Riconfigurabile microfluidici canale con Pin-discretizzati fianchi

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di fabbricare un dispositivo microfluidico riconfigurabile con pareti laterali costituite da una serie di pin. Il vantaggio principale di questo dispositivo microfluidico è la sua capacità di gestire oggetti difficili da far scorrere e situazioni che potrebbero essere sconosciute nella fase di progettazione del canale. In generale, le persone che non conoscono questo metodo faranno fatica a incidere piccoli spilli nelle forme delle ossa di cane.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto l'assemblaggio di molte parti microfluidiche e il loro montaggio sulla base sono difficili da apprendere solo dal protocollo scritto. Questa foto è del dispositivo microfluidico completato con un canale riconfigurabile. In questo caso, la parte riconfigurabile si trova lungo la parte superiore dell'immagine.

Uno schema esploso rivela alcuni dei suoi componenti principali. In particolare, notare il microcanale e i pin utilizzati per la riconfigurazione. Come primo passo, incidi i perni.

Inizia con perni sgrassati, spessi 0,3 millimetri, a forma di L, in acciaio inossidabile di diverse lunghezze. Tenete pronti quattro millilitri di acido nitrico al 10% e immergetevi i perni. Quindi, metti il contenitore in un forno a 65 gradi Celsius per 30 minuti.

Dopo aver recuperato gli spilli, trasferiteli con una pinzetta uno ad uno in un contenitore di acqua deionizzata. Quindi, sonicali nell'acqua per cinque minuti. Al termine, asciugateli con carta assorbente.

Tenere a portata di mano 0,5 millilitri di distaccante e immergervi i perni. Dopo due ore, mettere i perni in acqua deionizzata e sonicarli per cinque minuti. Per continuare è necessario un piatto di incisione.

La piastra per incisione è realizzata in vetro e adesivo siliconico. Inizia il processo di incisione erogando adesivo siliconico per le estremità dei perni sul piatto. Posiziona i perni in modo che le punte sulle loro estremità diritte siano immerse nell'adesivo.

Questo è il piatto dopo che tutti i perni sono in posizione e pronti per il passaggio successivo. Trasferire il piatto di incisione in un fermentatore umidificato riscaldato a 38 gradi Celsius e attendere una notte per polimerizzare l'adesivo. Quando è pronto, posizionare la pirofila con gli spilli su una piastra a 65 gradi Celsius.

Versare 0,8 millilitri di acido mordenzante sulla regione scoperta dei perni. Dopo 10 minuti, trasferire l'acido in un becher utilizzando un micropipettatore. Quindi, aggiungere altro acido mordenzante al piatto per ripetere la fase di incisione.

Dopo l'incisione, verificare che la larghezza della regione incisa sia di circa 0,2 millimetri. In tal caso, micropipettare cinque millilitri di soluzione di bicarbonato di sodio sulla piastra di incisione per neutralizzare l'acido rimanente. Quindi, usa un paio di pinzette per rimuovere i perni tirandoli longitudinalmente.

Inizia con uno stampo fabbricato. Come in questo schema, lo stampo è per un dispositivo con una parete laterale fissa e spazio per i perni. Creare lo stampo su un vetrino utilizzando la litografia.

Posizionare il vetrino preparato sul fondo di un piatto di plastica. Ora, versare il prepolimero di PDMS sullo stampo ad uno spessore di tre millimetri. Mettere il piatto in un essiccatore sottovuoto per 10 minuti.

Dopodiché, spostalo in forno a 65 gradi Celsius per un'ora. Il risultato è una lastra parzialmente polimerizzata. Usa un bisturi per sformare la lastra per i passaggi successivi.

Mettere la lastra in forno a 120 gradi Celsius per un'ora per indurirla completamente. Ora, lavorare con la lastra completamente indurita. Avrà bordi irregolari lungo il modello della linea guida.

Usa un bisturi per tagliare in modo preciso e pulito i bordi irregolari. Prestare particolare attenzione alla superficie per le fessure di inserimento dei pin per creare il miglior dispositivo. Perforare i fori per l'ingresso/uscita della camera principale e altrove utilizzando punzoni per biopsia.

A questo punto, fabbricare un assieme a microcanali. Scaldare una soluzione detergente a 60 gradi Celsius e ottenere un coprioggetto numero quattro. Il vetro di copertura misura 10 millimetri per 20 millimetri.

Immergere il vetro di copertura nella soluzione per 10 minuti. Posizionato il coverglass risciacquato e asciugato e la lastra PDMS sull'elettrodo inferiore di una verniciatrice per polverizzazione catodica . Genera plasma sottovuoto d'aria per 30 secondi.

