Name: Coltura di cellule di mammifero in scaffold tridimensionale Peptide (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: Scopri la coltura tridimensionale di condrociti umani usando scaffold peptidici autoassemblanti RAD16-I. Questo metodo promuove la differenziazione fisiologica e applicazioni in ingegneria tissutale.

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La ricerca effettuata dagli autori è stata sostenuta in parte da sovvenzioni dall'Unione europea settimo programma quadro (FP7/2007-2013) sotto Grant accordo n. 229239 e dalla Fondazione AO, esplorativo ricerca collaborativa ricerca programma acuta Cartilagine ferita/lesione/difetto (CRP ACI) nell'ambito del progetto Bioactive e biomimetici scaffold per la rigenerazione della cartilagine (BIOCART).

1. auto-assemblanti Peptide impalcatura (SAPS) preparazione
<ol><li>Preparare una soluzione di 0,5% di peptide RAD16-I nel saccarosio 20% (p/v), in una provetta da centrifuga micro. Sonicare la soluzione del peptide per 20 min in un bagno ad ultrasuoni a potenza massima e a temperatura ambiente (TA) per garantire la miscelazione omogenea. Nota: Il volume della soluzione di essere preparati dipenderà il numero di incapsulamenti desiderato. RAD16-I peptidi non subiscono degradazione in queste condizioni di sonicazione.</li>
	<li>Diluire la soluzione di peptide preparata al punto 1.1 con il volume necessario di saccarosio al 10% (p/v) per ottenere la concentrazione finale desiderata. Nota: Un fattore importante da prendere in considerazione è la regolazione della concentrazione del peptide iniziale poiché la rigidità di matrice finale dipenderà da questo parametro. Il RAD16-io soluzione peptide dovrebbe essere più concentrato rispetto alla concentrazione finale desiderata del costrutto 3D 2x. Normalmente, il finale RAD16-ho usati le concentrazioni nel peptide sono tra 0,15 – 0,5% (p/v).</li>
	<li>Inserire la micro-provetta contenente la soluzione del peptide in un bagno ad ultrasuoni a RT per 20 min per garantire la miscelazione omogenea. Nota: Il peptide soluzione, se non utilizzato immediatamente, può essere conservata per diversi mesi a 4 ° C.</li>
</ol>2. preparazione della soluzione di cella
<ol><li>Centrifugare la sospensione cellulare (ottenuta dopo il trattamento di tripsina) a 60 x g e RT per 5 min.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante con una pipetta di Pasteur collegata ad una linea del vuoto e sospendere il pellet cellulare in 3 – 5 mL di saccarosio al 10% (p/v) utilizzando una micropipetta. Procedere per contare le celle utilizzando un contatore di cellule manuale o automatico. Nota: La soluzione di saccarosio al 10% (p/v) è un mezzo isotonico e non ionici che permette per la manutenzione delle cellule ed evita la gelificazione del peptide durante il processo di miscelazione.</li>
	<li>Centrifugare la sospensione cellulare a 60 x g e RT per 5 min, rimuovere il supernatante e sospendere nuovamente il pellet cellulare nel volume necessario di saccarosio al 10% (p/v) per ottenere il doppio della concentrazione di cella finale desiderata (raccomandabile circa 4 x 106 cellule / mL).</li>
	<li>Inserire un numero desiderato di coltura del tessuto inserti in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti (un inserto per incapsulamento).</li>
	<li>Sonicare soluzione peptide preparata nel passaggio 1 alla massima potenza e RT per 5 min.</li>
	<li>Pipettare e posto 40 µ l della sospensione delle cellule (ottenuta in 2.3) per ogni incapsulamento desiderata più circa 10 – 15% del volume supplementare in un tubo di micro-centrifuga standard.</li>
</ol>3. 3D Cell incapsulamento in SAPS
<ol><li>Mescolare un volume uguale del RAD16-ho soluzione in saccarosio di 10% (w/v) (40 µ l per incapsulamento) con un volume uguale di sospensione delle cellule (40 µ l per incapsulamento) preparata nel passaggio 2 per ottenere una sospensione di cellule nella concentrazione del peptide desiderato (nel 10% di saccarosio). Mescolare pipettando lentamente su e giù per circa 10 volte. Evitare la formazione di bolle durante la miscelazione. Nota: Questo passaggio è fondamentale e deve essere eseguito con molta attenzione poiché le cellule sono in condizioni ostili a causa del peptide di basso pH (circa 3.5-4.0).</li>
