Name: Fabbricazione di lingua della matrice extracellulare e la ricostituzione di Carcinoma di cellule Squamous Tongue In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Scopri la preparazione della matrice extracellulare della lingua mediante decellularizzazione per ricostruire un modello 3D di carcinoma squamoso. Questo metodo offre un sistema di coltura più accurato rispetto ai modelli 2D tradizionali.

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Gli autori riconoscono il supporto di assegni di ricerca dalla Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina (31371390), il programma del progetto di sviluppo High-Tech di stato (2014AA020702) e il programma di Guangdong Science and Technology (2016B030231001).

Tutto il lavoro animale era eseguito in conformità con legge di benessere degli animali, le linee guida istituzionali e approvato dal comitato di uso, Sun Yat-sen University e istituzionali Animal Care.
1. preparazione del TEM
<ol><li>Eseguire topi di dislocazione cervicale e rimuovere le lingue utilizzando pinzette e forbici chirurgiche sterili.</li>
	<li>Immergere le linguette in etanolo di 75% per 3 minuti, poi mettere ogni lingua in un 1,5 mL tubo Eppendorf (EP) con 1 mL di 10 millimetri di fosfato sterile tamponata (PBS). Nota: La concentrazione di PBS in tutti i passaggi seguenti è lo stessa come la concentrazione in questo passaggio.</li>
	<li>Lisi della cellula da disgelo: congelare le linguette in tubi EP a-80 ° C per 1 h e poi scongelare le lingue a temperatura ambiente per 45 min per 3 cicli.</li>
	<li>Caricare ogni lingua su un pezzo di sutura chirurgica utilizzando un ago chirurgico e avvolgere l'estremità della sutura con un piccolo pezzo di carta stagnola sterile. Eseguire l'operazione in una piastra di coltura 3,5 cm o 6 cm contenente etanolo di 75% in condizioni sterili. Nota: La lunghezza appropriata di ogni pezzo di sutura chirurgica è di circa 20 cm, e la dimensione appropriata di ogni pezzo di carta stagnola è circa 0,3 cm2 (1 cm × 0,3 cm). La lingua deve essere caricata vicino la carta stagnola.</li>
	<li>Sciacquare ogni linguetta con 3 mL di PBS sterile in una piastra di coltura 3,5 cm o 6 cm per 30 s. eseguire questa operazione in condizioni sterili.</li>
	<li>Lavare le linguette con acqua ultrapura: aggiungere ampicilin in una bottiglia di bocca larga con 250 mL di acqua distillata sterile ad una concentrazione finale di 90 µ g/mL. Mettere le lingue al flacone contenente una barra per l'agitazione. Stringere il tappo di bottiglia con parte della sutura rimanendo all'esterno della bottiglia. Eseguire questa operazione in condizioni sterili. Nota: Fino a 5 lingue possono essere messo nella stessa bottiglia in considerazione twining della sutura. La carta stagnola è all'estremità della sutura in bottiglia per evitare che la lingua scivoli fuori. Le lingue devono trovarsi 2 cm di altezza dal fondo della bottiglia, regolando la lunghezza della sutura rimanendo all'interno della bottiglia. Questa nota è anche per la procedura 1.8, 1.10, 1.12 e 1.16.</li>
	<li>Mettere la bottiglia su un agitatore magnetico per 12 h.</li>
	<li>Lavare le linguette con NaCl: aggiungere ampicilin in una bottiglia di bocca larga con 250 mL di sterile 1 M di NaCl a una concentrazione finale di 90 µ g/mL. Spostare le lingue e l'ancoretta nella bottiglia. Stringere il tappo di bottiglia con parte della sutura rimanendo all'esterno della bottiglia. Eseguire questa operazione in condizioni sterili.</li>
	<li>Mettere la bottiglia su un agitatore magnetico per 24 h.</li>
	<li>Lisi di Triton X-100 di cella: aggiungere ampicilin a una concentrazione finale di 90 µ g/mL in una bottiglia a bocca larga con 250 mL di sterile 2% Triton X-100 in PBS. Spostare le lingue e l'ancoretta nella bottiglia. Stringere il tappo di bottiglia con parte della sutura rimanendo all'esterno della bottiglia. Eseguire questa operazione in condizioni sterili.</li>
	<li>Mettere la bottiglia su un agitatore magnetico per 48 h.</li>
	<li>Lavare le linguette con CaCl2/MgCl2: Aggiungi ampicilin in una bottiglia di bocca larga con 250 mL di sterile 5 mM CaCl2/MgCl2 a una concentrazione finale di 90 µ g/mL. Spostare le lingue e l'ancoretta nella bottiglia. Stringere il tappo di bottiglia con parte della sutura rimanendo all'esterno della bottiglia. Eseguire questa operazione in condizioni sterili.</li>
	<li>Mettere la bottiglia su un agitatore magnetico per 24 h.</li>
	<li>Digestione di dnasi: aggiungere 1 mL di Hank equilibrata soluzione salina (HBSS) a ciascuna provetta di EP. Aggiungere la dnasi in HBSS rispettivamente a una concentrazione finale di 300 µM. muovere ogni lingua in ogni provetta di EP, con parte della sutura all'esterno del tubo. Eseguire questa operazione in condizioni sterili. Nota: Assicurarsi che la parte della sutura che rimane all'interno delle bottiglie nei passaggi precedenti rimane anche all'interno del tubo di EP in questo passaggio e assicurarsi che la parte della sutura che rimane di fuori delle bottiglie nei passaggi precedenti rimane anche all'esterno del tubo di EP in questo passaggio.</li>
	<li>Incubare le linguette in tubi EP a 37 ° C per 24 h.</li>
	<li>Lavare le linguette con PBS: aggiungere ampicilin in una bottiglia a bocca larga con 250 mL di PBS sterile ad una concentrazione finale di 90 µ g/mL. Spostare le lingue e l'ancoretta nella bottiglia. Stringere il tappo di bottiglia con parte della sutura rimanendo all'esterno della bottiglia. Eseguire questa operazione in condizioni sterili.</li>
	<li>Mettere la bottiglia su un agitatore magnetico per 24 h.</li>
