Name: Combinando optogenetica con microRNA artificiali per caratterizzare gli effetti del Gene atterramento su funzione presinaptica allinterno di circuiti neuronali intatto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Scopri come combinare microRNA artificiali con optogenetica per caratterizzare gli effetti del silenziamento genico sulla funzione presinaptica in circuiti neuronali intatti. Questo metodo consente di studiare la trasmissione sinaptica in fette cerebrali acute.

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Ringraziamo F. Benfenati (Istituto Italiano di Tecnologia, IIT) per supporto e Carmela Vitale per aiutare con la dimostrazione. Questo lavoro è stato finanziato da IIT e la Compagnia di San Paolo (concessione n. 9734 al LAC).

<ol><li>Lam, J. K., Chow, M. Y., Zhang, Y., Leung, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((siRNA+Versus+miRNA+as+Therapeutics+for+Gene+Silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther-Nucl+Acids%22%5BJournal%5D)">siRNA Versus miRNA as Therapeutics for Gene Silencing.</a> Mol Ther-Nucl Acids. 4, e252(2015).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Co-espressione di una sonda di optogenetica e un miR contro un gene presinaptico di interesse offre un approccio potente per caratterizzare l'effetto di atterramento di gene sulla funzione presinaptica all'interno di circuiti neuronali intatti. Per questo approccio sperimentale, è importante identificare e caratterizzare miRs che sono altamente efficienti e selettivi nell'abbattere il gene di interesse in sistemi nativi. Se possibile, due o più indipendenti miRs contro stesso mRNA di interesse deve essere utilizzato per controllo per eventuali effetti fuori bersaglio. Esperimenti di salvataggio, in cui un gene miR-resistente viene reintrodotto nel sistema, possono essere utilizzati come controllo per specificità.
Utilizzando lo stesso costrutto per esprimere un optogenetica sonda e un miR consente per stimolare otticamente solo i neuroni presinaptici che sono stati manipolati. Questo non è possibile con gli stimoli elettrici perché essi non fanno distinzione tra neuroni infetti e non infetti, così producendo risultati misti e diluiti. Perché stimolazioni ottiche possono indurre più potenziali d'azione15, è importante scegliere solo le sonde più veloci di optogenetica, tra un'espansione tavolozza15,19,20,21. Inoltre, è essenziale per garantire che la stimolazione ottica non induce una depolarizzazione diretta dei boutons presinaptici, per evitare di ignorare alcuni dei passaggi della trasmissione sinaptica si vuole indagare22.
L'approccio sperimentale che descriviamo qui, rende possibile valutare in parallelo la rilevanza fisiologica dei geni multipli presinaptici di interesse all'interno di un periodo di tempo limitato (4 – 6 mesi). Tuttavia, è importante tenere a mente che atterramenti raramente raggiungono il 100%. Inoltre, rAAVs bisogno di essere espresso per almeno due settimane consentire massima espressione di atterramento e completo della sonda optogenetica, che può rappresentare un vincolo di tempo durante l'analisi di processi di sviluppo precoce. Anche se più topi knockout richiede tempo, condizionale limitati ai neuroni presinaptici, provocano generalmente completa rimozione del gene di interesse e offrono pertanto un valido approccio complementare.
Un vantaggio specifico della tecnologia miR è che permette l'espressione di Mir multiple dal promotore stesso. Questa proprietà è stata utilizzata principalmente per aumentare l'efficienza di atterramento con l'inserimento di più copie della stessa miR o miRs diverse contro lo stesso gene bersaglio. Può tuttavia essere utilizzata anche per atterramento geni multipli esprimendo miRs contro diversi target geni7,23. Questa proprietà potrebbe essere utilizzata per mettere a tacere più proteine presinaptiche per sezionare le vie di segnalazione presinaptiche.
Qui, abbiamo combinato optogenetica con artificiale miRs per caratterizzare gli effetti di atterramento di gene sulla funzione presinaptica in fettine ippocampali acute. Un simile approccio potrebbe essere utilizzato anche per manipolare e sonda circuito neuronale in vivo. Inoltre, combinando miRs artificiale con chemogenetic approcci consentirebbe uno interrogare i circuiti neuronali su scale di tempo più lungo.

