Imaging del Neuroinflammation utilizzando [¹¹C] DPA-713 in un modello murino di ictus ischemico per animali

L'obiettivo generale di questo esperimento è quantificare con precisione la distribuzione spaziale e l'estensione della neuroinfiammazione in un modello murino di ictus ischemico utilizzando TSPO-PET e imaging RM e convalidare questi risultati in vivo utilizzando l'autoradiografia ex vivo. Sono davvero entusiasta di condividere con voi questa guida passo passo su come utilizzare l'imaging PET per visualizzare la neuroinfiammazione in un soggetto vivente. Qui stiamo usando un modello murino di tratto come esempio.

Ora, perché potresti voler usare questa tecnica? Ci sono un paio di motivi. La prima è che la neuroinfiammazione, che è solo l'infiammazione che si verifica nel sistema nervoso centrale, si pensa sia intimamente associata e in realtà qualcosa che è alla base di molte, molte malattie cerebrali, tra cui l'ictus ma anche il morbo di Alzheimer, la sclerosi multipla, il Parkinson e l'elenco potrebbe continuare.

Quindi è incredibilmente importante avere queste tecniche che ci permettono davvero di studiare questi fenomeni biologici. In secondo luogo, l'imaging PET offre una serie di vantaggi rispetto ad alcune delle tecniche più tradizionali. Ad esempio, la maggior parte di queste tecniche tradizionali si basa fortemente sull'utilizzo di tessuto cerebrale post-mortem umano e di topo e, sebbene abbiano fornito una serie di importanti intuizioni, queste tecniche sono statiche per natura, il che significa che possono davvero dirci informazioni solo su un momento nel tempo.

Dal momento che sappiamo che sia il cervello che il sistema immunitario sono altamente dinamici, ha senso che vorremmo avere una tecnica che ci permetta di catturare davvero questi processi molecolari in sistemi viventi intatti, quindi nel loro ambiente nativo in tempo reale, e questo è esattamente ciò che fa l'imaging PET. Qui ti mostreremo come utilizziamo uno specifico radiotracciante PET, DPA-713, che è noto per legarsi alla TSPO o proteina traslocatore. Vi mostreremo in particolare come iniettiamo un'immagine non solo in un topo ma in quattro topi contemporaneamente in modo dinamico, e il motivo per cui questo è un grosso problema è che aiuta davvero ad aumentare il numero di topi che è possibile visualizzare in un dato giorno con lo stesso lotto di tracciante, semplificando così davvero i vostri esperimenti.

Anche se questo è tecnicamente impegnativo, spero davvero che questo video possa aiutarti a guidarti in modo che tu possa eseguirlo nel tuo laboratorio. Inizia posizionando i topi anestetizzati proni sul letto dello scanner PET/CT, assicurandoti che siano raddrizzati e saldamente nei coni del naso. Fissare la testa e il corpo di ciascun topo al letto con un nastro chirurgico morbido, assicurandosi che la respirazione non sia limitata dal posizionamento del nastro.

Una volta che gli animali sono al sicuro nel letto e la respirazione è stabile, accendi il mirino laser e sposta il letto di scansione in modo che si allineino con il cervello di tutti e quattro i topi. Spostare il piano dello scanner nella posizione di acquisizione con il cervello dei topi il più vicino possibile al centro del campo visivo. Acquisisci un'immagine di visualizzazione scout dei topi per verificare la loro posizione e regola la posizione trascinando la casella del campo visivo sull'interfaccia, se necessario.

Infine, fare clic su Avvia flusso di lavoro nel software dello scanner per avviare la scansione CT, assicurandosi di selezionare la visualizzazione di istruzioni interattive per l'utente, in modo che la scansione PET possa essere avviata manualmente prima dell'iniezione del tracciante. Una volta che i topi passano automaticamente dalla TC alla PET, impostare la parte posteriore dello scanner per l'iniezione del radiotracciante. Posiziona un'imbottitura protettiva e assorbente su una sporgenza e assicurati che le forbici e l'accendino siano a portata di mano.

Tagliare il tubo del catetere sigillato con le forbici. Controllare che le linee del catetere siano prive di bolle e confermare che la cannula sia ancora all'interno della vena eseguendo un lavaggio con soluzione fisiologica da 10 a 20 microlitri, quindi caricare le siringhe di dose precedentemente misurate in ciascuno dei quattro cateteri, tenendo traccia di quale dose è stata somministrata a ciascun topo. Fare clic su OK quando la scansione PET è pronta per l'avvio e contemporaneamente avviare un timer di 10 secondi.

Avere due ricercatori sul retro dello scanner con le siringhe dosatrici in mano per iniettare tutti e quattro i topi contemporaneamente quando il timer raggiunge lo zero. Sciacquare ogni catetere con 50-100 microlitri di soluzione fisiologica per assicurarsi che l'intera dose entri nella vena caudale e richiudere nuovamente il tubo con un accendino. Quindi, misurare le siringhe di dose utilizzando un calibratore di dose per ottenere un valore di radioattività residua.

Prendere nota dei valori e dell'ora in cui vengono registrati. Una volta completata la scansione, riporta la cuccia alla posizione originale utilizzando il pulsante Home orizzontale all'interno del pannello di controllo del movimento. Rimuovere i mouse dallo scanner e rimuovere con cautela il catetere.

Applicare delicatamente una pressione sul sito di incannulamento per evitare un sanguinamento eccessivo. Quindi misurare l'attività residua nel catetere utilizzando un calibratore di dose. Infine, ricostruisci i dati aprendo il software di gestione della post-elaborazione, che ricostruirà automaticamente ogni scansione utilizzando i dati dell'istogramma generati dal primo file.