	<li>Usando una micropipetta, accuratamente caricare 80 µ l della sospensione in ogni inserto.</li>
	<li>Aggiungere 0,5 mL di terreno di coltura per il fondo del pozzo per bagnare l'inserto della membrana, permettendo media diffusione promuovere l'auto-assemblaggio del peptide e hydrogel formazione. Lasciate che il peptide del gel per circa 20 min nell'armadietto di flusso. Nota: La manipolazione dei campioni durante l'impostazione di tempo potrebbe finire in gel di rottura.</li>
	<li>Molto lentamente aggiungere 40 µ l di terreno all'inserto e lasciarlo scivolare giù la parete interna al gel. Nota: Normalmente, il caricamento di questo volume dovrebbe prendere tra 20 – 30 s.</li>
	<li>Posizionare la piastra nell'incubatore (37 ° C, 5% CO2, atmosfera umidificata) per 20 min. Questo passaggio e aggiunte successive medie favorirà lisciviazione del saccarosio e l'equilibratura delle cellule con terreno di coltura.</li>
	<li>Aggiungere 60 µ l di terreno alla parete interna dell'inserto, facendolo fluire lungo la parete. Aspirare il mezzo del pozzo, che è ricco di saccarosio, e aggiungere 0,5 mL di terreno nuovo.</li>
	<li>Aggiungere 60 µ l di terreno lentamente all'inserto e posizionare la piastra nell'incubatore (37 ° C, 5% CO2, atmosfera umidificata) per 10 min.</li>
	<li>Aspirare il mezzo del pozzo e aggiungere 2,5 mL di terreno nuovo nel pozzo. Aggiungere 200 µ l di terreno nell'inserto. Posizionare la piastra nell'incubatore (37 ° C, 5% CO2, atmosfera umidificata) per mantenere le cellule in condizioni appropriate.</li>
	<li>Modificare il mezzo ogni giorno. Rimuovere il vecchio mezzo dal fondo del pozzo. Aggiungere 2,5 mL di terreno nuovo per il bene e 200 µ l per l'inserto. Nota: Se continua differenziazione cellulare, la media d'induzione specifico verrà aggiunto alle culture, conseguente l'impegno di tipo cellulare desiderato (Vedi sotto, differenziazione cellulare).</li>
</ol>4. attuabilità in 3D-SAPS
<ol> <li>Nota: L'analisi di attuabilità delle cellule è conosciuto come il Live/Dead — analisi di fattibilità/citotossicità pure.</li>
	<li>In una provetta da 15 mL, preparare il volume necessario di soluzione fresca di 2 µM calceina e 2 µM di omodimero di etidio-1 (EthD-1) in PBS nel Vortex per 10 s. tenga all'oscuro. Nota: Il volume da utilizzare per ogni campione dipenderà il ben formato secondo quanto segue: 2 mL per ciascun pozzetto di una piastra 6-pozzetti; 1 mL per ogni bene di una piastra 12-pozzetti e 0,5 mL per ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti.</li>
	<li>Usando una micropipetta, sciacquare i campioni 3D-SAPS 3 volte con 2 mL di PBS e poi, coprire con la soluzione preparata al punto 4.1. Incubare a temperatura ambiente per 40 min al buio.</li>
	<li>Utilizzando una micropipetta, sciacquare i costrutti con 2 mL di PBS 5 volte.</li>
	<li>Visualizzare i campioni sotto un microscopio di fluorescenza usando X 10 o 20 ingrandimenti.</li>
</ol>5. differenziamento
<ol><li>Cellule di cultura (37 ° C, 5% CO2, atmosfera umidificata) in condrociti basale medio (CBM) con crescita supplementi. Nota: La preparazione del mezzo è descritto nelle istruzioni del produttore (Vedi Materiali tavolo).</li>
	<li>Indurre la differenziazione delle cellule al giorno 2 con condrogenica contenenti medie ricombinanti umani trasformando il fattore di crescita-b1 [TGFb1] (10 ng/mL), acido L-ascorbico 2-fosfato [AA2P] (25 µ g/mL) e desametasone (100 nM).</li>
	<li>Mantenere la cultura per 4 settimane in un'incubatrice con atmosfera umidificata a 37 ° C e 5% CO2. Sostituire il terreno condrogenica ogni altro giorno.</li>
</ol>6. toluidina blu colorazione (TB)
<ol><li>Lavare le culture di 3D-SAPS due volte aggiungendo e rimuovendo quindi 2 mL di PBS con una micropipetta. Correggerli aggiungendo 2 mL di 2% (p/v) p-formaldeide in PBS per 2 h a TA.</li>
