, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mutation+in+the+human+voltage-gated+potassium+channel+gene+%28Kv1.1%29+associates+with+episodic+ataxia+type+1+and+sometimes+with+partial+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">A novel mutation in the human voltage-gated potassium channel gene (Kv1.1) associates with episodic ataxia type 1 and sometimes with partial epilepsy.</a> Brain. 122, 817-825 (1999).</li>
</ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Abbiamo sviluppato un sistema di ritenuta testa-cappuccio per esperimenti elettrofisiologici e pCLE simultanei a fibre ottiche in topi svegli, riducendo la potenziale contaminazione della risposta dovuta ai farmaci anestetici. Il cappuccio per la testa e l'apparato di montaggio sono semplici da costruire e sono riutilizzabili per esperimenti di imaging cronico da svegli. Abbiamo verificato la qualità delle registrazioni rispetto al gold standard per l'imaging microscopico del flusso sanguigno in vivo, TPLSM.
<p class...

A differenza di altri metodi di imaging microscopico 1,2,3,4,5,6,7,8, la microscopia confocale in vivo basata su fibre ottiche consente di misurare la dinamica del flusso sanguigno in qualsiasi regione del cervello, a qualsiasi profondità, ad alta velocità (fino a 240 Hz a seconda delle dimensioni del campo visivo9). Una sonda a fibre ottiche consente di ottenere immagini a scansione laser confocale in vivo con una risoluzione di 3 μm perché la punta della sonda (un obiettivo senza lente costituito da un fascio di 5000-6000 singole fibre di 3 μm di diametro) può essere posizionata con la precisione di un microelettrodo, entro 15 μm dal target fluorescente di interesse. Come per l'imaging a due fotoni in vivo, i fluorofori devono essere preventivamente introdotti nel bersaglio di imaging. Ad esempio, la fluoresceina destrano (o punti quantici) può essere iniettata nel sistema vascolare, o le proteine fluorescenti geneticamente codificate possono essere trasfettate nelle cellule, o i coloranti fluorescenti come Oregon Green BAPTA-1 possono essere caricati in massa nelle cellule, prima dell'imaging.
Recenti ricerche che utilizzano queste tecniche hanno scoperto che l'attività motoria delle cellule murali che porta a vasospasmo capillare ictale - improvvise costrizioni che si verificano nella posizione delle cellule murali durante le convulsioni 9 - può contribuire alla neurodegenerazione nell'ippocampo ictale9. Mentre precedenti studi di imaging hanno mostrato costrizioni dei periciti in vitro e in vivo collegate alle applicazioni di farmaci 6,7,10,11,12, Leal-Campanario et al. hanno trovato la prima evidenza di costrizioni capillari spontanee in vivo nel cervello murino. Per stabilire la rilevanza per l'epilessia del lobo temporale umano, hanno studiato topi maschi (P30-40 old) knockout (KO) Kv1.1 (kcna1-null) 14,15 (JAX stock #003532), un modello genetico di atassia episodica umana di tipo 115. I periciti hanno provocato vasocostrizioni murali ippocampali sia patologiche che fisiologiche9 negli animali spontaneamente epilettici e nei loro compagni di cucciolata wild-type (WT). Queste osservazioni sono state replicate in animali WT resi epilettici con acido kainico, indicando così la loro generalizzazione ad altre forme di epilessia. Leal-Campanario et al. hanno inoltre determinato, utilizzando nuovi approcci di microscopia stereologica, che i neuroni apoptotici, ma non sani, negli animali epilettici erano spazialmente accoppiati alla microvascolarizzazione dell'ippocampo. Poiché l'eccitotossicità non ha alcuna associazione spaziale nota con il sistema vascolare, questo risultato ha indicato che l'ipossia indotta da ischemia vasospastica capillare anormale contribuisce alla neurodegenerazione nell'epilessia. La Figura 1 mostra uno schema della configurazione generale.

