Name: Imaging del Neuroinflammation utilizzando 11C DPA-713 in un modello murino di ictus ischemico per animali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 1 s
Description: Scopri l'imaging PET con il radiotracers DPA-713 per visualizzare la neuroinfiammazione in un modello murino di ictus ischemico. Questo metodo consente l'osservazione in tempo reale dei processi biologici dinamici.

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Gli autori vorrei ringraziare il laboratorio Buckwalter (soprattutto Dr. Todd Peterson) per fornendo il modello del mouse ed eseguire gli interventi chirurgici dMCAO e sham. Inoltre, vorremmo ringraziare Thomas Liguori da Invicro per la sua assistenza tecnica con software di analisi di immagine VivoQuant, Dr. Tim Doyle, Dr. Laura Pisani, Dr. Frezghi Habte dall'animale piccolo SCi3 imaging facility a Stanford per i loro consigli e assistenza nello sviluppo di questo protocollo di imaging e la struttura di radiochimica (soprattutto Dr. Jun Park) per il loro aiuto con la sintesi del [11C] DPA-713.

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Gli autori non dichiarano conflitti di interessi.

Il protocollo presentato descrive un metodo per la quantificazione del neuroinflammation in topi dMCAO e sham usando [11C] DPA-713-PET. TSPO-PET è il più ampiamente studiato biomarcatore imaging per la visualizzazione e misurazione neuroinflammation in vivo fino ad oggi. L'espressione TSPO è aumentata su glia nel cervello durante l'infiammazione permettendo la rilevazione non invasiva e la quantificazione del neuroinflammation. Inoltre, è una tecnica altamente traducibile, che lo rende uno strumento prezioso nella ricerca pre-clinica e clinica. Questo protocollo e risultati rappresentativi evidenziano l'idoneità di utilizzo [11C] PET DPA-713 per rilevare e monitorare neuroinfiammatorie alterazioni nel colpo e altri disturbi neurologici in vivo.
In questo studio, dMCAO ambulatorio è stato effettuato utilizzando 3-mese-vecchi topi femminili C57BL/6. Questo modello è stato scelto in quanto dà luogo ad un infarto altamente riproducibile limitato alla corteccia somatosensoriale, fornendo un modello di ischemia focale permanente con bassa variabilità rispetto ad altri modelli di ictus (ad es., centrale cerebrale arterioso Metodo di occlusione (MCAO) filamento)14. PET imaging dei modelli di ictus ha il vantaggio di contenere un'area di riferimento interno nel cervello per ogni animale utilizzando ROIs all'interno dell'emisfero controlaterale. Dal momento che ci sarà qualche infiammazione che risultati dalla chirurgia da solo, è importante includere i topi che hanno subito la chirurgia di sham nel disegno dello studio, per cui il craniotomy e manipolazione dei meninges senza occlusione dell'arteria è stata realizzata. Craniotomia da solo può causare disagi alla sottostante tessuto neuronale e introduzione di agenti patogeni che conducono a risposte immunitarie indipendente di corsa20. Qualche infiammazione dopo l'intervento chirurgico sham prevede pertanto e dovrebbe essere valutati in parallelo con dMCAO per escludere la possibilità del segnale a causa della sola chirurgia. Per evitare di includere infiammazioni derivanti dalla chirurgia senza colpo in analisi di coorte dMCAO, risonanza magnetica deve essere condotta per confermare lo sviluppo di colpo riuscito ambulatorio e infarto. MRI fornisce anche un quadro di riferimento strutturale, che è essenziale per disegnare con precisione l'infarto e ROIs controlaterale. Sono inoltre necessari per garantire la quantificazione affidabile elaborazione immagine precisa compresa la registrazione di immagine e definizione di ROI.
Ulteriori limitazioni devono essere tenute presente quando si lavora con C-11 etichettato radiotraccianti per studi PET e autoradiografia. È indispensabile considerare la breve emivita (20,33 min) di C-11, con il suo uso limitato per istituti con accesso in loco ciclotrone di ricerca. Percorso di trasporto appropriato radioattività, somministrazione di una dose e tempo-punti di acquisizione deve essere determinati in anticipo con un pre-preparato piano dettagliato del flusso di lavoro dell'esperimento affinché il team possa lavorare rapidamente ed efficientemente. La progettazione e la realizzazione di questo studio è stato delineato per ospitare la formazione immagine di 4 topi simultaneamente per aumentare l'output di dati ottenibili quando si utilizza un tracciante C-11. Se possibile, si consiglia di avere tutti i topi cannulati e nel mezzo loro esplorazione di CT con il tempo il tracer C-11 arriva al centro di imaging per assicurare decadimento minimo radiotraccitore prima dell'iniezione. Questo protocollo passo-passo è anche meglio effettuato da un team che contiene almeno 3 ricercatori per consentire rapido inserimento di una canula, misura della dose, iniezione dell'elemento tracciante, scansione PET e cervello sezionamento prima del decadimento radioattivo significativo. Richiede due persone per condurre l'inizio della scansione PET e iniezione di tutti e 4 i topi simultaneamente. Il motivo per l'acquisizione di PET appena prima dell'iniezione di inizio è quello di garantire che la farmacocinetica e la dinamica della distribuzione dell'elemento tracciante nel sangue e aree di interesse sono esattamente e completamente catturati. Molti passi possono richiedere vigorosa formazione e pratica per garantire il regolare svolgimento dell'esperimento. In particolare, questo protocollo dipende dall'inserimento di una canula della vena coda successo dei topi C57BL/6, che può essere difficile a causa di peli presenti sulle loro code e possono diventare più impegnativo dopo ictus si è verificato o se stessi topi di imaging a intervalli di tempo più .