	<li>Lavare due volte con 2 mL di 0.1% Triton X-100 in PBS (PBST).</li>
	<li>Incubare con 2 mL di TB 0.05% in acqua per 20 minuti a TA.</li>
	<li>Lavare più volte (almeno 3 volte) con 2 mL di PBS, fino a quando la soluzione di PBS rimossa è chiara.</li>
	<li>Analizzare i campioni mediante ispezione visiva sotto un microscopio stereoscopico11,13,14. Nota: TB forma complessi con anionici glycoconjugates presso la matrice extracellulare, come proteoglicani (PG) e glicosaminoglicani (GAG), che sono principalmente secreto dai condrociti-come le cellule. Campioni positivi sono macchiati blu.</li>
</ol>7. Western Blot
Nota: La procedura utilizzata in questo protocollo è stata precedentemente descritta nel riferimento11.
<ol><li>Lyse 3D-costrutti in RIPA buffer contenente l'inibitore della proteasi cocktail di pipettaggio.</li>
	<li>Preparare il gel dell'acrilamide secondo requisiti di gel-volume (delle apparecchiature in esecuzione gel specifico) ed eseguire i lisati cellulari per 90 min a 150 V16. Nota: Gel dell'acrilamide è solitamente preparato ad una concentrazione di 7,5 – 10% (p/v), a seconda del peso molecolare della proteina.</li>
	<li>Trasferire le proteine contenute nel gel in una membrana di polivinilidene (PVDF) Il difluoruro applicando 40 V per 2 h a TA.</li>
	<li>Incubare la membrana PVDF a temperatura ambiente per 2 h in tampone bloccante (4% (p/v) di latte in polvere senza grassi in PBST) in un contenitore separato con volume sufficiente a coprire la membrana.</li>
	<li>Incubare la membrana a temperatura ambiente per 1 h con anticorpi primari ad una concentrazione finale di 1 mg/mL in PBST. Vedere la tabella dei materiali.</li>
	<li>Aggiungere gli anticorpi secondari ad una concentrazione di 1 mg/mL. Vedere la tabella dei materiali.</li>
	<li>Preparare la membrana per il rilevamento di hP con un substrato chemiluminescente16. Vedere la tabella dei materiali.</li>
	<li>Prendere immagini chemiluminescente16.</li>
</ol>

<ol><li>Aggeli, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9069283">Responsive gels formed by the spontaneous self-assembly of peptide into polymeric β-sheet tapes.</a> Nature. 386, 259-262 (1997).</li>
<li>Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+we+build+artificial+stem+cell+compartments%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Can we build artificial stem cell compartments?</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 3, 164-169 (2003).</li>
<li>Kisiday, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembling+peptide+hydrogel+fosters+chondrocyte+extracellular+matrix+production+and+cell+division%3A+implications+for+cartilage+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%2C+USA%22%5BJournal%5D)">Self-assembling peptide hydrogel fosters chondrocyte extracellular matrix production and cell division: implications for cartilage tissue repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 99, 9996-10001 (2002).</li>
<li>Narmoneva, D. A., Vukmirovic, R., Davis, M. E., Kamm, R. D., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+promote+cardiac+myocyte+survival+and+spatial+reorganization%3A+implications+for+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells promote cardiac myocyte survival and spatial reorganization: implications for cardiac regeneration.</a> Circulation. 110, 962-968 (2004).</li>
<li>Genové, E., Shen, C., Zhang, S., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+functionalized+self-assembling+peptide+scaffolds+on+human+aortic+endothelial+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of functionalized self-assembling peptide scaffolds on human aortic endothelial cell function.</a> Biomaterials. 26, 3341-3351 (2005).</li>
<li>Garreta, E., Genové, E., Borrós, S., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+and+mouse+embryonic+fibroblasts+in+a+three-dimensional+self-assembling+peptide+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Osteogenic differentiation of mouse embryonic stem cells and mouse embryonic fibroblasts in a three-dimensional self-assembling peptide scaffold.</a> Tissue Engineering. 12, 2215-2228 (2006).</li>