Incollare l'elemento recuperato in modo che i bordi si allineino e le funzioni del canale siano visibili attraverso il vetro di copertura. Utilizzare un contenitore sterile per portare gli strati incollati in una cappa laminare per sterilizzarli. Al termine, inserire i perni nella fessura.

I perni adiacenti dovrebbero essere di lunghezze diverse. I perni formano l'altra parete laterale della microcamera. Continuare a lavorare nella cappa laminare.

Per i passaggi successivi, avere una base pronta per il dispositivo. Preparare il gap filler omogeneizzando una miscela di vaselina bianca e polvere di politetrafluoroetilene. Versare la miscela omogeneizzata in una siringa dosatrice e inserire uno stantuffo.

Spingere lo stantuffo per riempire la punta della siringa. Quindi, inserire un ago e spingere lo stantuffo fino a riempire l'ago. Preparare una seconda siringa con adesivo siliconico in modo simile e collegare ciascuna a un erogatore pneumatico.

Ora, erogare l'adesivo siliconico sulla base. Mettilo lungo una delle tasche. Quindi, posiziona un coprioggetto numero quattro sulla tasca e premilo con decisione per incollarlo.

Successivamente, erogare l'adesivo siliconico lungo le due fessure esterne della base disegnando segmenti profondi circa un millimetro. Lungo un'altra fessura al centro, erogare il gap filler in un segmento profondo un millimetro. Metti altro adesivo sul bordo dell'altra tasca.

Posizionare un gruppo a microcanali sulla tasca e premerlo con decisione. Ancora una volta, metti il riempitivo nella fessura lungo il centro della base. Seguire questo con l'applicazione di adesivo sulle fessure adiacenti.

Lasciare riposare il dispositivo per un giorno nella cappa sterile. Dopo l'indurimento, nella cappa laminare, spostare ogni perno fino a un millimetro lungo i perni adiacenti per sganciarli dalla barriera elastomerica. Impostare un test di fluorescenza per le perdite diluendo il colorante fluorescente verde in acqua ionizzata.

Quindi, apri il microcanale per avere una larghezza costante in tutto. Utilizzare una micropipetta per trasferire il colorante su una porta terminale del microcanale e riempirla con la soluzione. In un grande piatto di plastica, posizionare due pezzi di carta assorbente bagnati con acqua deionizzata e il dispositivo all'interno.

Incubare la capsula in anidride carbonica al 5% per almeno 24 ore a 37 gradi Celsius. Visualizza il dispositivo recuperato con un microscopio a fluorescenza invertito e registra le immagini. Utilizzarli per verificare che non vi siano perdite intorno ai pin.

Queste immagini sono di un campione che perde e non perde. Un altro test prevede la semina delle cellule. Aprire il microcanale per creare un canale dritto largo 400 micron con la parete laterale il più piatta possibile.

Aggiungere la sospensione delle celle a una porta terminale per riempire il canale. Individuare i perni che definiscono la parete laterale della regione per avviare la coltura cellulare e chiuderli per racchiudere le cellule nella regione. Partendo vicino alla regione, chiudi tutti i pin per espellere le celle nel canale.

Dopo aver aspirato la sospensione dalle porte terminali, aggiungere un fluido. Posizionare il dispositivo in un contenitore di plastica con carta assorbente bagnata. Incubarlo per un minimo di 24 ore.

Cerca che le celle siano di circa 10 celle per nell'area chiusa. Quindi, ritrarre lentamente uno spillo per allargare l'area di coltura. Queste immagini sono di cellule COS-7 cresciute in un microcanale riconfigurabile.

Nel corso di nove giorni, l'area di coltura dei microcanali è stata ampliata. I dati raccolti consentono di tracciare il conteggio delle cellule e la densità in funzione del tempo. I punti blu e l'adattamento della curva sono per il conteggio delle celle.

I simboli rossi e gli adattamenti sono per la densità. Per la densità, le frecce verticali indicano l'espansione dell'area di coltura cellulare a due, cinque e sei giorni. Le densità vengono calcolate per le stesse aree di coltura.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come costruire una parete laterale priva di perdite di un canale microfluidico da piccoli pin. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in una settimana se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante eseguire ciascuno dei passaggi del protocollo con attenzione e completezza.

Non dimenticare che lavorare con l'acido forte può essere estremamente pericoloso e che è necessario prendere sempre precauzioni come la preparazione di una quantità adeguata di agente neutralizzante. Seguendo queste procedure, è possibile introdurre altre cellule con fluido per stabilire colture cellulari più complesse.