Un modello del coniglio di espressione del Transgene durevole nella vena giugulare di innesti di interposizione dell'arteria carotica comune

Questo metodo può rispondere a domande chiave sulla patogenesi del fallimento dell'innesto venoso. Ad esempio, potrebbe identificare mediatori del fallimento del trapianto e testare strategie volte a prevenire il fallimento del trapianto. Il vantaggio principale di questa tecnica è la sua capacità di ottenere un'espressione transgenica duratura e stabile nell'endotelio dell'innesto venoso.

Dopo aver anestetizzato un coniglio secondo il protocollo di testo, radere l'animale dalla tacca sternale al bordo della mandibola. Al termine dell'impostazione chirurgica, utilizzare l'elettrocauterizzazione per tagliare la pelle lungo la linea mediana tra l'incisura sternale e la mandibola, lunga circa sette-nove centimetri. Quindi fissare i morsetti per asciugamani per tenere aperta l'incisione.

Sezionare senza mezzi termini sotto la fascia lungo l'intera linea mediana. Quindi utilizzare l'elettrocauterizzazione per tagliare lo strato fasciale sezionato lungo la linea mediana. Successivamente, iniziando dal lato destro, sezionare tra il muscolo ioide sternale sovrastante la trachea e il muscolo sternoefalico per esporre l'arteria carotide comune.

Quindi sezionare con cura un segmento di quattro o cinque centimetri dell'arteria carotide comune e i suoi rami più grandi liberi dai tessuti circostanti. Utilizzare suture di seta 5-0 per legare i rami più grandi dell'arteria carotide comune prima di tagliare ciascun ramo distalmente alla sutura. Dopo aver ripetuto la dissezione sulla carotide comune sinistra, utilizzare una pinza per il supporto dei tessuti per chiudere temporaneamente lo strato di tessuto sottocutaneo.

Quindi sezionare la fascia superficiale dalla pelle sul lato destro fino a quando la vena giugulare esterna non è esposta. Sezionare un segmento di quattro o cinque centimetri della vena giugulare esterna e liberare i suoi rami dal tessuto circostante. Usa 5-0 suture di seta per legare i rami, quindi taglia i rami.

Quindi legare la vena isolata ad entrambe le estremità, tagliare l'estremità cranica e lavare il lume con soluzione fisiologica eparinizzato. Per eseguire l'innesto venoso, utilizzare una clip vascolare per bloccare l'arteria carotide comune destra all'estremità cranica del segmento isolato. Quindi posizionare una clip vascolare sull'estremità caudale.

Ora esegui un'arteriotomia caudale appena craniale al morsetto caudale uguale in lunghezza al diametro dell'estremità cranica del segmento venoso. Quindi inserire un catetere endovenoso collegato a una siringa di soluzione fisiologica eparinizzata attraverso l'arteriotomia caudale e lavare il lume dell'arteria carotide. Il fluido uscirà attraverso l'arteriotomia.

Tornando alla vena giugulare, asportare la vena e adagiarla vicino all'arteria carotica. Utilizzando punti singoli di sutura in polipropilene 7-0, l'estremità caudale dell'arteriotomia caudale fino all'estremità cranica del segmento venoso. Quindi posizionare un secondo punto a 180 gradi dal primo punto per suturare il bordo cranico dell'arteriotomia caudale all'estremità cranica del segmento venoso.

Posizionare un terzo punto in un punto equidistante dai primi due punti sul lato laterale dell'anastomosi. Quindi posizionare un quarto punto sul lato mediale dell'anastomosi equidistante dai primi due punti e di fronte al terzo punto. Metti quattro punti in più tra ciascuno dei punti da uno a quattro.

Eseguire l'arteriotomia cranica sul lato caudale della clip distale. La distanza tra l'estremità cranica dell'arteriotomia cranica e l'estremità caudale dell'arteriotomia caudale dovrebbe essere uguale alla lunghezza del segmento venoso. La lunghezza dell'arteriotomia cranica è uguale al diametro dell'estremità caudale del segmento venoso.