Questo protocollo descrive un nuovo approccio per caratterizzare l'effetto di atterramento di gene sulla funzione presinaptica all'interno di circuiti neuronali intatti. Indagando funzione presinaptica in circuiti neuronali intatti è difficile perché molte boutons presinaptici sono troppo piccoli e lontano dal soma per consentire interventi combinati elettrofisiologici e molecolari. Anche se l'interferenza del RNA offre uno strumento potente e flessibile per atterramento proteine sinaptiche1, questo approccio è stato usato con parsimonia per indagare la funzione presinaptica perché è difficile da rilevare gli effetti di atterramento utilizzando tradizionali gli stimoli elettrici, che non fanno distinzione tra manipolato e ingenuo boutons presinaptici2. Qui, descriviamo come combinare artificiale microRNA (miR)-mediata di interferenza del RNA con optogenetica recentemente sviluppato la tecnologia per ottenere stimolazione selettiva dei boutons presinaptici manipolato nelle fette del cervello acuto.
Mentre topi knockout condizionale in combinazione con elettrofisiologia potrebbero anche essere usati per studiare la funzione di proteine presinaptiche3,4, la nostra strategia non richiede lo sviluppo e la manutenzione di geneticamente modificato mouse linee e può essere facilmente impiegato anche per abbattere isoforme specifiche di un gene. Relativo a più comunemente usate breve tornante RNAs (shRNA), miRs artificiale, che impieghiamo qui, offrono vantaggi chiave per atterramento in neuroni. A differenza di shRNA, possono essere espressi sotto il controllo di una polimerasi II promotore1. Così, un singolo promotore può essere utilizzato per guidare l'espressione di miR e di una sonda di optogenetica, insieme a un reporter fluorescente. In questo modo, la dimensione del costrutto può essere mantenuta entro i limiti di imballaggio dei ricombinanti virus adeno-associato (rAAV, Figura 1A). Inoltre, l'uso di un singolo costrutto e un singolo promotore riduce la variabilità sperimentale perché permette per l'espressione di miR, la sonda optogenetica e il reporter fluorescente in un rapporto fisso.
Recentemente abbiamo applicato questa tecnologia per esaminare il ruolo delle isoforme alternativamente impiombate dei canali del calcio presinaptici in ippocampo5. Tale strategia è generalmente applicabile a studiare la rilevanza fisiologica delle altre proteine presynaptically espresse in qualsiasi circuito del cervello di interesse.