<table><tbody><tr><td>Fresa da 0,7 mm di diametro</td><td>Fine Science Tools</td><td>19007-07</td><td>Per viti n. 19010-00</td></tr><tr><td>Fresa da 0,9 mm di diametro</td><td>Fine Science Tools</td><td>19007-09</td><td></td></tr><tr><td>ASEPTICO AEU-12C TORQUE PLUS</td><td>da manipolo soluzione</td><td>AEU12C</td><td></td></tr><tr><td>Bull dog serrifine clump</td><td>Fine Science Tools</td><td>18050-28</td><td></td></tr><tr><td>CellVizio dual band</td><td>Mauna Kea Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellVizio banda singola</td><td>Mauna Kea Technologies Microsonda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>confocale 300 micron (Serie S)</td><td>Mauna Kea Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pezzo di allineamento su misura</td><td>a forma di L (angolato a 90 gradi) e realizzato in acciaio inossidabile con due fori praticati su di esso, con una distanza di 4 mm da centro a centro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Barra</td> <td>di montaggio su misuraIl pezzo a sezione lunga della barra di montaggio deve essere compreso tra 9,4 e 13 mm. Fissata a questo pezzo della barra di montaggio, posizionare una piastra in acciaio inossidabile lunga 1,5 cm e larga 0,5 cm con due fori praticati separati da 4 mm da centro a centro, la stessa distanza del pezzo di allineamento a forma di L.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adesivo cianoacrilato-Super colla</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont pinze #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>DuraLay Inlay Resin &ndash; Pacchetto standard</td><td>Reliance Dental Mfg Co.</td><td>602-7395 (da Patterson Dental)</td><td></td></tr><tr><td>Testa Fillister, Azionamento a taglio, M1,6x0,35 Metrico grossolano, 12mm Lunghezza sotto la testa, Vite a macchina</td><td>MSC industriale diretto co.</td><td></td><td></td>2834117</tr><tr><td>Forbice a punta fine</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceina 5% w/w destrano fissabile con lisina (2MD)</td><td>Invitrogen, USA</td><td>D7137</td><td></td></tr><tr><td>Porta ago liscio Halsey</td><td>Fine Science Tools</td><td>12001-13</td><td></td></tr><tr><td>Ago da sutura Kalt 3/8 curvo</td><td>Fine Science Tools</td><td>12050-03</td><td></td></tr><tr><td>stereotassico standard da laboratorio, ratto e topo</td><td>Stoelting Co. 51704</td><td>51670</td><td></td></tr><tr><td>Methocel 2%</td><td>Omnivision GmbH</td><td>PZN: 04682367</td><td>Unguento per gli occhi per prevenire la secchezza.</td></tr><tr><td>Mouse Regolatore di temperatura, sonda (YSI-451), piccolo termoforo-TC-1000 Mouse</td><td>CWE Inc.</td><td>08-13000</td><td></td></tr><tr><td>Trasmettitori PhysioTel F20-EET</td><td>DSI</td><td>270-0124-001</td><td></td></tr><tr><td>Robot stereotassico, braccio manipolatore, ADD-ON, 3 assi, SINISTRO</td><td>Stoelting Co.C13</td><td>51704</td><td></td></tr><tr><td>Sel-Viti ossee filettanti</td><td>Fine Science Tools</td><td>19010-10</td><td></td></tr><tr><td>Barre auricolari standard e punte in gomma per sutura stereotassica del mouse</td><td>Stoelting Co</td><td>51648</td><td></td></tr><tr><td> Filo - Seta intrecciata/Misura 4/0</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-40</td><td></td></tr><tr><td>Microspatola per la separazione dei tessuti</td><td>Fine Science Tools</td><td>10091-121</td><td></td></tr></tbody></table>

endomicroscopia confocale confocale a scansione laser accoppiata a fibre in vivo (pcle) dei capillari dell'ippocampo in topi svegli

In Vivo Fiber-Coupled Pre-Clinical Confocal Laser-scanning Endomicroscopy (pCLE) of Hippocampal Capillaries in Awake Mice

