Identificazione di High-throughput di combinazioni di farmaci sinergici con il metodo² di sovrapposizione

L'obiettivo generale di questa metodologia è quello di identificare le molecole sinergiche, che si amplificano a vicenda, quando combinate attraverso lo screening ad alto rendimento. Le coppie di farmaci sinergici sono una strategia promettente per combattere le infezioni resistenti ai farmaci, ma sono difficili da identificare. Questo metodo è in grado di identificare le molecole che interagiscono con i farmaci antimicrobici esistenti utilizzati per trattare le malattie infettive.

A lungo termine, queste combinazioni possono entrare nella valutazione preclinica e, infine, migliorare la cura del paziente. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere eseguita con qualsiasi organismo di interesse e con qualsiasi libreria di piccole molecole. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia di molteplici malattie infettive in quanto funziona con qualsiasi organismo di interesse.

Utilizzare un foglio di calcolo standard per calcolare il punteggio medio di crescita e la deviazione standard per tutti i mutanti, in presenza di una particolare concentrazione della piccola molecola aggiunta. Quindi, calcola i punteggi Z per ciascuna delle concentrazioni di piccole molecole. Quindi, evidenzia i mutanti genetici con punteggi Z significativi.

Per prima cosa, coltiva una coltura di E.coli in un terreno minimo M9, per una notte a 37 gradi Celsius. Quindi, sciogliere le piccole molecole in dimetilsolfossido ad una concentrazione elevata superiore a 10 milligrammi per millilitro. Quindi, aggiungere 100 microlitri di terreno M9 a ciascun pozzetto in una piastra a 96 pozzetti.

Pipettare altri 100 microlitri di terreno M9 nella colonna uno in modo che il volume in quella colonna sia di 200 microlitri. Quindi, aggiungere circa 10 microlitri della soluzione concentrata di piccole molecole, in quella della colonna. Dopo aver aggiunto le piccole molecole, iniziare a diluirlo lungo l'asse X della piastra.

Continuare a diluire fino a quando non si ottengono 100 microlitri nella colonna 11. Dopo aver miscelato la colonna 11, scartare 100 microlitri da quella colonna. Sia presente solo un mezzo nella colonna 12 per normalizzare i dati.

Successivamente, registrare il valore della densità ottica a 600 nanometri della coltura notturna coltivata in terreno minimo M9. Quindi, aggiungi due microlitri di coltura in ciascun pozzetto. In modo tale che ci siano 1000 cellule per pozzetto.

Quindi, agitare delicatamente il piatto. E notate la lettura della densità ottica a 600 nanometri per l'ora zero. Una volta registrata la lettura, incubare la piastra a 37 gradi Celsius per un giorno.

Ancora una volta, misurare il valore della densità ottica a 600 nanometri per un punto temporale di 24 ore. Per eseguire il saggio a scacchiera, coltivare una coltura di E.coli in terreno minimo M9 per una notte a 37 gradi Celsius. Quindi, aggiungere 100 microlitri di terreno M9 a ciascun pozzetto e aggiungere altri 100 microlitri dello stesso terreno nella colonna uno di una piastra a 96 pozzetti.

Successivamente, aggiungere le piccole molecole dei test, in ogni pozzetto della colonna uno. E aggiungere il doppio della concentrazione nel pozzetto A1. Quindi, creare un gradiente di diluizione lungo l'asse X trasferendo 100 microlitri, dalla colonna uno alla colonna due. Continuare il processo di diluizione, fino a quando non vengono aggiunti 100 microlitri nella colonna 11.

Dopo aver miscelato la colonna 11, scartare 100 microlitri da quella colonna e lasciare la colonna 12 con solo terreno senza farmaci. Creare un altro gradiente per la seconda diluizione del farmaco. Per fare ciò, aggiungere 100 microlitri del terreno contenente due X, concentrazione inibitoria minima della molecola in ingresso nella riga A.Quindi, trasferire 100 microlitri dalla fila A alla B.Continuare il processo di diluizione, fino a quando non vengono aggiunti 100 microlitri nella riga G.Dopo aver mescolato la riga G, scartare 100 microlitri dal pozzetto.

Quindi inoculare la piastra con due microlitri di coltura in ciascun pozzetto. In modo tale che ci siano 1000 cellule per pozzetto. Quindi, misurare la lettura della densità ottica a 600 nanometri per il punto orario dell'ora zero.

Una volta registrata la lettura, incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 24 ore. Quindi, misurare il valore della densità ottica a 600 nanometri per un punto temporale di 24 ore. Per condurre screening ad alto rendimento, per farmaci sinergici, colture di cellule mutanti sia wild type che di previsione sinergica in terreno minimo M9.

Quindi, aggiungi i farmaci dalla libreria al mezzo. Successivamente, inoculare una piastra di farmaci da libreria con il tipo selvatico e un'altra piastra con batteri mutanti di previsione della sinergia. Questa piastra rappresenta il test a scacchiera utilizzato per studiare le combinazioni di farmaci sinergici.

In questa piastra, il pozzetto F9 con il punteggio FICI più basso di 0,07 indica che la coppia di piccole molecole è sinergica. Questa piastra rappresenta il test a scacchiera per studiare la combinazione di farmaci non interagenti. In questa piastra, il pozzetto C3 con il punteggio FICI più basso di 1,0 indica che la piccola coppia di molecole non interagisce tra loro.

Questa piastra rappresenta il test a scacchiera utilizzato per studiare le combinazioni di farmaci antagonisti. In questa piastra, il pozzetto A1 con il punteggio FICI più basso di 8,0 indica che l'interazione tra le molecole del farmaco è antagonista. Successivamente la befeldina A, un farmaco a piccola molecola nel fluconazolo, viene utilizzata per studiare la crescita delle formine C e U.

Il grafico mostra che la crescita sia del wild type che del mutante di previsione della sinergia è leggermente inibita e nella stessa misura. Ciò indica che la befeldina A e il fluconazolo sono partner farmacologici non sinergici. Al contrario, la crescita del mutante di predizione sinergica delle formine C e U è inibita in modo significativo, in presenza di Refromisyn e Fluconazolo.

Indicando che i farmaci sono partner sinergici. È interessante notare che la crescita di tipo selvatico non è affatto inibita. Qui, si osserva la maggiore differenza di crescita, tra 32 e 49 ore dopo l'inoculazione.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può ridurre il tempo necessario per identificare le interazioni farmacologiche sinergiche. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di non combinare i farmaci nell'ultima colonna dell'ultima riga del test a scacchiera. Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi di identificazione sinergica delle molecole al fine di identificare ulteriori interazioni farmacologiche sinergiche.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare la metodologia O2M per identificare i marcatori di sinergia putativi al fine di trovare interazioni farmacologiche sinergiche con il tuo organismo di interesse. Non dimenticare che mentre si lavora con alcune piccole molecole può essere pericoloso e tutte le precauzioni nella MSDS, dovrebbero essere seguite durante l'esecuzione di questo protocollo.