	<li>Conservare il TEM preparato in PBS sterile a 4 ° C fino all'utilizzo.</li>
</ol>2. tridimensionale (3D) ricostituzione di TSCC
<ol><li>
Costruzione di modello statico TSCC
	<ol>
<li>Seme 1.0 x 106 TSCC celluli (Cal27) in una piastra di coltura di 3,5 cm. Aggiungere 3 mL di Dulbecco modificato dell'Aquila medio/F12 (DF12) contenente 10% siero bovino fetale (FBS), ampicilin 90 µ g/mL e 90 kanamicina µ g/mL.</li>
		<li>Coltura le cellule Cal27 a 37 ° C per 2 o 3 giorni. Assicurarsi che le celle coprono almeno il 60% zona del fondo piatto.</li>
		<li>Caricare TEM sul strato monomolecolare del Cal27 nella piastra di coltura.</li>
		<li>Mettete la teglia in un incubatore a CO2 a 37 ° C per 28 giorni.</li>
		<li>Aggiornare il terreno di coltura ogni giorno durante il processo di coltura delle cellule. La concentrazione di CO2 nell'incubatrice è 5%.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Costruzione di modello TSCC agitata
	<ol>
<li>
Preparazione di un self-made minibioreactor agitata
		<ol>
<li>Togliere lo stantuffo da una siringa da 10 mL.</li>
			<li>Scavare un foro (diametro di 1 cm) vicino il terminale inferiore dello stelo e caricare un ancoretta nel foro.</li>
			<li>Scavare un foro (diametro di 0,5 cm) al centro del tappo della bottiglia, una bottiglia di plastica in bocca larga e mettere l'asta del pistone attraverso il tappo.</li>
			<li>Tagliare metà di un tubo di centrifuga da 50 mL e saldarlo sul lato esterno del tappo della bottiglia.</li>
			<li>Collegare ami all'asta avvolgendo l'asta con linee di pesca che sono legati per l'ami. Nota: Fino a 4 ami possono essere collegati ad un bastone.</li>
			<li>Sterilizzare in autoclave il complesso self made prima dell'uso. Nota: Non sterilizzare in autoclave la bottiglia di plastica bocca larga. Utilizzare una nuova bottiglia di bocca larga di plastica sterile durante la coltura delle cellule.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Coltura cellulare dinamica
	<ol>
<li>Seme 1.0 x 106 Cal27 unicellulari nella minibioreactor self-made. Aggiungere 150 mL di mezzo di DF12 che contiene 10% FBS, 90 µ g/mL ampicilin e kanamicina 90 µ g/mL.</li>
		<li>Caricare TEM sul minibioreactor utilizzando l'ami allegati all'asta.</li>
		<li>Stringere il tappo del flacone e mettere il minibioreactor su un agitatore magnetico. Attivare il minibioreactor a 200 rpm in un incubatore a CO2 a 37 ° C per 7-14 giorni. Nota: La concentrazione di CO2 nell'incubatore CO2 è 5%.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Elfring, T., Boliek, C. A., Winget, M., Paulsen, C., Seikaly, H., Rieger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+lingual+and+hypoglossal+nerve+function+and+quality+of+life+in+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Oral+Rehabil%22%5BJournal%5D)">The relationship between lingual and hypoglossal nerve function and quality of life in head and neck cancer.</a> J. Oral Rehabil. 41, 133-140 (2014).</li>
<li>Patel, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+incidence+of+oral+tongue+squamous+cell+carcinoma+in+young+white+women%2C+Age+18+to+44+Years%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Increasing incidence of oral tongue squamous cell carcinoma in young white women, Age 18 to 44 Years.</a> J. Clin. Oncol. 29, 1488-1494 (2011).</li>
<li>Zhao, L., Huang, L., Yu, S., Zheng, J., Wang, H., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+tongue+tissue+as+an+in+vitro.+model+for+studying+tongue+cancer+and+tongue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Decellularized tongue tissue as an in vitro. model for studying tongue cancer and tongue regeneration.</a> Acta Biomaterialia. 58, 122-135 (2017).</li>
<li>Ng, S. L., Narayanan, K., Gao, S., Wan, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+restricted+progenitors+for+the+repopulation+of+decellularized+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Lineage restricted progenitors for the repopulation of decellularized heart.</a> Biomaterials. 32, 7571-7580 (2011).</li>
<li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion-decellularized+matrix%3A+using+nature%27s+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat. Med. 14, 213-221 (2008).</li>
<li>Remlinger, N. T., Wearden, P. D., Gilbert, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedure+for+decellularization+of+porcine+heart+by+retrograde+coronary+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Procedure for decellularization of porcine heart by retrograde coronary perfusion.</a> J. Vis. Exp. (6), e50059(2012).</li>
<li>Wainwright, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+cardiac+extracellular+matrix+from+an+intact+porcine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C-ME%22%5BJournal%5D)">Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart.</a> Tissue Eng. Part C-ME. 16, 525-532 (2010).</li>
<li>Baptista, P. M., Siddiqui, M. M., Lozier, G., Rodriguez, S. R., Atala, A., Soker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+whole+organ+decellularization+for+the+generation+of+a+vascularized+liver+organoid%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid.</a> Hepatology. 53, 604-617 (2011).</li>
<li>Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+the+decellularization+of+intact+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">Method for the decellularization of intact rat liver.</a> Organogenesis. 6, 134-136 (2010).</li>