Un'altra considerazione per l'imaging PET comprende la registrazione accurata del radiotraccitore dose e residuo misure di attività, tra cui l'ora esatta di misura. Questo è essenziale per la correzione accurata decadimento della dose iniettata al momento della scansione e viene utilizzato per ottenere una misurazione accurata di assorbimento dell'elemento tracciante (cioè, % ID/g) per ogni ROI. È indispensabile conoscere l'esatta quantità di radioattività che era presente in ogni mouse al momento della scansione per garantire un'immagine precisa analisi. Pertanto, si consiglia di sincronizzare gli orologi dei computer scanner e calibratore di dose per evitare l'errore quando si utilizza isotopi di breve durata come C-11.
Quantificazione accurata di immagine PET può essere limitata anche dalla precisione lo scanner e il set-up. Quindi per garantire la quantificazione accurata di immagini PET/CT, è importante effettuare controlli di qualità per il CT e il PET componenti dello scanner. Controlli di qualità CT includono condizionata fonte di raggi x, buio/luce e centro off set calibrazioni. Queste calibrazioni misurano e corretta per mosto e rumore del sistema essere eseguito prima dell'acquisizione, come raccomandato dal produttore dello scanner. Tarature devono essere eseguite anche per la PET scan. Questo in genere comporta la scansione di una scansione "standard / PET fantasma", contenente una concentrazione nota di radioattività. Quando si prepara lo standard, è preferibile utilizzare il radioisotopo stesso utilizzato nello studio, una dose paragonabile a quello somministrato a un singolo topo in un volume simile al corpo di un topo e la stessa acquisizione parametri come animale imaging. Una siringa da 20 mL riempita con radiotraccitore diluito in acqua viene utilizzata per lo standard in questo protocollo, con i successivi risultati di imaging PET utilizzati per calcolare un fattore di correzione basato sulla dose effettiva misurata dal rilevatore di calibrazione. Il rapporto di correzione può essere applicato ai dati immagini acquisiti nell'esperimento per garantire accurata quantificazione di assorbimento dell'elemento tracciante nelle regioni di interesse in immagini PET. Questo account per la gamma di positroni del radionuclide oltre a considerare qualsiasi attività di fondo presente il giorno dell'esame. Come il calibratore di dose è parte integrante della generazione di questo fattore di correzione, è imperativo che questa apparecchiatura è anche calibrata regolarmente secondo le indicazioni del produttore.
Quando lo svolgimento di ex vivo autoradiografia è importante scegliere un tempo-punto ottimale per l'eutanasia dopo l'iniezione, per garantire il segnale--fondo alta in regione come area di interesse. Trenta minuti dopo l'iniezione è stato scelto per autoradiografia DPA-713 [11C] utilizzando i dati acquisiti durante la formazione immagine PET dinamica -cioè, l' in vivo TAC dinamico come guida, tenendo anche conto della breve emivita di C-11 e il tempo coinvolti per sezione ed esporre il tessuto cerebrale dopo l'estrazione. Considerando questo, autoradiografia DPA-713 [11C] deve essere eseguita su una coorte separata dei topi per consentire l'iniezione di una dose maggiore di DPA-713 [11C] e 30 minuti di tempo-punto per aspersione e l'eutanasia in anestesia. Eseguire un piccolo in vivo studio pilota dell'animale domestico con un 3-4 topi prima di svolgere ex vivo autoradiografia sarà utile per la determinazione del punto di tempo ottimale per autoradiografia. Un'ulteriore considerazione per ex vivo autoradiografia è se recuperare i topi dopo l'iniezione o tenerli anestetizzati fino ad eutanasia. Mantenendoli anestetizzati imita le condizioni della scansione e assicura la cinetica di distribuzione o l'escrezione del radiotraccitore non vengono alterate da recupero. Inoltre, questo impedisce ulteriore stress sui topi evitando recupero e successiva induzione. Infine, un'utile aggiunta al protocollo ex vivo sarebbe valutare il danno regionale le fettine di cervello utilizzato per autoradiografia tramite immunoistochimica (dopo il decadimento radioattivo) per generare un'immagine ad alta risoluzione della posizione di infarto e volume.
Come ci sono limitazioni con l'uso di un tracciante C-11 basato, questo protocollo può essere modificato facilmente per uso con un F-18 (emivita di 109,77 min) basato TSPO tracer, che può essere più applicabile alle posizioni senza un ciclotrone in loco. Inoltre, questo protocollo viene descritto l'utilizzo di un mouse 4 imaging set-up. Anche se questo metodo di rendimento elevato è ottimo quando si utilizza un tracciante C-11, questo protocollo può essere modificato anche per coloro che utilizzano il mouse singolo letti di imaging. Una pianificazione attenta e coerente formazione nelle tecniche descritte in questo protocollo porterà alla generazione di una ricchezza di dati utilizzando [11C] DPA-713, che può essere facilmente applicato a sondare il ruolo del neuroinflammation in manifestazione di malattia e progressione in altri modelli del roditore di disturbi neurologici. Inoltre, questa tecnica potrebbe essere usata per valutare la risposta in vivo per terapie immunomodulatorie mirate alle microglia/macrofagi.