L'obiettivo di questo protocollo è quello di descrivere l'endomicroscopia confocale a scansione laser (pCLE) pre-clinica accoppiata a fascio ottico nella sua applicazione specifica per chiarire gli effetti del flusso sanguigno capillare durante le convulsioni, guidati da cellule murali. L'imaging corticale in vitro e in vivo ha dimostrato che le costrizioni capillari guidate dai periciti possono derivare dall'attività neurale locale funzionale, nonché dall'applicazione di farmaci, in animali sani. Qui, viene presentato un protocollo su come utilizzare pCLE per determinare il ruolo della dinamica microvascolare nella degenerazione neurale nell'epilessia, a qualsiasi profondità tissutale (in particolare nell'ippocampo). Descriviamo una tecnica di poggiatesta che è stata adattata per registrare pCLE in animali svegli, per affrontare i potenziali effetti collaterali degli anestetici sull'attività neurale. Utilizzando questi metodi, le registrazioni elettrofisiologiche e di imaging possono essere condotte per diverse ore nelle strutture neurali profonde del cervello.

Abbiamo sviluppato questi metodi per valutare se i vasospasmi capillari anormali guidati dai periciti nell'ippocampo, che si verificano a seguito di convulsioni, potrebbero causare ipossia franca che contribuisce alla morte cellulare nel focus ictale 9,13.
Lo sviluppo del cappuccio e la sua corretta installazione hanno offerto un'elevata stabilità nelle registrazioni, consentendo la registrazione simultanea dell'EEG e del flusso sangui...

Mentre l'imaging multifotone è efficace solo a profondità limitate dalla superficie del tessuto, è possibile ottenere immagini con risoluzione di 3 μm a qualsiasi profondità tramite pCLE. Qui, presentiamo un protocollo per condurre l'imaging pCLE per misurare la dinamica microvascolare nell'ippocampo di topi ictali e wild-type.

Endomicroscopia confocale confocale a scansione laser accoppiata a fibre in vivo (pCLE) dei capillari dell'ippocampo in topi svegli

The goal of this protocol is to describe fiber-optic-bundle-coupled pre-clinical confocal laser-scanning endomicroscopy (pCLE) in its specific application ...

Questo protocollo ci ha permesso di utilizzare l'endomicroscopio a fibre ottiche confocali a scansione laser per eseguire simultanee immagini e registrazioni elettrofisiologiche in vivo per diverse ore da strutture neurali a qualsiasi profondità del cervello nell'animale sveglio o relativamente anestetizzato. Abbiamo sviluppato un metodo di contenzione indolore che consente l'imaging cerebrale profondo negli animali svegli utilizzando metodi simili a quelli precedentemente impiegati per le registrazioni elettrofisiologiche. Questo metodo è stato utilizzato per studiare le anomalie vascolari funzionali in modelli di roditori di epilessia e degenerazione maculare legata all'età.È una tecnica praticabile per valutare il contributo della patologia del flusso sanguigno in molti, se non nella maggior parte degli organi delle malattie. Mentre questa tecnica è stata sviluppata per uno studio in tempo reale delle dinamiche del flusso sanguigno nel cervello, l'abbiamo utilizzata per studiare il flusso sanguigno nella retina in vivo. Non si limita agli studi vascolari nel tessuto neurale.A dimostrare la procedura sarà Jose Maria Gonzalez Martin, un tecnico altamente qualificato del mio labora

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Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Fonte: Maruoka, H., et. al. Imaging simultaneo della dinamica microgliale e dell'attività neuronale in topi svegli. J. Vis. Exp. (2022) Questo video mostra una procedura di microscopia a due fotoni per l'imaging dell'attività neuronale e della dinamica microgliale in un topo sveglio durante la stimolazione visiva, evidenziando i transitori del calcio e le interazioni cellulari.

Imaging simultaneo della dinamica microgliale e dell'attività neuronale in un topo sveglio

Fonte: Ulivi, A. F., et. al. Imaging longitudinale a due fotoni dell'ippocampo dorsale CA1 in topi vivi. J. Vis. Exp. (2019) Questo video mostra l'imaging longitudinale a due fotoni di neuroni piramidali marcati in fluorescenza in un topo vivo,  mostrando la preparazione, l'allineamento della cannula e l'imaging di dendriti e spine dendritiche per studiare la struttura neuronale nella regione CA1 dell'ippocampo.