<li>Soto-Gutierrez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+whole-organ+regenerative+medicine+approach+for+liver+replacement%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C-ME%22%5BJournal%5D)">A whole-organ regenerative medicine approach for liver replacement.</a> Tissue Eng. Part C-ME. 17, 677-686 (2011).</li>
<li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+reengineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nat. Med. 16, 814-820 (2010).</li>
<li>Bonvillain, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nonhuman+primate+model+of+lung+regeneration%3A+detergent-mediated+decellularization+and+initial+in+vitro+recellularization+with+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Pt+A%22%5BJournal%5D)">A nonhuman primate model of lung regeneration: detergent-mediated decellularization and initial in vitro recellularization with mesenchymal stem cells.</a> Tissue Eng. Pt A. 18, 2437-2452 (2012).</li>
<li>Daly, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+binding+and+recellularization+of+decellularized+mouse+lung+scaffolds+with+bone+marrow-derived+mesenchymal+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Pt+A%22%5BJournal%5D)">Initial binding and recellularization of decellularized mouse lung scaffolds with bone marrow-derived mesenchymal stromal cells.</a> Tissue Eng. Pt A. 18, 1-16 (2012).</li>
<li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+and+orthotopic+transplantation+of+a+bioartificial+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung.</a> Nat. Med. 16, 927-933 (2010).</li>
<li>Petersen, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+lungs+for+in+vivo+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered lungs for in vivo implantation.</a> Science. 329, 538-541 (2010).</li>
<li>Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+decellularized+lung+bioreactor+system+for+bioengineering+the+lung%3A+the+matrix+reloaded%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Pt+A%22%5BJournal%5D)">Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded.</a> Tissue Eng. Pt A. 16, 2581-2591 (2010).</li>
<li>Wallis, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+assessment+of+detergent-based+protocols+for+mouse+lung+de-cellularization+and+re-cellularization%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C-ME%22%5BJournal%5D)">Comparative assessment of detergent-based protocols for mouse lung de-cellularization and re-cellularization.</a> Tissue Eng. Part C-ME. 18, 420-432 (2012).</li>
<li>Ross, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+proliferate+and+differentiate+when+seeded+into+kidney+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells proliferate and differentiate when seeded into kidney scaffolds.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 20, 2338-2347 (2009).</li>
<li>Song, J. J., Guyette, J. P., Gilpin, S., Gonzalez, G., Vacanti, J. P., Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+and+experimental+orthotopic+transplantation+of+a+bioengineered+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney.</a> Nat. Med. 19, 646-651 (2013).</li>
<li>Sullivan, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+methods+of+porcine+kidneys+for+whole+organ+engineering+using+a+high-throughput+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system.</a> Biomaterials. 33, 7756-7764 (2012).</li>
<li>Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+whole-organ+assembly%3A+moving+toward+transplantation+on+demand%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand.</a> J. Clin. Invest. 122, 3817-3823 (2012).</li>
<li>Song, J. J., Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+engineering+based+on+decellularized+matrix+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Organ engineering based on decellularized matrix scaffolds.</a> Trends Mol. Med. 17, 424-432 (2011).</li>
<li>Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-organ+tissue+engineering%3A+decellularization+and+recellularization+of+three-dimensional+matrix+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).</li>
<li>Shamis, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-specific+scaffolds+for+in+vitro+expansion%2C+differentiation%2C+and+organization+of+primary+lung+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C-ME%22%5BJournal%5D)">Organ-specific scaffolds for in vitro expansion, differentiation, and organization of primary lung cells.</a> Tissue Eng. Part C-ME. 17, 861-870 (2011).</li>
<li>Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+rhesus+monkey+kidney+as+a+three-dimensional+scaffold+for+renal+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Pt+A%22%5BJournal%5D)">Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering.</a> Tissue Eng. Pt A. 16, 2207-2216 (2010).</li>
<li>Cortiella, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+acellular+natural+lung+matrix+on+murine+embryonic+stem+cell+differentiation+and+tissue+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Pt+A%22%5BJournal%5D)">Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation.</a> Tissue Eng. Pt A. 16, 2565-2580 (2010).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Un protocollo ben consolidato per la fabbricazione di ECM decellularizzati dovrebbe mantenere la composizione di ECM nativa durante la rimozione di componenti cellulari nei tessuti quasi completamente21. Nonostante i protocolli di decellularizzazione attualmente segnalati che richiedono perfusione attraverso il sistema vascolare per rimuovere materiali cellulari di trasporto convettivo, agitazione meccanica è stata adottata qui, conosciuto come un metodo semplice ed economico tradizionale<sup clas...