Il colpo è la quinta causa di morte e delle principali cause di disabilità negli Stati Uniti1. Ictus ischemico rappresenta la stragrande maggioranza di questi casi (~ 87%), che si verificano quando c'è rottura localizzata nel flusso di sangue al cervello (per esempio, da un coagulo di sangue o il deposito di grasso). Rifornimenti di ossigeno e nutrienti per le zone colpite sono successivamente ridotto e una cascata patologica complessa viene avviata con conseguente morte di un neurone all'interno del nucleo di ictus (infarto) oltre alle zone circostanti. Neuroinflammation è una componente cruciale nella via che conduce a questo danno, con entrambe le cellule immunitarie del cervello residente (microglia) e infiltrazione di cellule immuni periferiche (neutrofili, linfociti T, linfociti B e monociti/macrofagi) pensato per contribuire a questo la cascata distruttiva2,3. Macrofagi e microglia attivata sono fondamentali per questa risposta neuroinfiammatorie, con segnalazioni di effetti deleteri sia benefici dopo ictus ischemico2. Pertanto, è indispensabile per valutare il contributo in vivo di queste cellule che segue il colpo.
PET è una potente tecnica di imaging molecolare 3-dimensionale che permette la visualizzazione del biologico i processi in vivo mediante l'utilizzo di specifiche molecole etichettati con positroni (β +) che emettono i radionuclidi come 11C, 13N, 15O e 18F. Questo metodo non-invasivo ha molti vantaggi rispetto ai metodi ex vivo (ad es., immunoistochimica) poiché permette l'acquisizione di informazioni molecolari in tempo reale, in soggetti intatto di viventi e consente per indagine longitudinale su. Imaging PET di TSPO, un indicatore di microglia attivata e cellule mieloidi periferiche, fornisce un mezzo per quantificare e tenere traccia delle risposte delle cellule immuni innate all'interno del corpo e può essere utilizzato per valutare l'infiammazione dopo ictus e risposta terapeutica interventi. TSPO, precedentemente noto come il recettore periferico delle benzodiazepine, è una proteina di 18 kDa che è creduta per svolgere un ruolo nel trasporto del colesterolo e la sintesi di neurosteroidi4. Inoltre, la prova suggerisce che TSPO è coinvolto nella neuroinflammation e sopravvivenza neuronale5,6, con rapporti di espressione aumentata in molti disordini neurologici che coinvolgono l'infiammazione compreso colpo7, 8di demenza, morbo di Parkinson9 e sclerosi multipla10. TSPO si trova sulla membrana mitocondriale esterna ed è altamente espresso in periferia, in particolare in steroidi relativi tessuti (ad es., ghiandole) e con livelli intermedi visti nel cuore, reni e polmoni10. Tuttavia nel cervello sano, TSPO livelli sono bassi e limitato principalmente al glia6,11. Dopo un danno di un neurone, come quello osservato nel colpo, TSPO livelli nel sistema nervoso centrale (SNC) aumentano significativamente. Questo upregulation osservato di TSPO può essere sfruttato per immagine neuroinflammation in vivo, con livelli di espressione fornendo un accurato indicatore della severità di infiammazione. Quindi, l'obiettivo di questo metodo è quello di quantificare con precisione il contributoin vivo del neuroinflammation in un modello murino di colpo ischemico utilizzando TSPO-PET.
Più elementi traccianti TSPO sono stati sviluppati per l'imaging PET di neuroinflammation. Qui, imaging TSPO-PET è descritto usando [11C] DPA-71312, una promettente generazione secondo tracer TSPO, che ha mostrato maggiore segnale al rumore e abbassare il legame non specifico il più storicamente usato [11C] PK11195 13 . Ad esempio, il modello del mouse dMCAO del colpo è stato scelto per questo metodo14. Questo modello prevede craniotomy temporale e la legatura permanente dell'arteria cerebrale centrale distale, con conseguente ischemia focale della corteccia somatosensoriale. Questo è vantaggioso in ricerca pre-clinica dell'ictus dovuto l'alta riproducibilità del danno ischemico e tassi di mortalità bassi associati con questo modello. Ad oggi, studi di imaging TSPO-PET devono ancora essere riportati nel modello di roditore dMCAO. Tuttavia, precedenti studi PET imaging utilizzando il modello di occlusione (MCAO) dell'arteria cerebrale media, un modello del colpo più severa e variabile, in entrambi i topi e ratti, hanno segnalato espressione TSPO aumentare dal giorno 3 e picco intorno 7 ° giorno post-ictus15, 16,17,18. Quindi, abbiamo effettuato la PET imaging 6 giorni post-dMCAO in concomitanza con espressione TSPO elevata. [11C] DPA-713 assorbimento nel cervello è stata valutata in ipsilateral (colpito da infarto) e gli emisferi controlaterali. TSPO-PET è stato combinato con MRI strutturale, consentendo una precisa delineazione dell'infarto e controlaterale regioni di interesse (ROI). Qui descriviamo un Atlante-based e un approccio basato su MRI ROI per calcolare l'assorbimento di DPA-713 [11C]. L'assorbimento del radiotraccitore nella milza inoltre è stata valutata per indagare i livelli periferici di infiammazione tra gruppi. Questo metodo ha il potenziale per fornire approfondimenti critici la dinamica spazio-temporale e ruolo delle interazioni specifiche neuroimmune nell'ictus e altre malattie neurologiche.