Imaging longitudinale a due fotoni di neuroni marcati in fluorescenza in un ippocampo di topo vivo 

Fonte: Kamei, R., et. al., Imaging cronico a due fotoni in vivo della microglia nell'ippocampo del topo. J. Vis. Exp. (2022)Il video mostra il processo di configurazione e imaging per la microscopia a due fotoni in vivo della dinamica microgliale nel CA1 dell'ippocampo (Cornu ammonis 1) e nel giro dentato, garantendo un allineamento ottico ottimale e una valutazione dell'integrità strutturale.

Imaging in vivo a due fotoni della dinamica microgliale nell'ippocampo del topo

Questo metodo descrive una preparazione cronica che consente l'accesso ottico all'ippocampo di topi viventi. Questa preparazione può essere utilizzata per eseguire l'imaging ottico longitudinale della plasticità strutturale neuronale e della plasticità cellulare evocata dall'attività per un periodo di diverse settimane.

Imaging longitudinale a due fotoni dell'ippocampo dorsale CA1 in topi vivi

L'imaging ottico transcranico consente l'imaging ad ampio campo del trasporto di fluidi cerebrospinali nella corteccia di topi vivi attraverso un cranio intatto.

In vivo Imaging del trasporto del fluido cerebrospinale attraverso il teschio del topo intatto utilizzando la macroscopia di fluorescenza

Questo articolo dimostra la preparazione di una finestra di imaging su misura integrata con cannula per infusione e il suo impianto sulla regione CA1 dell'ippocampo nei topi.

Procedura craniotomia per la visualizzazione delle attività neuronali nell'ippocampo dei topi che si comportano

Presentiamo un protocollo per l'utilizzo della microscopia laser confocale a fibre ottiche (CLM) per studiare in modo non invasivo la distribuzione spazio-temporale dei liposomi nell'occhio dopo iniezione subcongiuntivale.

Imaging in vivo spazio-temporale di sistemi di somministrazione di farmaci oculari mediante microscopia laser confocale a fibre ottiche

Questo articolo descrive un metodo per l'osservazione cronica in vivo della microglia a riposo nell'ippocampo CA1 del topo utilizzando la chirurgia controllata con precisione e la microscopia a due fotoni.

In vivo Imaging cronico a due fotoni della microglia nell'ippocampo del topo

Qui, descriviamo un protocollo che combina l'iniezione di virus adeno-associato con l'impianto di finestre craniche per l'imaging simultaneo delle dinamiche microgliali e dell'attività neuronale nei topi svegli.

Imaging simultaneo delle dinamiche microgliali e dell'attività neuronale in topi svegli

Utilizzando un approccio completamente ottico, l'ictus ischemico viene indotto registrando contemporaneamente l'attività neuronale del Ca2+ utilizzando un biosensore fluorescente nel nucleo emergente dell'ictus di un topo sveglio e in comportamento.

Fototrombosi simultanea e fotometria delle fibre per indurre e monitorare l'ictus ischemico nei topi comportanti

Questo protocollo fornisce una descrizione completa di un metodo per la registrazione simultanea dei segnali di calcio provenienti da neuroni e astrociti attraverso molteplici regioni cerebrali legate alla memoria e ne dimostra l'applicazione durante un paradigma di apprendimento e comportamento della memoria.

Un metodo di fotometria a fibre a doppio colore per registrare l'attività degli astrociti-neuroni in più regioni cerebrali durante l'apprendimento e i comportamenti di memoria

Impara la microscopia confocale a scansione laser accoppiata a fibre per visualizzare la dinamica microvascolare nell'ippocampo di topi svegli. Questa tecnica consente registrazioni elettrofisiologiche simultanee e imaging ad alta risoluzione a qualsiasi profondità cerebrale.

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Endomicroscopia confocale confocale a scansione laser accoppiata a fibre in vivo (pCLE) dei capillari dell'ippocampo in topi svegli

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