La lingua ha varie funzioni importanti, come la deglutizione, articolazione e degustazione. Quindi, il danno della funzione di lingua ha grande impatto il patients' qualità di vita1. La malignità più comune nella cavità orale è carcinoma di cellule squamous lingua (TSCC), che di solito si verifica nelle persone che bere alcolici o fumano tabacco2.
Negli ultimi anni, scarsi progressi compiuti nella ricerca fondamentale sulla TSCC. La mancanza di efficienti in vitro ricerca modelli resti per essere uno dei maggiori problemi. Così, la matrice extracellulare (ECM) scopre di essere una potenziale soluzione. Poiché l'ECM è un frame di rete complessa composto da componenti della matrice altamente organizzata, impalcatura materiali aventi un ECM-come la struttura e la composizione sarebbe competente per la ricerca sul cancro. ECM decellularizzati perfettamente è in grado di fornire la nicchia per le cellule dallo stesso origine in vitro, che risulta per essere il vantaggio più significativo di ECM.
ECM può essere mantenuto con componenti cellulari per essere rimosso dal tessuti attraverso il decellularizzazione utilizzando detergenti ed enzimi. Vari componenti della MEC, tra cui collagene, fibronectina e laminina nella matrice decellularizzati forniscono un microambiente nativo-tessuto-come per le cellule coltivate, promuovendo la sopravvivenza, la proliferazione e la differenziazione delle cellule3. Inoltre, l'immunogenicità per trapianto può essere ridotto a un livello minimo con l'assenza di componenti cellulari in ECM.
Finora, sono stati provati metodi di fabbricazione per decellularizzati ECM in diversi tessuti e organi, quali cuore4,5,6,7, fegato8,9,10 ,11, polmone12,13,14,15,16,17e rene18,19 , 20. Tuttavia, nessuna ricerca pertinente ha si trova su un lavoro simile nella linguetta al meglio della nostra conoscenza.
In questo studio, matrice extracellulare decellularizzati lingua (TEM) è stata fabbricata sia in modo efficiente ed economicamente da una serie di trattamento fisico, chimico ed enzimatico. Quindi il TEM è stato utilizzato per ricapitolare TSCC in vitro, mostrando una simulazione appropriata per TSCC comportamento e sviluppo. TEM ha buona biocompatibilità, nonché la capacità di guidare le cellule alla nicchia di tessuto-specifica, che indica che la TEM può avere grande potenziale in TSCC ricerca3. Il protocollo illustrato di seguito fornisce una scelta per i ricercatori che studiano su patogenesi o clinica delle terapie di TSCC.