<table><tbody><tr><td>Scanner PET/CT Inveon</td><td></td><td>Siemens versione 4.2</td><td></td></tr><tr><td>scanner MRI</td><td>Varian</td><td></td><td>7 Software Telsa</td></tr><tr><td>ParaVision</td><td>Bruker</td><td>versione 6.0.1</td><td>Software operativo MRI</td></tr><tr><td>Software VivoQuant</td><td>Software InVicro</td><td>versione 2.5</td><td>Software di analisi delle immagini</td></tr><tr><td>Software Inveon Research Workspace</td><td>Siemens</td><td>Versione 4.2</td><td>Software operativo dello scanner. Include microQView, il software di gestione della post-elaborazione</td></tr><tr><td>Calibratore di dose</td><td>Capintech</td><td></td><td>CRC-15 PET</td></tr><tr><td>Typhoon phosphor imager 9410</td><td>GE Healthcare</td><td>8149-30-9410</td><td></td></tr><tr><td>Cateteri a farfalla SAI</td><td>Infusion Technologies</td><td>BFL-24</td><td>Ago da 27,5 G</td></tr><tr><td>Siringhe da 1 mL BD</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siringhe per insulina</td><td>BD</td><td>329461</td><td>Siringhe da insulina da 0,5 ml con ago</td></tr><tr><td>Siringa da 20 ml&nbsp;</td><td>VWR</td><td>BD302831</td><td>BD Siringa Slip Tip Colla per tessuti graduata</td></tr><tr><td></td><td>Santa Cruz Animal Health</td><td>sc-361931</td><td></td></tr><tr><td>Lampada termica</td> da 3 ml <td>Fluker</td><td>27002</td><td>Lampada termica per rettili da 5,5" con morsetto e interruttore</td></tr><tr><td>Soluzione salina sterile allo 0,9%</td><td>Pfizer</td><td>00409-4888-10</td><td>Cloruro di sodio allo 0,9% per iniezione, 10 ml</td></tr><tr><td>Lubrificante per gli occhi</td><td>Watson Rugby</td><td>PV926977</td><td>Unguento per gli occhi lubrificante per lacrime artificiali, fogli</td></tr><tr><td>assorbenti Chux</td> da 1/8 di oncia <td>ThermoFisher Scientific</td><td>1420662</td><td>Imbottitura assorbente monouso Forbici</td></tr><tr><td>per iride</td><td>World Precision Instruments</td><td>503708-12</td><td>11,5 cm, dritto, confezione da 12</td></tr><tr><td>nastri chirurgici</td><td>3M Durapore</td><td>1538-0</td><td>1/2" x 10 yard rotolo, seta, letto</td></tr><tr><td>per topo PET ipoallergenico In</td><td>casa</td><td></td><td>4 letti per topi</td></tr><tr><td>PET Accendino</td><td>Bic</td><td>UDP2WMDC</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Henry Schein</td><td>NDC 11695-6776-2</td><td>Isotesia, anestetico per inalazione, 250 ml di</td></tr><tr><td>ossigeno</td><td>Praxiar</td><td>UN1072</td><td>Gas compresso</td></tr><tr><td>Cassetta per autoradiografia</td><td>Cole Palmer</td><td>EW-21700-34</td><td>Alluminio, 8" x 10"</td></tr> <tr><td>Pellicola per autoradiografia</td><td>GE Life Sciences</td><td>28-9564-78</td><td>Schermo al fosforo di stoccaggio BAS-IP SR 2025 E Super Resolution, 20 &volte; 25 cm, solo schermo</td></tr><tr><td>Lame per microtomo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>30-508-35</td><td>MB35 Premier Monouso, angolo di taglio di 34 gradi</td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Microm</td><td></td><td>HM 550</td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>Superfrost&trade; Plus Vetrini per microscopio</td></tr><tr><td>OCT liquido</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td>Formulazione di glicoli e resine idrosolubili per il sezionamento di criostati a temperature di -10 gradi; C (14&deg; F) e inferiori</td></tr><tr><td>Stampi per congelamento</td><td>Poly sciences</td><td>18646A-1</td><td>Stampi monouso in paraffina Saran</td></tr><tr><td>wrap Saran</td><td></td><td>25700001300</td><td></td></tr><tr><td>Disinfettante</td><td>Virkon S</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imaging del neuroinflammation utilizzando [11c] dpa-713 in un modello murino di ictus ischemico per animali

PET Imaging of Neuroinflammation Using [11C]DPA-713 in a Mouse Model of Ischemic Stroke

Neuroinflammation è centrale per la cascata patologica dopo ictus ischemico. Metodi non invasivi di imaging molecolare hanno il potenziale per fornire approfondimenti critici la dinamica temporale e il ruolo di determinate interazioni neuroimmune nel colpo. In particolare, la formazione immagine di tomografia a emissione di positroni (PET) di translocator proteina 18 kDa (TSPO), un marker di microglia attivata e cellule mieloidi periferiche, fornisce un mezzo per rilevare e tracciare neuroinflammation in vivo. Qui, presentiamo un metodo per quantificare con precisione utilizzando neuroinflammation [11C]N,N-Diethyl-2-[2-(4-methoxyphenyl)-5,7-dimethylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]acetamide ([11C] DPA-713), una promettente seconda generazione TSPO-PET radiotraccitore, nell'occlusione distale dell'arteria cerebrale media (dMCAO) rispetto ai topi falsità-azionati. MRI è stata effettuata 2 giorni post-dMCAO chirurgia per confermare il colpo e definire la posizione di infarto e il volume. Imaging PET/computata tomografia computerizzata (TC) è stata effettuata 6 giorni post-dMCAO per catturare l'aumento di picco nei livelli TSPO colpo seguente. Quantificazione di immagini PET sono stati intrapresi per valutare l'assorbimento di [11C] DPA-713 nel cervello e milza di topi dMCAO e sham per valutare i livelli centrali e periferici di infiammazione. In vivo [11C] Assorbimento DPA-713 del cervello è stata confermata usando ex vivo autoradiografia.

