Combinando optogenetica con microRNA artificiali per caratterizzare gli effetti del Gene atterramento su funzione presinaptica all'interno di circuiti neuronali intatto

L'obiettivo generale della combinazione dell'interferenza dell'RNA mediata da microRNA artificiali con l'optogenetica è quello di caratterizzare l'effetto del knockdown genico sulla funzione presinaptica all'interno di circuiti neuronali intatti. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della fisiologia sinaptica, come affrontare il ruolo fisiologico delle proteine presinaptiche nei circuiti cerebrali intatti. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente di monitorare selettivamente la trasmissione sinaptica in corrispondenza di neuroni con ridotta espressione della proteina presinaptica in esame.

Inoltre, abbiamo utilizzato questo metodo per studiare la funzione presinaptica nelle fette cerebrali acute. Può anche essere applicato per manipolare e sondare la sicurezza neuronale in vivo. A dimostrare la procedura sarà Carmela Vitale, una studentessa laureata del nostro laboratorio.

Dopo aver progettato i microRNA e costruito un vettore ricombinante per esprimere i microRNA e la sonda optogenetica, preparare colture neuronali primarie dalla regione cerebrale di interesse. Per fare ciò, seguire un protocollo di corticocoltura stabilito da L.A.Cingolani and Company con le seguenti modifiche. Innanzitutto, utilizzare piastre a sei pozzetti, piastre mezzo milione di neuroni per pozzetto e utilizzare 2,5 millilitri di terreno di attacco per pozzetto.

Dopo aver incubato la piastra per quattro ore, passare a 3,3 millilitri di terreno di mantenimento per pozzetto e, se si osserva una crescita eccessiva di astrociti, aggiungere 0,5 millilitri di terreno di mantenimento integrato con 7,5 micromolari di AraC a tre o quattro DIV. A cinque o sei DIV, infettare tre pozzetti per ogni microRNA da testare. Utilizzare la dose infettiva più bassa che infetterà almeno il 99% dei neuroni.

Aggiungere il virus direttamente ai neuroni, mescolare delicatamente e rimettere le piastre nell'incubatore a 37 gradi Celsius. A 17-18 DIV, lisare i neuroni per un'estrazione dell'RNA. Inclinare le piastre e utilizzare pipette di vetro per rimuovere tutto il terreno da ciascun pozzetto.

Quindi, aggiungere immediatamente 700 microlitri di reagente di lisi a ciascun pozzetto. Dopo una breve miscelazione, trasferire il lisato cellulare fuori da ciascun pozzetto e in provette separate da 1,5 millilitri. Quindi, aggiungere 140 microlitri di cloroformio a ciascun lisato.

Tappare rapidamente e agitare energicamente i tubi per 15 secondi per emulsionare il contenuto. Quindi, centrifugare le provette a 12.000 volte G per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi, trasferire con cura la fase acquosa superiore contenente l'RNA in una nuova provetta.

Non lasciare che la punta della pipetta tocchi la fase organica. Alla fase acquosa aggiungere 1,5 volumi di etanolo al 100% e pipettare lentamente la soluzione tre volte per mescolare. Quindi, purificare l'RNA utilizzando un kit disponibile in commercio e quantificare le rese.

Aspettatevi almeno 3,5 microgrammi per campione. I rapporti di purezza tra proteine e composti organici dovrebbero essere entrambi almeno 1,9. Quindi, usa un kit per retrotrascrivere 250, 500 o 1.000 nanogrammi di RNA.

Quindi, quantificare l'efficienza di knockdown per il gene endogeno di interesse mediante RTPCR quantitativo. Puntare a un'efficienza di knockdown di almeno il 60%Per questo protocollo, utilizzare un animale a cui 15 giorni prima o più era stato iniettato RAAV12 nel cervello secondo un protocollo precedentemente pubblicato da A.Cetin and Company. Isolare il cervello e fare fette acute di cervello con un vibratomo e ACFF ghiacciato gassato.

Raccogli le fette della regione di interesse e riduci al minimo la loro esposizione alla luce per evitare l'attivazione della sonda optogenetica. Lasciate riposare le fette per 30 minuti a 37 gradi Celsius nello stesso ACFF. Usa una camera appositamente progettata per contenere fette di cervello.