<table><tbody><tr><td>Topi C57-BL / 6J</td><td>Sun Yat-sen University Laboratory Animal Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Guangzhou Chemical Reagent Factory</td><td>HB15-GR-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501218</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100395</td><td></td></tr><tr><td>Fabbrica</td><td></td> <td>di reagenti chimici bibasici di Sodio Fosfato di GuangzhouBE14-GR-500G</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di potassio monobasico&nbsp;</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501211</td><td></td></tr><tr><td>Provetta EP da 1,5 mL</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-A Congelatore</td><td></td></tr><tr><td>a bassissima temperatura&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific Piatto</td><td></td><td></td></tr> per <tr><td>colture cellulari da 3,5 cm</td><td>Thermo Fisher Scientific 153066</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piatto per colture cellulari da 6 cm</td><td>Greiner</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900502</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746495</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>449164</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di magnesio</td><td>Sangon Biotech</td><td>A601988</td><td></td></tr><tr><td>glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158968</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9393</td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1487</td><td></td></tr><tr><td>Sutura chirurgica</td><td>Shanghai Jinhuan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 mL bottiglia a bocca larga</td><td>SHUNIU</td><td>1407</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore magnetico</td><td>AS ONE</td><td>1-4602-32</td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubatore</td><td>SHEL LAB</td><td>SCO5A</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 10 mL</td><td>Hunan Pingan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL provetta da centrifuga</td><td>Greiner</td><td>227270</td><td></td></tr><tr><td>Cal27 cell</td><td>Accademia Cinese delle Scienze, Shanghai Cell Bank</td><td></td><td>Linea cellulare di carcinoma a cellule squamose della lingua</td></tr><tr><td>U2OS cell</td><td>Accademia Cinese delle Scienze, Shanghai Cell Bank</td><td></td><td>Linea cellulare di osteosarcoma umano</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0547</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>Hepes acido libero</td><td>BBI</td><td></td><td></td>A600264</tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30084.03</td><td></td></tr><tr><td>4 gradi C frigorifero</td><td>Haier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Depuratore d'acqua</td><td>ELGA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Emocitometro</td><td>BLAU</td><td>717805</td><td></td></tr></tbody></table>