Topi hanno subito MRI per verificare il successo colpo e [11C] DPA-713 PET è stato effettuato da scansione simultanea di 4 topi. PET, CT e il signor immagini erano co-registrati prima del disegno cervello ROIs manualmente e di eseguire l'analisi di Atlante del cervello Spalato semi-automatizzato, per studiare l'assorbimento dell'elemento tracciante nelle regioni omolaterale e controlaterale (Figura 2).
Immagini PET/CT e curve di tempo attività (attività di TAC-radiotraccitore come funzione del tempo) è possibile visualizzare l'assorbimento aumentato [11C] DPA-713 nell'ipsilaterale rispetto al controlaterali emisferi (Figura 3A). Quantificazione delle immagini dinamiche di cervello di PET, utilizzando Riassunto dati da 50-60 min, hanno rivelato un aumento significativo nell'assorbimento dell'elemento tracciante (% ID/g) nel ipsilateral (colpito da infarto) rispetto all'emisfero controlaterale in dMCAO, ma non nei topi di sham utilizzando manualmente disegnata Approccio ROI (Figura 3B). Assorbimento aumentato inoltre è stato osservato nell'emisfero ipsilateral tra topi dMCAO e falsità. Sono state osservate differenze significative tra gli emisferi ipsilaterale e controlaterale utilizzando l'approccio di Atlante, probabilmente dovuto l'Atlante ROIs è maggiore della dimensione dell'infarto (di solito limitato alla corteccia somatosensoriale), quindi diluire il segnale. Tuttavia, l'assorbimento aumentato complessiva in dMCAO rispetto al sham è stata osservata per tutti ROIs, che si allinea con i rapporti precedenti, utilizzando topi modello MCAO, dimostrando l'espressione TSPO aumentata nelle regioni di fuori del infarct19. Rapporti ipsilateral/controlaterale sono stati aumentati in dMCAO contro i topi di sham utilizzando entrambi gli approcci; Tuttavia, questa differenza era soltanto significativa nella corteccia utilizzando l'approccio di Atlante del cervello a causa delle grandi variazioni nell'approccio ROI. Questo può essere superato aumentando il numero dei topi in ogni gruppo. Quantificazione dell'assorbimento di DPA-713 [11C] nella milza hanno mostrato nessuna differenza significativa tra i gruppi (Figura 4).
Risultati di formazione immagine di cervello dMCAO mouse PET sono stati confermati da ex vivo ad alta risoluzione digitale autoradiografia (Figura 5). L'assorbimento aumentato [11C] DPA-713 è stata osservata nel tessuto colpito da infarto con segnale trascurabile nel tessuto cerebrale sano circostante. Quantificazione di queste immagini ha rivelato ipsilateral controlaterali rapporti che variano da 1,4 a 2,09 in topi dMCAO.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57243/57243fig1.jpg"> Figura 1: Scanner PET e set-up dell'area di lavoro. Tutte le aree di lavoro sono stati coperti in imbottitura protettiva assorbente per creare un ambiente sterile. (A) dopo le calibrazioni, un letto di mouse 3D-stampato, attrezzato per l'imaging 4 topi simultaneamente è stato fissato nello scanner e ogive per tutti 4 topi associati all'anestesia. (B) attrezzatura necessaria per l'imaging PET sono state preparate in anticipo, compreso i cateteri 27,5 G di soluzione salina, lubrificante occhio, tamponi di etanolo, lampade di calore, nastro chirurgico, colla tessuto, siringhe da 0,5 mL dose, forbici e un accendino. (C) iniettabile radiotraccitore, posizionare siringhe salino a filo e forbici sul retro dello scanner. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57243/57243fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57243/57243fig2.jpg"> Figura 2: ROI ipsilateral/controlaterale ed emisfero di destra/sinistra-Split Brain Atlas immagine PET analisi processo. Analisi dell'immagine software è stato utilizzato per determinare l'assorbimento dell'elemento tracciante nelle regioni ipsilaterale e controlaterale di interesse (ROI) utilizzando manualmente disegnata ROIs e un approccio semi-automatico 3D Split-Brain atlas. Registrazione automatica di PET/CT 3D è stata effettuata a seguito di registrazione manuale del cervello MRI all'interno del cranio del mouse corrispondente definito nell'immagine di CT. Lo strumento ROI 3D è stato utilizzato per disegnare manualmente ipsilateral (rosso) e controlaterale ROIs (verde) utilizzando l'infarto sul MRI come riferimento. Per l'approccio "Split Brain", l'Atlante del cervello del mouse 3D di sinistra/destra-Spalato è stato caricato e inserito all'interno del cranio, come definito dall'immagine di CT. ROIs cervello utilizzato per quantificazione in questo Atlante del cervello del mouse 3D incluso corteccia sinistra (grigio scuro), ippocampo di sinistra (Cornflower Blue), sinistra striato (Deep Pink), corteccia destra (rosso pomodoro), ippocampo di destra (verde) e diritto Striatium (ciano). L'assorbimento di [11C] DPA-713 in ogni regione è stata ottenuta in nCi/cc e successivamente è stato convertito in %ID/g normalizzando alla dose di decadimento-corretta in fase di scansione per ogni mouse. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57243/57243fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57243/57243fig3.jpg"> Figura 3 : Rappresentante In Vivo [11C] assorbimento DPA-713 del cervello nei topi di Sham e DMCAO. (A) immagini PET/CT dinamico e TAC dimostrano maggiore [11C] DPA-713 l'assorbimento nella corteccia ipsilateral dei topi che hanno subito DMCAO (n = 3) e un lieve aumento per sham (n = 3) operati topi, con i topi DMCAO dimostrando significativamente maggiore contrasto in percentuale dose iniettata tra l'infarto e l'arto controlaterale del cervello (%ID/g). (B) quantificazione PET (50-60 min sommati) ha rivelato l'assorbimento significativamente aumentato nel ROI ipsilateral utilizzando l'approccio ROI e nella corteccia (Ctx) utilizzando l'approccio di Split-Brain atlas. Nessuna differenza significativa sono stata trovata nell'ippocampo (HC) o striato (Str). Rapporti aumentati ipsilateral al controlaterale sono stati visti utilizzando sia analisi si avvicina ma solo era statisticamente significativa in Ctx utilizzando l'approccio di Atlante del cervello. * (p &lt; 0,05), * * * (p &lt; 0,001) <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57243/57243fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57243/57243fig4v2.jpg"> Figura 4: Rappresentante In Vivo [11C] DPA-713 milza assorbimento in dMCAO e topi di Sham. (A) [11C] immagini PET/CT dinamiche di DPA-713 risultati milza ROIs in dMCAO (n = 3) e sham (n = 3) topi. (B) risultati quantitativi non dimostrano alcun risultato significativo nell'assorbimento della milza fra i topi dMCAO e sham. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57243/57243fig4v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57243/57243fig5v2.jpg"> Figura 5 : Rappresentante autoradiografia risultati. Autoradiografia digitale immagini mostrano aumentata [11C] DPA-713 assorbimento nell'ipsilaterale rispetto all'emisfero controlaterale. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57243/57243fig5v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Formazione immagine di tomografia a emissione di positroni (PET) di translocator proteina 18 kDa (TSPO) fornisce un mezzo non invasivo per visualizzare il ruolo dinamico del neuroinflammation nello sviluppo e nella progressione delle malattie del cervello. Questo protocollo descrive autoradiografia TSPO-PET ed ex vivo per rilevare neuroinflammation in un modello murino di ictus ischemico.