Per l'analisi PET, iniziare aprendo il software di analisi delle immagini, facendo clic sull'icona Apri dati per caricare l'immagine CT e selezionando l'icona Aggiungi dati per caricare la PET dinamica. Eseguire un controllo visivo della qualità dei dati tramite l'operatore delle serie temporali nel menu a discesa. Selezionate riferimento e globale e applicate un valore minimo e massimo appropriato per la scala di colori.

Visualizza i dati PET dinamici fotogramma per fotogramma, verificando l'assorbimento della radioattività e controllando eventuali confusioni di movimento all'interno della scansione. Quindi, crea un'immagine PET media utilizzando la funzione Aritmetica. Scegliete la media selezionata, deselezionate Riferimento e assicuratevi che l'opzione Input 1, Input 2 e Input siano selezionati per creare una media di tutti i fotogrammi PET.

Andare alla scheda Gestione dati e trascinare l'immagine media fino alla posizione Input 1 per consentire la visualizzazione del segnale PET utilizzando l'immagine PET media. Quindi, ridistribuisci la scala dei colori facendo clic sul calcolo automatico nello strumento Min/Max. Quindi, registrare il CT sul file PET medio utilizzando la funzione 3D automatica nel menu a discesa Registrazione riorientamento.

Selezionate Rifmto (Ref) e Input 1 (Input 1), quindi Rigido (Rigid), Veloce (Fast), Input 1 (Input 1) per la registrazione dei rifm. Controllare visivamente la registrazione in tutte e tre le dimensioni e regolare manualmente se necessario nella scheda Manuale 3D utilizzando le funzioni di Traslazione e Rotazione. Una volta effettuata la registrazione, selezionare Input 2 e Input e applicare a tutti i frame PET facendo clic sul segno di spunta.

Fare clic con il pulsante destro del mouse sui file CT e PET nel DM e salvare come raw. Quindi, seleziona Ritaglio dal menu a discesa e trascina i bordi dell'immagine per ritagliare la testa di un mouse alla volta sotto il tronco cerebrale. Riorienta manualmente le immagini PET e TC in modo che il cranio sia dritto in tutte le dimensioni.

Caricare l'immagine MR per quel mouse utilizzando il pulsante Aggiungi dati in alto a sinistra dell'interfaccia. Spostare la risonanza magnetica utilizzando il riorientamento 3D manuale e adattarla al cranio all'interno dell'immagine TC. Quindi, disattiva la visualizzazione PET deselezionandola nella scheda Controller visivo e utilizza solo la risonanza magnetica e la CT per disegnare la regione di interesse o il ROI.

Nello strumento ROI 3D, fai clic sul pulsante Aggiungi ROI per creare un nuovo ROI e chiamarlo Infarct. Seleziona lo strumento Spline, facendo clic con il pulsante sinistro del mouse per disegnare il bordo ROI e facendo clic con il pulsante destro del mouse per chiuderlo. Successivamente, crea un nuovo ROI ed etichettalo come controlaterale.

Fare clic con il pulsante destro del mouse su Infarct ROI e selezionare Esporta. Quindi spostare la ROI in posizione 2, Ingresso 1, per consentire la visualizzazione e il riorientamento manuale della nuova ROI. Con solo l'ingresso 1 selezionato, selezionare la casella ROI e scegliere Solo visualizzazione per consentire la visualizzazione della ROI dell'infarto senza riorientarla.

All'interno del menu Registrazione riorientamento, applicare un capovolgimento sinistra-destra utilizzando la funzione Operatore e spostare manualmente la nuova ROI nella stessa regione sul lato controlaterale. Quindi, selezionare l'operatore Aritmetica e applicare una moltiplicazione scalare di due al nuovo ROI, consentendo la quantificazione indipendente dei ROI. Torna allo strumento ROI 3D.

Vai alla scheda Esperto e Sperimentale e fai clic sul pulsante Importa ROI. Selezionare Input 1 dalla finestra di dialogo per caricare il nuovo volume come ROI controlaterale. Infine, fai clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine PET media, scaricala e riaccendi il PET.

Genera i risultati quantitativi dell'adozione utilizzando l'icona Esporta risultati all'interno dello strumento ROI 3D. Le immagini PET/CT risultanti e le curve di attività temporale mostrano un aumento dell'assorbimento del radiotracciante negli emisferi omolaterali rispetto a quelli controlaterali. La quantificazione delle immagini cerebrali dinamiche PET utilizzando dati sommati da 50 a 60 minuti ha rivelato un aumento significativo dell'assorbimento del tracciante nell'emisfero omolaterale rispetto a quello controlaterale nel dMCAO ma non nei topi fittizi utilizzando l'approccio ROI disegnato manualmente.

Dopo aver osservato questa tecnica, dovresti avere una buona comprensione di come quantificare in modo accurato ed efficiente la neuroinfiammazione in un modello murino di ictus ischemico tramite TSPO-PET, utilizzando metodi di analisi delle immagini sia automatici che manuali. È importante sottolineare che dovresti anche essere in grado di confermare questi risultati in vivo utilizzando l'autoradiografia digitale ex vivo. Poiché l'emivita del carbonio 11 è così breve, è fondamentale mappare un piano sperimentale chiaro e una tempistica prima di tentare questa procedura al fine di massimizzare la quantità e la qualità dei dati.

Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come l'immunoistochimica, per rispondere a ulteriori domande, come la correlazione tra l'attivazione gliale e l'espressione di TSPO. Tenete presente che l'uso della radioattività può essere estremamente pericoloso. Per ridurre al minimo l'esposizione, utilizzare indumenti protettivi, scudi di piombo e aumentare la distanza durante l'esecuzione di questa procedura.