<table><tbody><tr><td>Acrilammide</td><td>Sigma</td><td>Acrilammide/Bis-acrilammide, soluzione al 30%</td><td></td></tr><tr><td>Regolatore di temperatura animale tossico con cuscinetto termico</td><td>WPI</td><td>ATC2000</td><td></td></tr><tr><td>Kit per il dosaggio delle proteine BCA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>BLOCK-iT Pol II miR RNAi Expression Vector Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K4936-00</td><td></td></tr><tr><td>Fette di cervello Precamera</td><td>Imager basato su telecamera CCD Harvard Apparatus</td><td>BSC-PC</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Bio-Rad</td><td>ChemiDoc&trade; Reagenti per</td> colture cellulari MP <td></td></tr><tr><td></td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Substrato chemiluminescente</td><td>GE Helthcare</td><td>ECL Western Blotting Reagenti, RPN2106</td><td></td></tr><tr><td>cloroformio</td><td>Sigma</td><td>C2432</td><td>Citosina tossica</td></tr><tr><td>&beta;-D-arabinofuranoside</td><td>Sigma</td><td>C6645</td><td></td></tr><tr><td>Drill</td><td>Foredom</td><td>K.1030</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Unguento alla gentamicina</td><td>Farmacia</td><td></td><td></td>locale</tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>54459</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette per iniezione</td><td>Narishige</td><td>GD1</td><td></td></tr><tr><td>Sali inorganici e detergenti</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>K2- creatina fosfato</td><td>Calbiochem</td><td>237911</td><td></td></tr><tr><td>KGluconato</td><td>Fluka</td><td>60245</td><td></td></tr><tr><td>Laser</td><td>Laserglow Technologies</td><td>LRS-0473-GFM-00100-03</td><td></td></tr><tr><td>Membrana</td><td>Amersham</td><td>Protran&trade; 0.2 &; m NC</td><td></td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Supporto per micropipette</td><td>Narishige</td><td>IM-H1</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore per micropipette</td><td>Narishige</td><td>PC-100</td><td></td></tr><tr><td>Na3GTP</td><td>Sigma</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>NaPyruvate</td><td>Sigma</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>Lubrificante oculare</td><td>Farmacia locale</td><td>Lacrigel</td><td></td></tr><tr><td>Inibitori dei fosfati</td><td>Sigma</td><td>P0044, P5726</td><td></td></tr><tr><td>Inibitori della proteasi</td><td>Sigma</td><td>cOmplete&trade;, Cocktail di inibitori della proteasi senza EDTA Dispositivi</td><td></td></tr> per <tr><td>elettroforesi e blotting su gel proteico</td><td>Bio-Rad</td><td>Mini-Protean III Cell</td><td></td></tr><tr><td>Providone iodio</td><td>Farmacia locale</td><td>Betadine</td><td></td></tr><tr><td>Qiazol lysis Reagent</td><td>Qiagen</td><td>79306</td><td>Kit</td></tr> di <tr><td>trascrizione QuantiTect Reverse </td><td>Qiagen</td><td>205311</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Apparecchio stereotassico</td><td>WPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tetrodotossina</td><td>Tocris</td><td>1069</td><td>Tossico</td></tr><tr><td>Vibratomo</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td></td></tr></tbody></table>

combinando optogenetica con microrna artificiali per caratterizzare gli effetti del gene atterramento su funzione presinaptica all'interno di circuiti neuronali intatto

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

Lo scopo del presente protocollo è quello di caratterizzare l'effetto di atterramento di gene sulla funzione presinaptica all'interno di circuiti neuronali intatti. Descriviamo un flusso di lavoro su come combinare artificiale microRNA (miR)-mediata di interferenza del RNA con optogenetica raggiungere stimolazione selettiva dei boutons presinaptici manipolato nelle fette del cervello acuto. L'approccio sperimentale prevede l'utilizzo di un singolo costrutto virale e un singolo promotore di neurone-specific per guidare l'espressione di un optogenetica sonda e il miR(s) artificiale contro geni presinaptici. Quando stereotactically iniettato nella regione del cervello di interesse, il costrutto espresso rende possibile stimolare con luce esclusivamente i neuroni con ridotta espressione dei geni sotto indagine. Questa strategia non richiede lo sviluppo e la manutenzione delle linee di topi geneticamente modificati per e in linea di principio può essere applicata ad altri organismi e per ogni gene di un neurone di scelta. Recentemente abbiamo applicato per indagare come l'atterramento di isoforme di splicing alternativo dei canali tensione-gated del calcio di tipo P/Q presinaptici (VGCCs) regola la plasticità sinaptica a breve termine presso CA3 di sinapsi eccitatorie CA1 nelle fette hippocampal acute. Un simile approccio potrebbe essere utilizzato anche per manipolare e sonda il circuito neuronale in vivo.