<li>Sieminski, A. L., Semino, C. E., Gong, H., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+sequence+of+ionic+self-assembling+peptide+gels+affects+endothelial+cell+adhesion+and+capillary+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">Primary sequence of ionic self-assembling peptide gels affects endothelial cell adhesion and capillary morphogenesis.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 87 (2), 494-504 (2008).</li>
<li>Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembling+peptides%3A+from+bio-inspired+materials+to+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">Self-assembling peptides: from bio-inspired materials to bone regeneration.</a> Journal of Dental Research. 87 (2008), 606-616 (2008).</li>
<li>Hernández Vera, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstitial+fluid+flow+intensity+modulates+endothelial+sprouting+in+restricted+Src-activated+cell+clusters+during+capillary+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Interstitial fluid flow intensity modulates endothelial sprouting in restricted Src-activated cell clusters during capillary morphogenesis.</a> Tissue Engineering Part A. 15 (1), 175-185 (2009).</li>
<li>Castells-Sala, C., Martínez-Ramos, C., Vallés-Lluch, A., Monleón Pradas, M., Semino, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+development+of+bioimplants+made+up+of+elastomeric+scaffolds+with+peptide+gel+filling+seeded+with+human+subcutaneous+adipose+tissue-derived+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">In vitro development of bioimplants made up of elastomeric scaffolds with peptide gel filling seeded with human subcutaneous adipose tissue-derived progenitor cells.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (11), 3419-3430 (2015).</li>
<li>Recha-Sancho, L., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin-based+self-assembling+peptide+scaffold+reestablish+chondrogenic+phenotype+of+expanded+de-differentiated+human+chondrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">Heparin-based self-assembling peptide scaffold reestablish chondrogenic phenotype of expanded de-differentiated human chondrocytes.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (7), 1694-1706 (2016).</li>
<li>Bussmann, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrogenic+potential+of+human+dermal+fibroblasts+in+a+contractile%2C+soft%2C+self-assembling%2C+peptide+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chondrogenic potential of human dermal fibroblasts in a contractile, soft, self-assembling, peptide hydrogel.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 10 (2), E54-E62 (2016).</li>
<li>Recha-Sancho, L., Moutos, F. T., Abellà, J., Guilak, F., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dedifferentiated+Human+Articular+Chondrocytes+Redifferentiate+to+a+Cartilage-Like+Tissue+Phenotype+in+a+Poly+%28%CE%B5-Caprolactone%29%2FSelf-Assembling+Peptide+Composite+Scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">Dedifferentiated Human Articular Chondrocytes Redifferentiate to a Cartilage-Like Tissue Phenotype in a Poly (ε-Caprolactone)/Self-Assembling Peptide Composite Scaffold.</a> Materials. 9 (6), 472(2016).</li>
<li>Recha-Sancho, L., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondroitin+Sulfate+and+Decorin+based+self-assembling+scaffolds+for+cartilage+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22PlosOne%22%5BJournal%5D)">Chondroitin Sulfate and Decorin based self-assembling scaffolds for cartilage tissue engineering.</a> PlosOne. 11 (6), e0157603(2016).</li>
<li>Aloy-Reverté, C., Moreno-Amador, J. L., Nacher, M., Montanya, E., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+RGD-Functionalized+Sandwich+Cultures+to+Promote+Redifferentiation+of+Human+Pancreatic+Beta+Cells+After+In+Vitro+Expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Use of RGD-Functionalized Sandwich Cultures to Promote Redifferentiation of Human Pancreatic Beta Cells After In Vitro Expansion.</a> Tissue Engineering Part A. , (2017).</li>