Quindi, riporta le fette a temperatura ambiente, dove rimarranno sane per sei-otto ore. Per procedere, trasferirne una fetta nella camera di registrazione e superfonderla a due millilitri al minuto di ACFF. Successivamente, controllare brevemente il segnale del reporter fluorescente espresso per accertare la localizzazione e l'intensità dell'infezione.

Quindi, riempire un elettrodo patch con la soluzione intracellulare. Ora, sotto l'illuminazione a infrarossi, è possibile ottenere una configurazione all'ingrosso a tenuta stagna su un neurone che riceve input sinaptici dai neuroni infetti. La resistenza in serie può essere lasciata non compensata, ma dovrebbe essere costante e bassa.

Ad esempio, se i neuroni piramidali CA3 sono stati infettati, rattoppare i neuroni piramidali nel tratto prossimale e mediale della regione CA1. Quando le celle iniziano a sembrare rimpicciolite o gonfie, quando il patching diventa difficile o i lotti sono instabili, le sezioni selezionate non sono più abbastanza sane per la registrazione. Successivamente, utilizzare la farmacologia per isolare le correnti sinaptiche oggetto di indagine.

Ad esempio, se l'obiettivo è quello di studiare la trasmissione sinaptica eccitatoria, bloccare la trasmissione sinaptica inibitoria aggiungendo bicucullina al bagno. Quindi, evocare correnti sinaptiche, come le correnti postsinaptiche eccitatorie, utilizzando un laser blu a 473 nanometri accoppiato a una fibra ottica posizionata sui somati dei neuroni infetti. Non dirigere il laser sugli assoni dei neuroni.

Ad esempio, evita di far luce sui collaterali Shaffer. La depolarizzazione diretta degli assoni non è desiderabile. Quindi, regolare la lunghezza della stimolazione al minimo per ridurre la possibilità di evocare più di un potenziale d'azione per impulso luminoso.

Successivamente, affina l'intensità del laser per evocare una corrente sinaptica piccola ma chiaramente rilevabile. Ad esempio, per la trasmissione sinaptica eccitatoria tra i neuroni piramidali CA3 e CA1, regolare l'intensità del laser per evocare correnti sinaptiche da 20 a 50 picoampere. Al termine dell'esperimento, applicare tetrodotossina a 0,5 micromolari per bloccare i canali del sodio.

La sensibilità delle correnti evocate otticamente alla tetrodotossina indica che sono guidate dal potenziale d'azione. Continua a raccogliere dati fino a quando almeno otto neuroni sono stati patchati per una determinata condizione da almeno tre animali diversi. Questi sono i dati minimi necessari per analizzare i risultati.

Utilizzando il metodo descritto, sono state abbattute isoforme alternative di splicing dei canali del calcio voltaggio-dipendenti di tipo P/Q presinaptico. Si ritiene che questi canali regolino la plasticità sinaptica a breve termine nelle sinapsi eccitatorie da CA3 a CA1. Sono stati realizzati quattro diversi costrutti che esprimono microRNA isoforma-specifici; ciascuno è stato espresso insieme a un canale ultraveloce rodopsina insieme alla proteina fluorescente Td-Tomato.

In primo luogo, è stato confermato che ogni costrutto ha un'efficienza di knockdown e una selettività sufficienti in colture neuronali primarie di ratto utilizzando RTPCR quantitativo isoforma-specifico. Successivamente, ogni costrutto è stato iniettato nell'ippocampo di ratti P18. In definitiva, l'effetto dei costrutti sulla plasticità sinaptica a breve termine nelle sinapsi CA3-CA1 è stato studiato stimolando i neuroni piramidali CA3 infetti con brevi impulsi di luce a 473 nanometri e registrando le EPSC risultanti in configurazione all'ingrosso da neuroni piramidali della regione CA1.

Il knockdown di diverse isoforme di splicing ha influenzato le risposte alla stimolazione dell'impulso accoppiato in direzioni opposte. Knockdown dell'isoforma A potenziata dalla facilitazione dell'impulso accoppiato; mentre l'abbattimento dell'isoforma B l'ha abolita. La combinazione di interferenze dell'RNA e l'optogenetica consente alla ricerca nel campo della fisiologia sinaptica di esplorare come le proteine presinaptiche regolano la plasticità sinaptica a breve termine nei circuiti intatti.

Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come convalidare i microRNA per l'interferenza dell'RNA e come combinarli con l'optogenetica per studiare la trasmissione sinaptica in fette cerebrali acute.