Le procedure sopra descritte forniscono un metodo affidabile per valutare la trasmissione sinaptica come risente l'atterramento di proteine sinaptiche nei neuroni presinaptici. Risultati rappresentativi su come l'atterramento di alternativa della giuntura isoforme di presinaptici Cav2.1 VGCCs (tipo P/Q) regola la plasticità sinaptica a breve termine presso CA3 di CA1 sinapsi eccitatorie sono riportate di seguito come esempio.
CAv2.1 (P/Q-type) canali sono il VGCCs presinaptici predominante a più veloce sinapsi nel sistema nervoso centrale. Alternativi di splicing degli esoni mutuamente esclusivi 37a e 37b della subunità1 poro-formare α della Cav2.1 (α1A) produce due varianti principali, Cav2.1 [EFa] e Cav2.1 [EFb]16,17 ,18. Per determinare se Cav2.1 [EFa] e Cav2.1 [EFb] differenziale regolano trasmissione sinaptica e la plasticità in neuroni piramidali hippocampal del ratto, abbiamo sviluppato in primo luogo miRs isoforma-specifici per atterramento selettivamente Cav 2.1 [EFa] o Cav2.1 [EFb]5. Malgrado il formato breve (97 bp) e alta somiglianza (61,86% identità a livello del nucleotide) tra gli esoni 37a e 37b, potremmo progettare tre sequenze di miR contro ratto Cav2.1 [EFa] (miR EFa1: TCCTTATAGTGAATGCGGCCG; miR EFa2: ATGTCCTTATAGTGAATGCGG; miR EFa3: TTGCAAGCAACCCTATGAGGA) e due contro ratto Cav2.1 [EFb] (miR EFb1: ATACATGTCCGGGTAAGGCAT; miR EFb2: ATCTGATACATGTCCGGGTAA) con predetto ad alta efficienza di atterramento. Come controllo negativo (miR controllo), abbiamo usato il plasmide pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg contenente una sequenza che non mira ad alcun gene di vertebrati conosciuti. Basato su una prima schermata in cellule HEK 293 contro eterologhe canali, abbiamo selezionato miR EFa1, miR EFa3 e miR EFb2 e clonato loro cassette di espressione nel 3' UTR del vettore pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X, che è stato progettato per la produzione di rAAVs e dove la promotore della sinapsina unità espressione della channelrhodopsin ultraveloce ChETA, la proteina fluorescente rossa TdTomato e il miR inserito (Figura 1). Abbiamo anche ripetuto la cassetta di espressione di miR EFb2 per aumentare l'efficienza atterramento di questo miR.
Successivamente, abbiamo preparato rAAV1/2 per i costrutti di quattro sopra e quantificati loro atterramento efficienza e selettività in colture neuronali primarie del ratto usando isoforma-specifici qRT-PCR. miR EFa1 e miR EFa3 ridotto mRNA di nativo Cav2.1 [EFa] ~ 70% ma non quella di Cav2.1 [EFb], mentre miR EFb ridotto mRNA di nativo Cav2.1 [EFb] ~ 60% ma non quella di Cav2.1 [EFa] (Figura 2).
Abbiamo quindi stereotactically iniettato ognuna delle quattro rAAV1/2 nella zona CA3 dell'ippocampo dei ratti P18 (Figura 3A-C), con le coordinate di −2.6 (A-P/M-L/D-V da Bregma) / ± 2,9 / −2.9. Post-iniezione di quindici a venti-quattro giorni, abbiamo preparato acute fette hippocampal dai ratti rAAV1/2-iniettato e usato TdTomato fluorescenza per confermare l'espressione e la localizzazione di rAAVs (Figura 3B). Per studiare se presinaptico atterramento di Cav2.1 [EFa] o Cav2.1 [EFb] interessato plasticità sinaptica a breve termine presso CA3 alle sinapsi CA1, abbiamo stimolato infettati selettivamente neuroni CA3 con breve 473 nm luce impulsi laser (2 ms-lungo ; Figura 3) e registrato l'EPSC risultante dalla rattoppatura neuroni piramidali in prossimale al tratto mediale della regione CA1 (Figura 3). Abbiamo trovato che l'atterramento di isoforme di splicing di Cav2.1 influenzato le risposte alla stimolazione di accoppiare-impulso in direzioni opposte: atterramento di Cav2.1 [EFa] (miR