<li>Kurien, B. T., Scofield, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+blotting+and+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein blotting and detection.</a> Methods in Molecular Biology. 536, (2009).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

In precedenza, il nostro gruppo ed altri hanno descritto l'uso di piattaforme di tridimensionale (3D) cultura con cella diversi sistemi3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12,13,14,15. Nel lavoro attuale, descriviamo un metodo facile e affidabile di ottenere cultura 3D sistemi che sono applicabili a qualsiasi tipo di cellule di mammiferi tra cui qualsiasi tipo di cellula funzionale, embrionale o adulto cellule staminali, o alla fine, le cellule disfunzionali isolate da le biopsie o tumori e così via. Inoltre, in modo indipendente, se le cellule staminali sono di origine embrionale o adulto avrebbero una migliore capacità di impegno di lignaggio nell'ambiente 3D che in 2D classica cultura piatti10,11,12, 13,14,15. Di conseguenza, la coltura delle cellule in questo sistema porterebbe alla differenziazione in funzionale tessuto-come le strutture che potrebbero essere utilizzate in svariate applicazioni, dalla biomedicina riparativa o rigenerativa per piattaforme tossicologiche e farmacologiche.
Abbiamo dimostrato un chiaro aumento nella funzione delle cellule perché il microambiente cellulare è simile a quella dei tessuti naturali in termini di struttura matrix e parametri biomeccanici, biofisici e biologici. Tuttavia, come il sistema diventa più complesso, il numero di parametri che devono essere regolati anche aumenti, che comprende la necessità di una piattaforma di supporto esterna (ad esempio di un sistema di perfusione attiva per evitare problemi associati a fenomeni di trasferimento di massa ). Cellule coltivate tridimensionalmente le prestazioni migliori in termini che regolano le attività essenziali, quali la migrazione, proliferazione e differenziazione. Potrebbe formano reti complesse consentendo diafonia cellulare avanzata, che è di gran lunga una conseguenza essenziale di crescita e di differenziazione in 3D. Il fatto che i succhi potrebbe creare condizioni in vitro simile a quelle della matrice extracellulare proteine rappresenta un vantaggio poiché uno studio razionale dell'effetto prodotto per ogni componente aggiunto al patibolo (fattore di crescita, polisaccaride o segnalazione peptide) potrebbe essere facilmente portato.
I chiari vantaggi dell'uso di SAPS rispetto ad altri scaffold naturali, come collagene di tipo I e Matrigel, sono i seguenti: 1) SAPS è un biomateriale sintetico con minime variazioni da lotto a lotti di produzione; 2) SAPS ha la capacità di essere funzionalizzati con motivi di peptide specifico; e 3) presenta SAPS bassa biodegradabilità in vitro, che permette il mantenimento del costrutto 3D con le stesse proprietà biofisiche, biomeccaniche e strutturali nel corso del tempo. Tuttavia, la limitazione dell'utilizzo di SAPS contro altri ponteggi è trovato durante la fase di incapsulamento, dove le cellule sono in un ambiente ostile a causa del basso pH. Pertanto, questo è un passaggio fondamentale nella metodologia descritta. Inoltre, è importante impostare la concentrazione di SAPS per ciascun tipo di cella specifica prima di iniziare qualsiasi esperimento. Questo è, infatti, essenziale quando le cellule sono coltivate su o dentro questi biomateriali, poiché ogni tipo di cellula particolare presenterà condizioni di crescita ottimali biomeccanico.
Infine, riteniamo che la progettazione e la fabbricazione di questo tipo di ponteggio biomateriale potrebbe migliorare lo sviluppo di modelli 3D del tessuto più fisiologiche ed affidabili per aiutare l'industria farmaceutica a sviluppare migliori approcci terapeutici per medicina rigenerativa, cancro o qualsiasi trattamento medico.