Con la vena estesa cranialmente dall'anastomosi lungo la carotide, assicurarsi che la vena non sia attorcigliata. Quindi utilizzare soluzione fisiologica eparinizzata per lavare l'arteria carotide e la vena attraverso l'arteriotomia cranica. Quindi posizionare un primo punto per suturare l'estremità caudale dell'arteriotomia cranica all'estremità caudale del segmento venoso.

Quindi posizionare un secondo punto a 180 gradi dal primo punto per suturare il bordo cranico dell'arteriotomia cranica all'estremità caudale del segmento venoso. Completa l'anastomosi come dimostrato in precedenza nel video. Rilasciare temporaneamente la clip cranica per consentire all'innesto venoso di riempirsi di sangue e applicare una leggera pressione con una garza asciutta per fermare qualsiasi sanguinamento.

Ripetere questo passaggio fino a quando l'anastomosi non sanguina più. Quindi rimuovere sia la clip cranica che quella caudale. Usa una garza per fermare qualsiasi ulteriore sanguinamento in corrispondenza delle anastomosi.

Utilizzare una sutura di seta 3-0 per legare entrambe le estremità del segmento dell'arteria carotide comune tra le anastomosi. Quindi dividere la carotide a metà tra le legature. Si dovrebbero vedere pulsazioni vivaci nell'innesto venoso.

Ripetere il posizionamento dell'innesto venoso sul lato sinistro. Con una sutura PGA 5-0, chiudere il tessuto sottocutaneo con uno schema continuo. Quindi utilizzare una sutura PGA 3-0 per chiudere la pelle con un modello intradermico e seppellire i nodi su entrambe le estremità.

Eseguire l'assistenza postoperatoria e l'ecografia transcutanea secondo il protocollo di testo. Per eseguire l'intervento chirurgico di trasferimento genico, isolare attentamente l'innesto venoso destro, compresi da 1,5 a due centimetri dell'arteria carotide adiacente all'innesto su entrambi i lati cranico e caudale. Ripetere la dissezione sul lato sinistro allo stesso modo.

Utilizzare soluzione fisiologica normale per riempire la cavità della ferita chirurgica sul lato destro per consentire la trasmissione delle onde sonore. Collegare una sonda di flusso perivascolare da due millimetri a un flussometro volumetrico e immergere la sonda nella soluzione salina nella cavità della ferita. Impostare la portata su zero.

Posizionare la sonda di flusso attorno all'arteria carotide, caudale o cranica, all'innesto venoso. Quindi utilizzare un sistema di acquisizione dati elettronico per registrare i dati dalla sonda di flusso. Dopo aver iniettato l'eparina nel coniglio attraverso il catetere IV e averlo lavato con soluzione fisiologica, utilizzare una clip vascolare per bloccare l'arteria carotide comune all'estremità cranica dell'innesto venoso.

E poi applicare una seconda clip alla carotide di circa 10 millimetri caudale all'anastomosi caudale per lasciare spazio all'arteriotomia. Quindi posizionare due lacci di seta attorno all'arteria carotide appena caudale all'innesto venoso. Successivamente, utilizzando un ago piegato calibro 21 precedentemente preparato, perforare la caudale carotidea all'innesto e solo craniale alla clip vascolare caudale.

Far avanzare l'ago nel lume avanti e indietro due volte per assicurarsi che il lume sia chiaro. Quindi estrarre con cautela l'ago. Dopo aver preparato una siringa e un catetere endovenoso con DMEM secondo il protocollo di testo, inserirlo nell'arteriotomia carotidea comune fino al punto di curvatura e lavare il lume dell'innesto venoso riempiendolo con 0,5 millilitri di DMEM due volte.