EFa1 o miR EFa3) potenziato facilitazione di accoppiare-impulso (PPF) mentre atterramento di Ca v2.1 [EFb] (miR EFb2) abolita (Figura 3D, E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57223/57223fig1.jpg"> Figura 1: Schema dei costrutti per l'espressione combinata della sonda ultraveloce optogenetica ChETA e miRs isoforma-specifici contro Cav2.1 [EFa] e Cav2.1 [EFb]. (A) mappa della rAAV costruire pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X, contenente un promotore della sinapsina (Syn), il channelrhodopsin ultraveloce ChETA fusa per TdTomato e, nel prossimale 3' UTR, un miR isoforma-specifici di Cav2.1 della giuntura. Enzimi di restrizione mostrati sono singole frese. (B) schema Top, di cassetta di espressione. Il promotore della sinapsina unità espressione di ChETA-TdTomato e di un miR isoforma-specifici. Fondo, complemento inverso delle sequenze bersaglio di 21 nucleotidi, che formano parte della cassetta miR. Per miR EFb2 due cassette di miR identici sono stati espressi in tandem, uno dopo l'altro. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57223/57223fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57223/57223fig2.jpg"> Nella figura 2. Valutazione dell'efficienza di atterramento e selettività dell'isoforma-specifici miRs per Cav2.1 [EFa] e Cav2.1 [EFb]. Analisi specifica isoforma qRT-PCR su RNA isolato da colture primarie di 17-18 DIV infettati a 6 DIV rAAVs esprimendo miRs targeting sia Cav2.1 [EFa] (miR EFa1 e miR EFa3) o Cav2.1 [EFb] (miR EFb2). I dati vengono normalizzati per il controllo negativo (miR controllo). miR EFa1 e miR EFa3 significativamente e selettivamente ridurre mRNA di Cav2.1 [EFa] (n = 8 e 7 culture, rispettivamente), mentre miR EFb significativamente e in modo selettivo riduce mRNA di Cav2.1 [EFb] (n = 4 culture; * * * p &lt; 0,001; unidirezionale analisi di test della varianza seguita dal post-test di Tukey-Kramer). I dati sono presentati come media ± SEM Questa figura è stata adattata da Thalhammer, a. et al. 5. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57223/57223fig2large.jpg" target="_blank">per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57223/57223fig3.jpg"> Nella figura 3. Valutazione del ruolo di Cav2.1 [EFa] e Cav2.1 [EFb] nell'ippocampo nativo di mirati stimolazione dei neuroni abbattuto con optogenetica. (A) schema della cassetta espressione dei costrutti rAAV usati per l'infezione in vivo . (B) sezione Hippocampal risultati quello fluorescenza TdTomato è limitata alla regione CA3 e le sue proiezioni. Configurazione sperimentale (C) : raggio laser è stata convogliata sulla CA3 somata e patch morsetto registrazioni sono state eseguite da neuroni piramidali CA1. (D) 2 ms-lungo blu (473 nm) impulsi di luce laser ha brillati a 20 Hz evocano EPSC cui PPF è aumentato del miRs Cav2.1 [EFa] di targeting e abolito da miR per Cav2.1 [EFb]. (E) Riepilogo del rapporto di accoppiare-impulso per esperimenti come in (D), mostrando un aumento in PPF per miR EFa1 e miR EFa3 e una diminuzione per miR EFb2, relativo a miR controllo (n = 9-11 registrazioni; * p = 0,02; * * p = 0,01; * * * p &lt; 0,0004; analisi della covarianza). I dati sono presentati come media ± SEM Questa figura è stata adattata da Thalhammer, a. et al. 5. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57223/57223fig3large.jpg" target="_blank">per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro su come combinare artificiale microRNA-mediata RNA interference con optogenetica per stimolare specificamente i boutons presinaptici con ridotta espressione dei geni selettivi all'interno di circuiti neuronali intatti.