fabbricazione di lingua della matrice extracellulare e la ricostituzione di carcinoma di cellule squamous tongue in vitro

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

Al fine di costruire un modello efficace e realistico per lingua cellule squamose carcinoma (TSCC) in vitro, i metodi sono stati creati per produrre decellularized lingua extracellulare (TEM) che fornisce funzionale ponteggi per edilizia TSCC. TEM fornisce una nicchia in vitro per la crescita cellulare, differenziazione e migrazione cellulare. Le microstrutture del nativo della matrice extracellulare (ECM) e biochimici composizioni conservate nella matrice decellularizzata forniscono tessuto-specifiche nicchie per l'ancoraggio di cellule. La fabbricazione di TEM può essere realizzata tramite digestione deossiribonucleasi (DNase) accompagnata con una seria di pretrattamento organico o inorganico. Questo protocollo è facile da usare ed assicura l'alta efficienza per il decellularizzati. Il TEM ha mostrato citocompatibilità favorevole per le celle TSCC in condizioni di coltura statica o agitata, che permette la costruzione del modello TSCC. Un bioreattore self-made è stato utilizzato anche per la persistente condizione agitata per la coltura cellulare. TSCC ricostruito utilizzando TEM ha mostrato le caratteristiche e le proprietà che assomiglia l'istopatologia clinica di TSCC, suggerente il potenziale della ricerca TSCC.

Questo protocollo per la preparazione di TEM risulta per essere efficiente e appropriato. Il TEM ha mostrato decellularizzazione perfetto rispetto ai tessuti di madrelingua. L'efficacia di decellularizzazione è stata confermata da ematossilina-eosina (HE) (Figura 1A-B). HE i risultati di macchiatura ha rivelato la scomparsa completa di macchiatura nucleare nel TEM (Figura 1B). Inoltre, contenuto ...

Qui viene mostrato un metodo per la preparazione della matrice extracellulare (TEM) di lingua con decellularizzazione efficiente. Il TEM utilizzabile come funzionale scaffold per la ricostruzione di un modello di carcinoma di cellule squamous (TSCC) lingua in condizioni di coltura statica o agitata.

Fabbricazione di lingua della matrice extracellulare e la ricostituzione di Carcinoma di cellule Squamous Tongue In Vitro

In order to construct an effective and realistic model for tongue squamous cell carcinoma (TSCC) in vitro, the methods were created to produce ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della ricerca sul cancro orale, ad esempio come costruire un modello T-assist appropriato in vitro. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i TSCC ricostruiti esprimono caratteristiche tumorali che hanno una forte somiglianza con l'istopatologia clinica dei TSCC. Quando abbiamo avuto l'idea di questo metodo, ci siamo resi conto che le cellule TSCC coltivate in 2D non mostravano correttamente il fenotipo nativo di TSCC.Inoltre, ci siamo resi conto dell'importanza della matrice extracellulare per l'evasione e il differenziamento della sopravvivenza al cancro. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto la preparazione della matrice extracellulare della lingua e la coltura 3D utilizzando un mini bioreattore sono difficili da apprendere solo con le parole e sono meglio come si vede per chiarire. Dopo aver isolato le lingue dai topi soppressi secondo il protocollo di testo, immergere il tessuto in etanolo al 75% per tre minuti.Quindi trasferire ogni lingua in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri, con un millilitro di PBS sterile da 10 milliMolari. Per eseguire la lisi cellulare,

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Una panoramica completa delle tecniche coinvolte nella generazione di un modello murino di cancro orale e monitoraggio quantitativo di invasione tumorale all'interno della lingua attraverso multi-fotone microscopia di cellule marcate è presentato. Questo sistema può essere utilizzato come piattaforma utile per la valutazione molecolare e di efficacia dei farmaci anti-invasiva composti.

