Isolamento dei mastociti peritoneo-derivati e loro caratterizzazione funzionale con Ca^{2 +}-imaging e degranulazione saggi

Questi metodi possono aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della segnalazione intracellulare sulle cellule eccitabili, come ad esempio quali canali ionici sono fondamentali per l'attivazione delle cellule immunitarie e il rilascio del mediatore. I principali vantaggi di queste tecniche sono la loro relativa semplicità e la possibilità di analisi simultanea di un gran numero di cellule. A dimostrare l'imaging del calcio Fura-2 nei mastociti sarà Kathrin Ohlenschlager, una studentessa laureata del mio laboratorio.

Per iniziare questa procedura, spruzzare il topo eutanasia con etanolo al 70% e fissarlo su un blocco di schiuma con il lato dorsale rivolto verso il basso usando degli spilli. Utilizzando le forbici a lama smussata, rimuovere la pelle sopra l'addome del topo ed evitare di danneggiare la cavità peritoneale. Quindi, iniettare sette millilitri di terreno RPMI ghiacciato nella cavità peritoneale inserendo con cura un ago calibro 27 nel peritoneo.

Non perforare alcun organo e utilizzare un punto nella regione del grasso dell'epididimo per ridurre il rischio di perforazione di un organo. Dopo l'iniezione, agitare il topo per un minuto per staccare le cellule peritoneali nel mezzo RMPI. Non scuotere il topo troppo forte per evitare di danneggiare gli organi interni e contaminare la cavità peritoneale con il sangue.

Quindi, riutilizzare la siringa dotandola di una nuova cannula calibro 20. Sposta gli organi interni da un lato inclinando il blocco di schiuma e picchiettandolo delicatamente sul banco per facilitare l'aspirazione media dall'altro lato. Successivamente, inserire un ago da 20 gauge smussato per aspirare il fluido dall'addome delicatamente e lentamente per evitare l'intasamento da parte degli organi interni.

Raccogli quanto più liquido possibile. Quindi, rimuovere l'ago dalla siringa e trasferire la sospensione cellulare raccolta in una provetta di raccolta con ghiaccio. Gettare una provetta del campione se c'è una contaminazione visibile del sangue.

Centrifugare la provetta con una sospensione di cellule pulite a 300 g per cinque minuti. Sotto una cappa sterile, aspirare il surnatante. Risospendere i pellet di campione in un mezzo PMC freddo e trasferire la sospensione cellulare in un pallone per coltura cellulare di 25 centimetri quadrati.

Successivamente, aggiungere i fattori di crescita IL-3 e SCF alle concentrazioni finali di 10 nanogrammi per millilitro e 30 nanogrammi per millilitro, rispettivamente. Incubare le cellule per circa 48 ore a 37 gradi Celsius fino alla procedura successiva. Nei giorni da 12 a 15, se sono previsti esperimenti con la stimolazione dei recettori IgE plasmalemmale, pretrattare le cellule durante la notte con 300 nanogrammi per millilitro di IgE anti-DNP in terreno di coltura standard.

Per preparare l'imaging Fura-2, diluire la soluzione madre di Fura-2 AM in HBSS di calcio a una concentrazione finale di cinque micromolari per preparare il tampone di caricamento. Quindi, miscelare 500 microlitri del tampone di carico con 500 microlitri della sospensione cellulare PMC. Pipettare la miscela nella camera di imaging e incubare le cellule per 20-30 minuti a temperatura ambiente al buio.

Configura il sistema di applicazione a gravità con diverse soluzioni in base al protocollo di stimolazione. Quindi, montare il sistema di applicazione sul tavolino del microscopio invertito. Preparare un obiettivo a immersione in olio ad alta apertura 40X posizionando una piccola goccia di olio da immersione su di esso.

Posizionare la camera di imaging con le celle caricate nel sistema di applicazione e fissarla per evitare movimenti durante la registrazione. Quindi, accendi la luce trasmessa e concentrati sulle celle. Successivamente, avviare il programma di acquisizione delle immagini in modalità di acquisizione fisiologica.

Apri la finestra di configurazione e regola la messa a fuoco e il tempo di acquisizione ottimale. Immagine di un'immagine di riferimento e contrassegna le celle come ROI. Contrassegna l'ultimo ROI in un'area in cui non sono presenti celle e definiscilo come sfondo.

Quindi, completa la configurazione e avvia la misurazione con una velocità di acquisizione di cinque secondi. Quindi, aggiungi le soluzioni al numero di ciclo corretto in base al design dell'esperimento. Per misurare l'aumento della concentrazione intracellulare di calcio indotto dall'antigene, applicare la soluzione siringa-due dopo il ciclo 20 e interrompere la registrazione dopo il ciclo 150.

