Un modello In Ovo per testare composti insulino-mimetici

L'obiettivo generale del modello di embrione di pollo modificato presentato è quello di caratterizzare sostanze con proprietà insulino-mimetiche in un organismo vivente. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della ricerca sui diabetici, come la ricerca di estratti di erbe con proprietà insulino-mimetiche che riducono i livelli di glucosio nel sangue senza effetti collaterali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'efficacia dei composti può essere testata in un organismo vivente con tassi di produttività adeguati e che non è necessaria l'autorizzazione di un comitato etico.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di preparazione e taglio sono difficili da imparare, perché i recipienti non sono facilmente preparati, o spesso si tagliano completamente e si perdono. Controllare la fecondazione delle uova dopo l'incubazione a 38 gradi Celsius con un'umidità media dal 40 al 60 percento per un massimo di 11 giorni. Per fare questo, immergi la frangia della lampada sperata in un tampone di inchiostro, quindi accendi il lato appuntito dell'uovo.

Per identificare la vescica d'aria, controlla le differenze di luminosità sulla parte superiore dell'uovo. La vescica d'aria appare come una regione rotonda e più trasparente, mentre l'albumina appare più scura. Segnare la posizione della camera d'aria premendo leggermente la lampada contro l'uovo con l'inchiostro precedentemente applicato.

Escludere gli ovuli non fecondati, che non mostrano una differenza di luminosità tra l'albumina e la vescica aerea. Preparare l'insulino-mimetico, o insulina, diluendo alla concentrazione desiderata nella soluzione salina bilanciata di Hank. Per applicare il composto selezionato, utilizzare un paio di pinzette appuntite per beccare con cura il guscio d'uovo nell'area contrassegnata della camera d'aria per formare un foro pari al diametro della siringa dell'ago.

Utilizzare una siringa sterile da un millilitro per iniettare 300 microlitri della soluzione tampone contenente la sostanza di interesse. Per determinare l'effetto di riduzione della glicemia di una sostanza, rimettere le uova nell'incubatrice e misurare la glicemia dopo 60, 120 e 180 minuti. Al momento opportuno, rimuovere con cura il guscio d'uovo sopra la camera d'aria ed equilibrare la membrana del guscio d'uovo aggiungendo una quantità sufficiente di tampone PBS per coprire l'intera membrana.

Dopo aver versato via il PBS in eccesso, usa un paio di pinzette appuntite per staccare con cura la membrana del guscio d'uovo. Utilizzare una micro forbice per tagliare e rimuovere la membrana corioallantoidea evitando vasi di grandi dimensioni nella membrana. Localizzare il grande vaso che ha origine dall'addome dell'embrione.

Solleva questo recipiente dall'albumina con una micro forbice chiusa e posizionalo su una striscia di plastica per il pH. Spostare la striscia di pH sotto il recipiente e tirare indietro con cautela la microforbice. È essenziale preparare il grande vaso sanguigno che origina dall'addome, poiché quelli più piccoli possono strapparsi rendendo impossibile la raccolta del sangue.

Rimuovere il liquido che circonda il vaso con una pipetta per evitare la diluizione del sangue. Quindi, utilizzare la carta da filtro per asciugare il recipiente e la striscia di pH. Per la raccolta del sangue, è importante non tagliare completamente il vaso poiché andrà perso.

Quindi, usa una micro forbice per tagliare con cura il vaso sanguigno su un lato. Non tagliare più della metà del recipiente per evitare di tagliare completamente il recipiente. Raccogliere il sangue che fuoriesce sulla striscia di pH con una pipetta.

Sono necessari 10 microlitri di sangue per determinare i livelli di glucosio utilizzando il glucometro. Dopo l'applicazione del composto selezionato per 24 ore, equilibrare la membrana del guscio d'uovo con PBS come prima per almeno 30 secondi. Rimuovere il tampone PBS in eccesso versandolo via.

Quindi, staccare con cautela la membrana del guscio d'uovo con un paio di pinzette appuntite. Controlla i vasi sanguigni per le lesioni e conferma la vitalità osservando il movimento dell'embrione di pollo. Per questi esperimenti sono stati utilizzati estratti preparati da combretum indicum, o rampicante di Rangoon, e un estratto non divulgato etichettato come estratto 0845.

Come indicato in questa figura, l'estratto di rampicante di Rangoon non ha provocato una significativa riduzione della glicemia nell'ovo. Tuttavia, la concentrazione di glucosio nel sangue è stata ridotta con successo con l'estratto 0845 con un effetto significativo osservato quando il tempo di incubazione è stato prolungato. Rispetto agli ovuli non trattati, il trattamento delle uova con un estratto di erbe tossiche il giorno 10 per 24 ore ha portato a gravi lesioni dei vasi sanguigni nella membrana corioallantoidea.

Le lesioni erano evidenti anche sull'embrione trattato rispetto al controllo normale. Una volta padroneggiate, due uova possono essere analizzate per i livelli di glucosio e la tossicità in cinque minuti se eseguite correttamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare i vasi sanguigni e raccogliere il sangue nel modello di embrione di pollo per quantificare gli effetti di riduzione della glicemia di composti naturali o sintetici.