Abitudine costruita stampi di coltura del tessuto da maestri inciso al Laser

Questo metodo può facilitare la ricerca nel campo dell'ingegneria tissutale relativa allo sviluppo dei tessuti, all'allineamento cellulare e all'analisi meccanica di polimeri e tessuti ingegnerizzati. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è a basso costo, facile da usare e veloce. Abbiamo sviluppato questa tecnica nel mio laboratorio perché il controllo geometrico dei tessuti ingegnerizzati su scala da millimetro a centimetro non veniva effettuato sul campo e abbiamo visto la necessità critica di pensare in modo traslazionale all'aumento delle dimensioni dei tessuti ingegnerizzati.

Questa tecnica ci consente di sfruttare i vantaggi delle code geometriche sulla fisiologia cellulare e sui tessuti ingegnerizzati attraverso tecniche di fabbricazione che utilizzano perni e una varietà di forme. Questo metodo può fornire informazioni sulla produzione di tessuti ingegnerizzati con dimensioni, forma e allineamenti controllati. Può anche essere applicato a vari modelli di malattia, alla medicina rigenerativa personalizzata e per la traduzione di tessuti ingegnerizzati in studi preclinici.

Inizia aprendo un programma di grafica vettoriale su un computer. Per preparare la geometria dello stampo e il formato vettoriale desiderati, apri una nuova tela di dimensioni appropriate con il formato di colore RGB. Quindi, seleziona lo strumento forma dal pannello di sinistra e crea la geometria desiderata inserendo le dimensioni nella parte superiore della finestra per definire con precisione le dimensioni della forma.

Progettare le geometrie dello stampo in modo da consentire un bordo di almeno sei millimetri dal bordo delle caratteristiche più esterne e dalla linea di taglio per consentire il taglio del menisco PDMS dopo la colata in stampo. Ciò consentirà allo stampo finito di essere posizionato a filo con il fondo del piatto di coltura. Quindi, apri il selettore di colori nell'angolo in alto a sinistra della finestra e definisci nuovi campioni di colore compatibili con il software di taglio laser.

Selezionate ogni tracciato e assegnategli un colore appropriato dal campione di taglio. Al termine, assegna Nessuno per il colore di riempimento. Allo stesso modo, assegnate i colori dei campioni ai tracciati di incisione selezionando l'oggetto e quindi selezionando il tracciato di incisione per il colore di riempimento e Nessuno per il colore del tracciato dal selettore colore.

Salva i progetti come formati di file ai or. pdf, a seconda di quale sia appropriato per il programma di grafica vettoriale e il taglio laser. Preparare la taglierina laser per il taglio secondo le specifiche del produttore e assicurarsi che venga utilizzata una ventilazione sufficiente.

Quindi posizionare un foglio di acrilico da 1/4 di pollice sul letto laser. Regolare l'altezza del letto in modo che sia calibrato correttamente sull'acrilico. Quindi, apri il file di progettazione sul computer collegato alla taglierina laser e apri il menu Stampa.

Assicurarsi che la taglierina laser sia impostata come stampante e che l'opzione Non ridimensionare sia selezionata nel menu a discesa Ridimensionamento per evitare distorsioni del disegno. Quindi, fai clic sul pulsante Stampa nella parte inferiore della finestra di dialogo Stampa. Nell'utilità di stampa della taglierina laser, fare clic sul pulsante di impostazione per impostare i parametri di incisione del taglio per ciascuna delle caratteristiche del design.

Qui, imposta i parametri di potenza, velocità e impulsi per pollice per ciascuno dei colori scelti in precedenza. Una volta inserite le impostazioni, fare clic sul grande pulsante verde nel software di taglio laser. Ciò farà sì che la taglierina laser inizi a incidere e tagliare gli stampi master negativi.

Infine, utilizzare una piccola spazzola o aria compressa per rimuovere eventuali detriti residui dagli stampi master negativi. Questo preparerà la superficie per la colata PDMS. Preparare una miscela di colata PDMS secondo le specifiche del produttore.

Degassare il PDMS preparato in una camera a vuoto collegata a un laboratorio di vuoto a linea standard per un'ora o fino a quando tutte le bolle sono state eliminate. Mentre il PDMS viene degasato, prendere il bordo esterno dello stampo con vinile o nastro adesivo, in modo che il nastro si estenda di almeno tre millimetri sopra la faccia incisa dello stampo master negativo. Assicurati di premere saldamente il nastro contro il lato dello stampo in modo da evitare perdite in seguito.