Per misurare l'aumento della concentrazione intracellulare di calcio indotto dal composto 48/80, applicare la soluzione della siringa tre dopo il ciclo 20 e interrompere la registrazione dopo il ciclo 150. Per misurare l'aumento della concentrazione intracellulare di calcio evocato da SOCE, applicare la soluzione siringa-quattro dopo il ciclo 10, applicare la soluzione siringa-cinque dopo il ciclo 70, applicare la soluzione siringa-quattro dopo il ciclo 120, applicare la soluzione siringa-uno dopo il ciclo 150 e interrompere la registrazione dopo il ciclo 220. Nel programma di acquisizione, premere consecutivamente i pulsanti Start Cutter, Mark All, Convert All, Physiology Measurements, OK, e poi nuovamente OK.

Salva i file come tabelle e pile di immagini per l'analisi offline. Per misurare il rilascio di beta-esosaminidasi, trasferire 100 microlitri di sospensione cellulare per pozzetto in una piastra a 96 pozzetti con fondo a V. Aggiungere 25 microlitri di soluzione di stimolazione o di controllo a ciascun pozzetto.

Quindi, incubare le cellule per 45 minuti a 37 gradi Celsius. Successivamente, interrompere la reazione posizionando la piastra a 96 pozzetti sul ghiaccio per cinque minuti. Quindi, centrifugare la piastra a quattro gradi Celsius per quattro minuti a 120 g.

Trasferire 120 microlitri di surnatante in una piastra a fondo piatto a 96 pozzetti e posizionarla sul ghiaccio. Evitare accuratamente di toccare i pellet delle cellule, ma aspirare completamente il surnatante. Quindi, aggiungere 125 microlitri di tampone di lisi ai pellet cellulari.

Incubare i pellet cellulari per cinque minuti a temperatura ambiente e rimetterli in sospensione dopo l'incubazione mediante pipettaggio ripetuto. Pipettare 25 microlitri della soluzione pNAG da quattro millimolari nei pozzetti necessari di una nuova piastra a fondo piatto da 96 pozzetti. Aggiungere separatamente 25 microlitri di ciascun surnatante e 25 microlitri di ciascun lisato cellulare alla soluzione pNAG preparata.

Incubare i lotti di reazione per un'ora a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, pipettare 150 microlitri di soluzione di arresto in ciascun pozzetto per fermare la reazione. Successivamente, analizzare l'assorbanza della luce del campione di piastra con un lettore di micropiastre a 405 nanometri con riferimento 630 nanometri per la sottrazione automatica dello sfondo.

Nel programma di acquisizione, selezionare la casella Riferimento e nel menu dell'elemento del programma di assorbanza, selezionare 630 nanometri per la sottrazione automatica dello sfondo. Il test di rilascio della beta-esosaminidasi è stato eseguito per testare la capacità delle PMC isolate che subiscono degranulazione in seguito alla reticolazione dei recettori ad alta affinità IgE plasmalemmale o alla stimolazione dei recettori PRB2 di Mrg. Le cellule sono state aggiunte a una piastra a 96 pozzetti con fondo a V e stimolate secondo questo schema per 45 minuti a 37 gradi Celsius.

Dopo la centrifugazione e la rimozione del surnatante, i pellet sono stati lisati. Il contenuto di beta-esosaminidasi dei singoli surnatanti e dei lisati di pellet è stato quindi analizzato in base alle loro reazioni con pNAG durante un'incubazione di un'ora a 37 gradi Celsius. La quantità dei prodotti di reazione è stata rilevata colorimetricamente ed è stata calcolata la percentuale della beta-esosaminidasi rilasciata.

Il rilascio spontaneo è stato molto basso, mentre le risposte a forti stimoli di degranulazione, come la ionomicina 10 micromolari e il composto 48/80 a 50 microgrammi per millilitro, sono state rispettivamente superiori al 40% e al 60%. Le risposte di degranulazione alla stimolazione DNP erano dose-dipendenti nell'intervallo di concentrazione da 10 a 300 milligrammi per millilitro. Insieme, questi dati indicano chiaramente un buon stato funzionale delle PMC isolate.

Utilizzando questa tecnica, si otterrà una popolazione altamente pura di mastociti murini maturi derivati dal peritoneo entro due settimane. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere condizioni sterili durante l'isolamento e la coltura delle cellule per evitare la contaminazione batterica. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come le misurazioni elettrofisiologiche della corrente ionica patch-clamp, al fine di rispondere a ulteriori domande relative alle vie di ingresso del calcio nei mastociti.

Dopo il suo sviluppo, la tecnica di imaging intracellulare del calcio Fura-2 ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della fisiologia delle cellule di massa per esplorare la dipendenza dal calcio della degranulazione dei mastociti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire esperimenti di imaging del calcio Fura-2 e il saggio di degranulazione della beta-esosaminidasi con i mastociti. Non dimenticare che lavorare con i raggi UV può essere pericoloso per gli occhi e la pelle e che è necessario evitare un'esposizione non necessaria durante l'esecuzione di questa procedura.