Combinando optogenetica con microRNA artificiali per caratterizzare gli effetti del Gene atterramento su funzione presinaptica all'interno di circuiti neuronali intatto

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

L'obiettivo generale della combinazione dell'interferenza dell'RNA mediata da microRNA artificiali con l'optogenetica è quello di caratterizzare l'effetto del knockdown genico sulla funzione presinaptica all'interno di circuiti neuronali intatti. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della fisiologia sinaptica, come affrontare il ruolo fisiologico delle proteine presinaptiche nei circuiti cerebrali intatti. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente di monitorare selettivamente la trasmissione sinaptica in corrispondenza di neuroni con ridotta espressione della proteina presinaptica in esame.Inoltre, abbiamo utilizzato questo metodo per studiare la funzione presinaptica nelle fette cerebrali acute. Può anche essere applicato per manipolare e sondare la sicurezza neuronale in vivo. A dimostrare la procedura sarà Carmela Vitale, una studentessa laureata del nostro laboratorio.Dopo aver progettato i microRNA e costruito un vettore ricombinante per esprimere i microRNA e la sonda optogenetica, preparare colture neuronali primarie dalla regione cerebrale di interesse. Per fare ciò, seguire un protocollo di corticocoltura stabilito da L.A.Cingolani and Company con le seguenti modifiche. Innanzitutto, utilizzare piastre a sei pozzetti, piastre mezzo milione di neuroni per pozzetto e utilizzare 2,5 millilitri di terreno di attacco per pozzetto.Dopo aver incubato la piastra per quattro ore, passare a 3,3 millilitri di terreno di mantenimento per pozzetto e, se si osserva una crescita eccessiva di astrociti, aggiungere 0,5 millilitri di terreno di mantenimento integrato con 7,5 micromolari di AraC a tre o quattro DIV. A cinque o sei DIV, infettare tre pozzetti per ogni microRNA da testare. Utilizzare la dose infettiva più bassa che infetterà almeno il 99% dei neuroni.Aggiungere il virus direttamente ai neuroni, mescolare delicatamente e rimettere le piastre nell'incubatore a 37 gradi Celsius. A 17-18 DIV, lisare i neuroni per un'estrazione dell'RNA. Inclinare le piastre e utilizzare pipette di vetro per rimuovere tutto il terreno da ciascun pozzetto.Quindi, aggiungere immediatamente 700 microlitri di reagente di lisi a ciascun pozzetto. Dopo una breve miscelazione, trasferire il lisato cellulare fuori da ciascun pozzetto e in provette separate da 1,5 millilitri. Quindi, aggiungere 140 microlitri di cloroformio a ciascun lisato.Tappare rapidamente e agitare energicamente i tubi per 15 secondi per emulsionare il contenuto. Quindi, centrifugare le provette a 12.000 volte G per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi, trasferire con cura la fase acquosa superiore contenente l'RNA in una nuova provetta.Non lasciare che la punta della pipetta tocchi la fase organica. Alla fase acquosa aggiungere 1,5 volumi di etanolo al 100% e pipettare lentamente la soluzione tre volte per mescolare. Quindi, purificare l'RNA utilizzando un kit disponibile in commercio e quantificare le rese.Aspettatevi almeno 3,5 microgrammi per campione. I rapporti di purezza tra proteine e composti organici dovrebbero essere entrambi almeno 1,9. Quindi, usa un kit per retrotrascrivere 250, 500 o 1.000 nanogrammi di RNA.Quindi, quantificare l'efficienza di knockdown per il gene endogeno di interesse mediante RTPCR quantitativo. Puntare a un'efficienza di knockdown di almeno il 60%Per questo protocollo, utilizzare un animale a cui 15 giorni prima o più era stato iniettato RAAV12 nel cervello secondo un protocollo precedentemente pubblicato da A.Cetin and Company. Isolare il cervello e fare fette acute di cervello con un vibratomo e ACFF ghiacciato gassato.Raccogli le fette della regione di interesse e riduci al minimo la loro esposizione alla luce per evitare l'attivazione della sonda optogenetica. Lasciate riposare le fette per 30 minuti a 37 gradi Celsius nello stesso ACFF. Usa una camera appositamente progettata per contenere fette di cervello.Quindi, riporta le fette a temperatura ambiente, dove rimarranno sane per sei-otto ore. Per procedere, trasferirne una fetta nella camera di registrazione e superfonderla a due millilitri al minuto di ACFF. Successivamente, controllare