Imaging del Neuroinflammation utilizzando [11C] DPA-713 in un modello murino di ictus ischemico per animali

Neuroinflammation is central to the pathological cascade following ischemic stroke. Non-invasive molecular imaging methods have the potential to provide ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è quantificare con precisione la distribuzione spaziale e l'estensione della neuroinfiammazione in un modello murino di ictus ischemico utilizzando TSPO-PET e imaging RM e convalidare questi risultati in vivo utilizzando l'autoradiografia ex vivo. Sono davvero entusiasta di condividere con voi questa guida passo passo su come utilizzare l'imaging PET per visualizzare la neuroinfiammazione in un soggetto vivente. Qui stiamo usando un modello murino di tratto come esempio.Ora, perché potresti voler usare questa tecnica? Ci sono un paio di motivi. La prima è che la neuroinfiammazione, che è solo l'infiammazione che si verifica nel sistema nervoso centrale, si pensa sia intimamente associata e in realtà qualcosa che è alla base di molte, molte malattie cerebrali, tra cui l'ictus ma anche il morbo di Alzheimer, la sclerosi multipla, il Parkinson e l'elenco potrebbe continuare.Quindi è incredibilmente importante avere queste tecniche che ci permettono davvero di studiare questi fenomeni biologici. In secondo luogo, l'imaging PET offre una serie di vantaggi rispetto ad alcune delle tecniche più tradizionali. Ad esempio, la maggior parte di queste tecniche tradizionali si basa fortemente sull'utilizzo di tessuto cerebrale post-mortem umano e di topo e, sebbene abbiano fornito una serie di importanti intuizioni, queste tecniche sono statiche per natura, il che significa che possono davvero dirci informazioni solo su un momento nel tempo.Dal momento che sappiamo che sia il cervello che il sistema immunitario sono altamente dinamici, ha senso che vorremmo avere una tecnica che ci permetta di catturare davvero questi processi molecolari in sistemi viventi intatti, quindi nel loro ambiente nativo in tempo reale, e questo è esattamente ciò che fa l'imaging PET. Qui ti mostreremo come utilizziamo uno specifico radiotracciante PET, DPA-713, che è noto per legarsi alla TSPO o proteina traslocatore. Vi mostreremo in particolare come iniettiamo un'immagine non solo in un topo ma in quattro topi contemporaneamente in modo dinamico, e il motivo per cui questo è un grosso problema è che aiuta davvero ad aumentare il numero di topi che è possibile visualizzare in un dato giorno con lo stesso lotto di tracciante, semplificando così davvero i vostri esperimenti.Anche se questo è tecnicamente impegnativo, spero davvero che questo video possa aiutarti a guidarti in modo che tu possa eseguirlo nel tuo laboratorio. Inizia posizionando i topi anestetizzati proni sul letto dello scanner PET/CT, assicurandoti che siano raddrizzati e saldamente nei coni del naso. Fissare la testa e il corpo di ciascun topo al letto con un nastro chirurgico morbido, assicurandosi che la respirazione non sia limitata dal posizionamento del nastro.Una volta che gli animali sono al sicuro nel letto e la respirazione è stabile, accendi il mirino laser e sposta il letto di scansione in modo che si allineino con il cervello di tutti e quattro i topi. Spostare il piano dello scanner nella posizione di acquisizione con il cervello dei topi il più vicino possibile al centro del campo visivo. Acquisisci un'immagine di visualizzazione scout dei topi per verificare la loro posizione e regola la posizione trascinando la casella del campo visivo sull'interfaccia, se necessario.Infine, fare clic su Avvia flusso di lavoro nel software dello scanner per avviare la scansione CT, assicurandosi di selezionare la visualizzazione di istruzioni interattive per l'utente, in modo che la scansione PET possa essere avviata manualmente prima dell'iniezione del tracciante. Una volta che i topi passano automaticamente dalla TC alla PET, impostare la parte posteriore dello scanner per l'iniezione del radiotracciante. Posiziona un'imbottitura protettiva e assorbente su una sporgenza e assicurati che le forbici e l'accendino siano a portata di mano.Tagliare il tubo del catetere sigillato con le forbici. Controllare che le linee del catetere siano prive di bolle e confermare che la cannula sia ancora all'interno della vena eseguendo un lavaggio con soluzione fisiologica da 10 a 20 microlitri, quindi caricare le siringhe di dose precedentemente misurate in ciascuno dei quattro cateteri, tenendo traccia di quale dose è stata somministrata a ciascun topo. Fare clic su OK quando la scansione PET è pronta per l'avvio e contemporaneamente avviare un timer di 10 secondi.Avere due ricercatori sul retro dello scanner con le siringhe dosatrici in mano per iniettare tutti e quattro i topi contemporaneamente quando il timer raggiunge lo zero. Sciacquare ogni catetere con 50-100 microlitri di soluzione fisiologica per assicurarsi che l'intera dose entri nella vena caudale e richiudere nuovamente il tubo con un accendino. Quindi, misurare le siringhe di dose utilizzando un calibratore di dose per ottenere un valore di radioattività residua.Prendere nota dei valori e dell'ora in cui vengono registrati. Una volta completata la scansione, riporta la cuccia alla posizione originale utilizzando il pulsante Home orizzontale all'interno del pannello di controllo del movimento. Rimuovere i mouse dallo scanner e rimuovere con cautela il catetere.Applicare delicatamente una pressione sul sito di incannulamento per evitare un sanguinamento eccessivo. Quindi misurare l'attività residua nel catetere utilizzando un calibratore di dose. Infine, ricostruisci i dati aprendo il software di