Multi-fotone Imaging di invasione delle cellule tumorali in un modello di mouse ortotopico di carcinoma orale a cellule squamose

In questo video, descriviamo l'isolamento di cellule epiteliali da una lingua murina. Queste cellule possono essere ulteriormente coltivate per dare origine a colonie cellulari.

Isolamento e coltura di cellule epiteliali della lingua murina: una procedura per isolare e coltivare cellule epiteliali della lingua da un modello murino

Questo video mostra la preparazione della matrice extracellulare della lingua murina utilizzando il metodo di decellularizzazione, che prevede l'esposizione della lingua prelevata a una serie di trattamenti fisici, chimici ed enzimatici. Lo scaffold TEM risultante mantiene la sua composizione nativa della matrice extracellulare, rimuovendo i componenti cellulari.

Fabbricazione di matrice extracellulare da modello murino: una procedura efficace per preparare la matrice extracellulare della lingua decellularizzata dalla lingua murina

Ingegneria tessutale fibroblasti derivati ​​da matrice nativa è uno strumento emergente per generare un substrato stromale che supporta la proliferazione delle cellule epiteliali e differenziazione. Ecco un protocollo di applicazione di tale metodologia per valutare l'impatto dei diversi tipi di cellule stromali sulla biologia delle cellule tumorali è presentato.

Ingegneria dei tessuti del tumore stromale Microenvironment con l&#39;applicazione di Invasion Cancer Cell

Qui presentiamo un metodo riproducibile per lo sviluppo di un modello murino ortotopico di carcinoma di cellule squamous testa e del collo. I tumori dimostrano clinicamente rilevanti caratteristiche istopatologiche della malattia, compreso necrosi, differenziazione difficile, le metastasi nodali e infiltrazione immune. Topi del tumore-cuscinetto sviluppano sintomi clinicamente rilevanti tra cui disfagia, spostamento mascella e la perdita di peso.

Intramucosa inoculazione delle cellule di Carcinoma di cellule Squamous nei topi per profilatura Immune tumore e valutazione della risposta di trattamento

Per la comprensione della neoplasia è necessario lo sviluppo di modelli murini con geni specifici mutati nei pazienti affetti da cancro alla testa e al collo. Qui, presentiamo un protocollo per la trasformazione in vitro delle cellule primarie della lingua murina utilizzando un sistema adeno-associato al virus-Cas9 per generare linee cellulari MURine HNC con specifiche alterazioni genomiche.

In Vitro Creazione di una linea cellulare di cancro di Murine geneticamente ingegnerizzato e collo utilizzando un sistema Adeno-Associated Virus-Cas9

Abbiamo sviluppato un protocollo generalizzato per dissociare una grande quantità di singole cellule di alta qualità dall'epitelio e dal mesenchima / tessuto connettivo delle lingue del topo embrionali e adulte.

Dissociazione cellulare dall'epitelio della lingua e dal mesenchima/tessuto connettivo dei topi embrionali di 12,5 e 8 settimane

Il protocollo presenta un metodo per la coltivazione e l'elaborazione di organoidi linguali derivati da cellule staminali del gusto isolate dalla papilla del gusto posteriore di topi adulti.

Generazione e coltura di organoidi linguali derivati da cellule staminali del gusto del topo adulto

Questo protocollo descrive i passaggi chiave per generare e caratterizzare organoidi 3D orali-esofagei murini che rappresentano lesioni da carcinoma a cellule squamose normali, preneoplastiche e squamose indotte tramite carcinogenesi chimica.

Modellazione del carcinoma a cellule squamose orale-esofagea in organoidi 3D

Qui viene mostrato un metodo unico per resezionare chirurgicamente tumori carcinoma squamoso orale stabiliti nella cavità orale.

Modello di resezione tumorale rilevante per traduzione per modelli preclinici di murina di carcinoma squamoso orale

Scopri la preparazione della matrice extracellulare della lingua mediante decellularizzazione per ricostruire un modello 3D di carcinoma squamoso. Questo metodo offre un sistema di coltura più accurato rispetto ai modelli 2D tradizionali.

Fabbricazione di lingua della matrice extracellulare e la ricostituzione di Carcinoma di cellule Squamous Tongue In Vitro

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