Successivamente, versare circa 0,35 millilitri per centimetro quadrato di PDMS nello stampo master in modo che il PDMS raggiunga uno spessore minimo di 1,5 millimetri. Posizionare lo stampo master negativo rivestito con PDMS in una camera a vuoto e degassare nuovamente per un'ora o fino a quando tutte le bolle sono state eliminate. Quindi, posizionare lo stampo master negativo rivestito di PDMS degasato su uno scaffale piano in un forno a 60 gradi Celsius per almeno sei ore per polimerizzare il PDMS.

Una volta induriti, utilizzare una lama di rasoio per tagliare i singoli stampi mentre sono ancora sullo stampo master negativo. Quindi, staccare lentamente e con attenzione ogni stampo PDMS dallo stampo master negativo. Taglia tutte le regioni con un menisco da colata, che impedirebbe allo stampo di rimanere piatto, così come il materiale in eccesso o i detriti.

Infine, sterilizzare in autoclave gli stampi utilizzando un ciclo di autoclave standard per sterilizzarli per la coltura dei tessuti. Per iniziare, far aderire gli stampi a piastre di plastica non trattata. Preparare le soluzioni di fibrinogeno, trombina e collagene neutralizzato e raccogliere le cellule desiderate come descritto nel protocollo di testo allegato.

Combina il fibrinogeno, il collagene neutralizzato e la sospensione cellulare per creare una miscela di colata. Mantieni il mix di colata sul ghiaccio. Successivamente, utilizzare un generatore portatile ad alta frequenza per trattare le superfici dello stampo che saranno esposte alla miscela di colata per mitigare l'idrofobicità PDMS.

Esporre le superfici al trattamento al plasma da tre a cinque secondi, circa cinque minuti prima di fondere il materiale. Immediatamente prima di fondere la miscela di cellule proteiche, aggiungere la trombina alla miscela di colata e pipettare delicatamente su e giù senza introdurre bolle. Lavorando rapidamente, pipettare la miscela di colata negli stampi con cura per depositare la miscela in tutti gli angoli e le fessure dello stampo.

Evitare di espellere la miscela oltre il primo arresto della pipetta per evitare la formazione di bolle all'interno dei costrutti. Quindi, posizionare i campioni in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius per 45 minuti. Dopo 45 minuti, rimettere i costrutti nella cappa e coprirli con mezzi cellulari prima di tornare nell'incubatore.

Cambiare il supporto della cella ogni 48-72 ore in base alle esigenze della cella e del tipo di costrutto. Infine, seguire il protocollo di testo di accompagnamento per quantificare la compattazione dei tessuti e le proprietà di trazione dei costrutti, nonché per preparare varie tecniche di colorazione e misurare l'allineamento cellulare. Nel corso del tempo e della coltura, i costrutti cellularizzati si compattano a causa del rimodellamento della matrice.

Ciò si verifica sia attraverso la riorganizzazione che attraverso la degradazione della matrice circostante ed è tipicamente associato ad un aumento della rigidità meccanica. La compattazione diretta può anche indurre campi di stress all'interno del tessuto, che possono essere manipolati in costrutti cellularizzati per incoraggiare l'allineamento cellulare. Queste due immagini sono state prese da costrutti di tessuto cardiaco che sono stati cresciuti in stampi rettangolari di tre millimetri per 17 millimetri con perni alle due estremità.

E queste due immagini sono costrutti di tessuto cardiaco che sono stati cresciuti senza vincoli. I due costrutti che sono stati vincolati sono stati in grado di compattarsi solo nelle restanti due direzioni e hanno portato all'allineamento cellulare indotto dallo stress. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere utilizzata per progettare, fabbricare e implementare stampi in tessuto personalizzati in meno di un giorno.

Dopo la formazione dei tessuti, è possibile eseguire altri metodi, come i test meccanici e l'istologia, per comprendere ulteriormente gli effetti dell'allineamento sulla morfologia cellulare e sulla funzione dei tessuti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come fabbricare stampi per tessuti PDMS personalizzati da master acrilici tagliati al laser.