gestione della post-elaborazione, che ricostruirà automaticamente ogni scansione utilizzando i dati dell'istogramma generati dal primo file.Per l'analisi PET, iniziare aprendo il software di analisi delle immagini, facendo clic sull'icona Apri dati per caricare l'immagine CT e selezionando l'icona Aggiungi dati per caricare la PET dinamica. Eseguire un controllo visivo della qualità dei dati tramite l'operatore delle serie temporali nel menu a discesa. Selezionate riferimento e globale e applicate un valore minimo e massimo appropriato per la scala di colori.Visualizza i dati PET dinamici fotogramma per fotogramma, verificando l'assorbimento della radioattività e controllando eventuali confusioni di movimento all'interno della scansione. Quindi, crea un'immagine PET media utilizzando la funzione Aritmetica. Scegliete la media selezionata, deselezionate Riferimento e assicuratevi che l'opzione Input 1, Input 2 e Input siano selezionati per creare una media di tutti i fotogrammi PET.Andare alla scheda Gestione dati e trascinare l'immagine media fino alla posizione Input 1 per consentire la visualizzazione del segnale PET utilizzando l'immagine PET media. Quindi, ridistribuisci la scala dei colori facendo clic sul calcolo automatico nello strumento Min/Max. Quindi, registrare il CT sul file PET medio utilizzando la funzione 3D automatica nel menu a discesa Registrazione riorientamento.Selezionate Rifmto (Ref) e Input 1 (Input 1), quindi Rigido (Rigid), Veloce (Fast), Input 1 (Input 1) per la registrazione dei rifm. Controllare visivamente la registrazione in tutte e tre le dimensioni e regolare manualmente se necessario nella scheda Manuale 3D utilizzando le funzioni di Traslazione e Rotazione. Una volta effettuata la registrazione, selezionare Input 2 e Input e applicare a tutti i frame PET facendo clic sul segno di spunta.Fare clic con il pulsante destro del mouse sui file CT e PET nel DM e salvare come raw. Quindi, seleziona Ritaglio dal menu a discesa e trascina i bordi dell'immagine per ritagliare la testa di un mouse alla volta sotto il tronco cerebrale. Riorienta manualmente le immagini PET e TC in modo che il cranio sia dritto in tutte le dimensioni.Caricare l'immagine MR per quel mouse utilizzando il pulsante Aggiungi dati in alto a sinistra dell'interfaccia. Spostare la risonanza magnetica utilizzando il riorientamento 3D manuale e adattarla al cranio all'interno dell'immagine TC. Quindi, disattiva la visualizzazione PET deselezionandola nella scheda Controller visivo e utilizza solo la risonanza magnetica e la CT per disegnare la regione di interesse o il ROI.Nello strumento ROI 3D, fai clic sul pulsante Aggiungi ROI per creare un nuovo ROI e chiamarlo Infarct. Seleziona lo strumento Spline, facendo clic con il pulsante sinistro del mouse per disegnare il bordo ROI e facendo clic con il pulsante destro del mouse per chiuderlo. Successivamente, crea un nuovo ROI ed etichettalo come controlaterale.Fare clic con il pulsante destro del mouse su Infarct ROI e selezionare Esporta. Quindi spostare la ROI in posizione 2, Ingresso 1, per consentire la visualizzazione e il riorientamento manuale della nuova ROI. Con solo l'ingresso 1 selezionato, selezionare la casella ROI e scegliere Solo visualizzazione per consentire la visualizzazione della ROI dell'infarto senza riorientarla.All'interno del menu Registrazione riorientamento, applicare un capovolgimento sinistra-destra utilizzando la funzione Operatore e spostare manualmente la nuova ROI nella stessa regione sul lato controlaterale. Quindi, selezionare l'operatore Aritmetica e applicare una moltiplicazione scalare di due al nuovo ROI, consentendo la quantificazione indipendente dei ROI. Torna allo strumento ROI 3D.Vai alla scheda Esperto e Sperimentale e fai clic sul pulsante Importa ROI. Selezionare Input 1 dalla finestra di dialogo per caricare il nuovo volume come ROI controlaterale. Infine, fai clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine PET media, scaricala e riaccendi il PET.Genera i risultati quantitativi dell'adozione utilizzando l'icona Esporta risultati all'interno dello strumento ROI 3D. Le immagini PET/CT risultanti e le curve di attività temporale mostrano un aumento dell'assorbimento del radiotracciante negli emisferi omolaterali rispetto a quelli controlaterali. La quantificazione delle immagini cerebrali dinamiche PET utilizzando dati sommati da 50 a 60 minuti ha rivelato un aumento significativo dell'assorbimento del tracciante nell'emisfero omolaterale rispetto a quello controlaterale nel dMCAO ma non nei topi fittizi utilizzando l'approccio ROI disegnato manualmente.Dopo aver osservato questa tecnica, dovresti avere una buona comprensione di come quantificare in modo accurato ed efficiente la neuroinfiammazione in un modello murino di ictus ischemico tramite TSPO-PET, utilizzando metodi di analisi delle immagini sia automatici che manuali. È importante sottolineare che dovresti anche essere in grado di confermare questi risultati in vivo utilizzando l'autoradiografia digitale ex vivo. Poiché l'emivita del carbonio 11 è così breve, è fondamentale mappare un piano sperimentale chiaro e una tempistica prima di tentare questa procedura al fine di massimizzare la quantità e la qualità dei dati.Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come l'immunoistochimica, per rispondere a ulteriori domande, come la correlazione tra l'attivazione gliale e l'espressione di TSPO. Tenete presente che l'uso della radioattività può essere estremamente pericoloso. Per ridurre al minimo l'esposizione, utilizzare indumenti protettivi, scudi di piombo e aumentare la distanza durante l'esecuzione di questa procedura.