Rimuovere il DMEM dall'innesto utilizzando un dito guantato per premere leggermente sull'estremità cranica dell'innesto. Quindi far scorrere con cautela il dito lungo l'innesto verso l'estremità caudale dell'innesto per espellere il contenuto luminale tramite l'arteriotomia. Rimuovere la siringa DMEM dal catetere lasciando il catetere nel vaso.

Collegare la siringa contenente la soluzione virale assicurandosi che l'aria non entri nel catetere. Muovi i lacci di seta annodati in modo lasco lungo l'arteria fino a quando non sono intorno alla punta del catetere, ma non stringerli. Infondere 0,03 millilitri di soluzione virale per spingere il DMEM rimanente fuori dal catetere.

Quindi, utilizzando un dito, rimuovere tutto il liquido dal lume dell'innesto venoso premendo delicatamente dal cranio alla caudale. Stringere i due lacci attorno all'arteria e alla punta del catetere per sigillare il lume. Quindi infondere la soluzione virale fino a quando la vena non è distesa.

Appoggiare delicatamente la siringa su un nido di garza. Dopo 20 minuti, utilizzare una siringa vuota per aspirare delicatamente il virus contenente la soluzione dall'innesto fino al collasso del vaso. Rimuovere la siringa lasciando il catetere in posizione.

Quindi tagliare e sciogliere le suture di seta ed estrarre il catetere dal vaso. Ora usa la sutura in polipropilene 7-0 in uno schema a X per chiudere l'arteriotomia. Quindi tirare delicatamente le estremità della sutura e legarle insieme con due nodi quadrati.

Dopo aver ripristinato il flusso sanguigno nell'innesto della vena destra come descritto nel protocollo di testo, ripetere l'infusione del virus sul lato sinistro. Per prelevare gli innesti trasdotti, sezionare gli innesti venosi liberi e le arterie carotidi comuni ed effettuare misurazioni del flusso su entrambi i lati sinistro e destro, come dimostrato in precedenza. Utilizzare la sutura di seta 3-0 per legare l'arteria carotide comune destra craniale all'innesto.

Quindi utilizzare la sutura di seta 3-0 per legare la caudale carotidea all'innesto. Asportare l'innesto della vena destra dividendo l'arteria carotide adiacente tra ciascuna delle legature e l'anastomosi adiacente. Quindi rimuovere l'innesto venoso dal coniglio e utilizzare la soluzione salina per lavare il lume.

La prima pietra miliare che un nuovo operatore deve raggiungere è la costanza della pervietà dell'innesto venoso sia dopo l'intervento iniziale di innesto venoso che dopo il successivo intervento di trasduzione ritardata. Quando un innesto venoso è pervio, l'esame ecografico rivelerà un grande vaso sanguigno con un flusso sanguigno vivace da caudale a cranico. Gli innesti sono stati prelevati tre giorni dopo la trasduzione, tagliati in sezioni e colorati con X-gal.

L'imaging en-face delle superfici luminali ha mostrato innesti venosi con trasduzione efficiente e scarsa trasduzione. Come mostrato in questo grafico, i livelli di mRNA della beta galattosidasi negli innesti venosi trasdotti dal nuovo operatore, non erano significativamente diversi dai livelli di mRNA della beta galattosidasi negli innesti venosi trasdotti da un operatore esperto. Quando si esegue questo protocollo, è importante ricordarsi di invertire l'innesto venoso craniale a caudale prima di contrarre l'anastomosi.

Ciò è necessario per evitare l'ostruzione del flusso sanguigno da parte del bolo venoso. Una volta padroneggiati, questi interventi chirurgici possono essere completati in circa tre ore per la procedura di innesto venoso, due ore per la procedura di trasferimento genico dell'innesto venoso e 45 minuti per la procedura di prelievo. Non dimenticare che, poiché questo protocollo richiede di lavorare con vettori virali e oggetti appuntiti, è necessario seguire adeguate procedure di biosicurezza e oggetti taglienti.