brevemente il segnale del reporter fluorescente espresso per accertare la localizzazione e l'intensità dell'infezione.Quindi, riempire un elettrodo patch con la soluzione intracellulare. Ora, sotto l'illuminazione a infrarossi, è possibile ottenere una configurazione all'ingrosso a tenuta stagna su un neurone che riceve input sinaptici dai neuroni infetti. La resistenza in serie può essere lasciata non compensata, ma dovrebbe essere costante e bassa.Ad esempio, se i neuroni piramidali CA3 sono stati infettati, rattoppare i neuroni piramidali nel tratto prossimale e mediale della regione CA1. Quando le celle iniziano a sembrare rimpicciolite o gonfie, quando il patching diventa difficile o i lotti sono instabili, le sezioni selezionate non sono più abbastanza sane per la registrazione. Successivamente, utilizzare la farmacologia per isolare le correnti sinaptiche oggetto di indagine.Ad esempio, se l'obiettivo è quello di studiare la trasmissione sinaptica eccitatoria, bloccare la trasmissione sinaptica inibitoria aggiungendo bicucullina al bagno. Quindi, evocare correnti sinaptiche, come le correnti postsinaptiche eccitatorie, utilizzando un laser blu a 473 nanometri accoppiato a una fibra ottica posizionata sui somati dei neuroni infetti. Non dirigere il laser sugli assoni dei neuroni.Ad esempio, evita di far luce sui collaterali Shaffer. La depolarizzazione diretta degli assoni non è desiderabile. Quindi, regolare la lunghezza della stimolazione al minimo per ridurre la possibilità di evocare più di un potenziale d'azione per impulso luminoso.Successivamente, affina l'intensità del laser per evocare una corrente sinaptica piccola ma chiaramente rilevabile. Ad esempio, per la trasmissione sinaptica eccitatoria tra i neuroni piramidali CA3 e CA1, regolare l'intensità del laser per evocare correnti sinaptiche da 20 a 50 picoampere. Al termine dell'esperimento, applicare tetrodotossina a 0,5 micromolari per bloccare i canali del sodio.La sensibilità delle correnti evocate otticamente alla tetrodotossina indica che sono guidate dal potenziale d'azione. Continua a raccogliere dati fino a quando almeno otto neuroni sono stati patchati per una determinata condizione da almeno tre animali diversi. Questi sono i dati minimi necessari per analizzare i risultati.Utilizzando il metodo descritto, sono state abbattute isoforme alternative di splicing dei canali del calcio voltaggio-dipendenti di tipo P/Q presinaptico. Si ritiene che questi canali regolino la plasticità sinaptica a breve termine nelle sinapsi eccitatorie da CA3 a CA1. Sono stati realizzati quattro diversi costrutti che esprimono microRNA isoforma-specifici; ciascuno è stato espresso insieme a un canale ultraveloce rodopsina insieme alla proteina fluorescente Td-Tomato.In primo luogo, è stato confermato che ogni costrutto ha un'efficienza di knockdown e una selettività sufficienti in colture neuronali primarie di ratto utilizzando RTPCR quantitativo isoforma-specifico. Successivamente, ogni costrutto è stato iniettato nell'ippocampo di ratti P18. In definitiva, l'effetto dei costrutti sulla plasticità sinaptica a breve termine nelle sinapsi CA3-CA1 è stato studiato stimolando i neuroni piramidali CA3 infetti con brevi impulsi di luce a 473 nanometri e registrando le EPSC risultanti in configurazione all'ingrosso da neuroni piramidali della regione CA1.Il knockdown di diverse isoforme di splicing ha influenzato le risposte alla stimolazione dell'impulso accoppiato in direzioni opposte. Knockdown dell'isoforma A potenziata dalla facilitazione dell'impulso accoppiato; mentre l'abbattimento dell'isoforma B l'ha abolita. La combinazione di interferenze dell'RNA e l'optogenetica consente alla ricerca nel campo della fisiologia sinaptica di esplorare come le proteine presinaptiche regolano la plasticità sinaptica a breve termine nei circuiti intatti.Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come convalidare i microRNA per l'interferenza dell'RNA e come combinarli con l'optogenetica per studiare la trasmissione sinaptica in fette cerebrali acute.

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Combinando optogenetica con microRNA artificiali per caratterizzare gli effetti del Gene atterramento su funzione presinaptica allinterno di circuiti neuronali intatto (Video) | JoVE Journal

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