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Fonte: Chaney, A. M., et.al.  Imaging PET della neuroinfiammazione utilizzando [11C]DPA-713 in un modello murino di ictus ischemico. J. Vis. Exp. (2018).  Questo video dimostra una tecnica per l'imaging in vivo della neuroinfiammazione in un modello murino di ictus ischemico utilizzando un radiotracciante specifico per TSPO. Dopo l'iniezione, il radiotracciante si lega al TSPO, una proteina situata sulla membrana mitocondriale esterna e sovraespressa nelle cellule immunitarie attivate. Uno...

Imaging TSPO-PET/TC per rilevare la formazione di infarti in un modello murino di ictus ischemico

Fonte: Ouyang, Y., et al. Imaging simultaneo PET/MRI durante l'ipossia-ischemia cerebrale del topo. J. Vis. Exp. (2015)Questo video dimostra una tecnica per valutare il danno da ipossia cerebrale tramite tomografia a emissione di positroni (PET) e risonanza magnetica (MRI) simultanee. Un topo anestetizzato viene sottoposto a legatura dell'arteria carotide comune (CCA), riducendo il flusso sanguigno a un emisfero cerebrale e predisponendolo a lesioni indotte dall'ipossia. La PET e la risonanza...

Imaging del danno cerebrale indotto da ipossia-ischemia cerebrale in un modello murino

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Questo protocollo descrive l'applicazione della tomografia combinata a fluorescenza nel vicino infrarosso (NIRF) imaging e micro-computerizzata (microCT) per la visualizzazione tromboembolie cerebrale. Questa tecnica consente la quantificazione del carico trombotico ed evoluzione. La tecnica di imaging NIRF visualizza fluorescente trombo nel cervello asportato, mentre la tecnica microCT visualizza trombo all'interno gli animali viventi utilizzando oro-nanoparticelle.

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