Per molti decenni, coltura delle cellule dei mammiferi è stata eseguita in condizioni sperimentali, utilizzando sistemi di classica cultura bidimensionale (2D) a causa di problemi pratici ed economici indipendentemente gli aspetti non-fisiologica. Anche se questo sistema cultura aiuta a studiare e capire di più i meccanismi cellulari e molecolari, che conosciamo oggi sono necessari nuovi paradigmi di coltura delle cellule per studiare più complessi sistemi cellulari. Pertanto, sistemi tridimensionali (3D) cultura sono necessari per ricreare un microambiente che è biofisicamente, biomeccanico e biologicamente più simile a quella dei tessuti naturali. Negli ultimi anni, sistemi di coltura 3D, in generale, sono diventati più diffusi tra i ricercatori e l'industria rappresentano un nuovo modello di studio o di screening in cui le cellule possono crescere nello spazio, creare cellula--cellula o interazioni cellula-matrice, la migrazione e alla fine di differenziarsi in linee cellulari specifici.
L'obiettivo generale di questa metodologia è quello di ricreare un in vitro microambiente cellulare che è più vicino al microambiente in vivo . In particolare, lo scaffold sintetico di peptide autoassemblanti (SAPS) è un tipo di biomateriale con proprietà uniche; forma una rete di pori di dimensioni nanometriche fatto di interazioni deboli tra peptidi con proprietà meccaniche e strutturali simili quelli di matrici extracellulari naturale. In altre parole, la razionalità dietro l'uso di questo materiale è che crea un ambiente veramente 3D che è ideale per ottenere tessuti di pseudo-3D o unità di organo. Tuttavia, la cosa più importante, il contesto 3D permette di acquisire nuove funzioni biologiche che normalmente non sono presenti nelle piattaforme 2D cultura, come proprietà relazionati all'architettura dei tessuti, fenomeni di trasferimento di massa, cella patterning la struttura 3D e alla fine morfogenesi dei tessuti, che sono fattori chiave nella ricerca futura e nello sviluppo di tessuti funzionali e organi1,2. Inoltre, un vantaggio di SAPS sopra le loro controparti naturali (collagene, Matrigel) è che sono molto stabili a temperatura ambiente e non richiedono particolari condizioni di post-produzione, distribuzione o archiviazione3,4, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. SAPS è facile da gestire, quando lo si desidera; 3d gel può essere ottenuta semplicemente aumentando la forza ionica o regolando il pH a neutralità1,2. Infine, la metodologia descritta qui è stato ampiamente utilizzato in vitro per promuovere la manutenzione, la crescita e la differenziazione di un certo numero di tipi di cellule, tra cui gli epatociti, cellule endoteliali, osteoblasti, condrociti, cellule neuronali pure come cellule staminali embrionali e somatiche3,4,5,6,7,8,9,10, 11 , 12 , 13 , 14 , 15. nel lavoro attuale, descriviamo l'uso di un sistema 3D-cultura a differenziarsi chondrocytes articolari espanso umani (hACh) in cartilagine-come il tessuto come descritto in precedenza11.
Qui, è descritto un metodo per cellule di cultura in un sistema 3D utilizzando SAPS. In questo biomateriale sintetico, cellule prima sono mescolate con una soluzione di peptide, che è successivamente indotto di auto-assemblarsi, creando una rete di dimensioni nanometriche intorno alle cellule e quindi creare un ambiente veramente 3D (Figura 1). È importante considerare che il comportamento cellulare è interessato da valori di rigidezza di matrix (vale a dire, proliferazione, migrazione e differenziazione). Di conseguenza, un controllo metodologico comune è quello di cellule di cultura in cima l'impalcatura del peptide con gli stessi valori di rigidità (cultura su due dimensioni).

<table><tbody><tr><td>Condrociti articolari umani (Ach)</td>Soluzione peptidica <td>Lonza</td><td>CC-2550</td><td></td></tr><tr><td>RAD16-I (PuraMatrix)</td><td>Corning</td><td>354250</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio (grado di coltura tissutale)</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Inserti per colture cellulari (0,4 &; m poro, diametro 12 mm)</td><td>Millipore</td><td>PICM01250</td><td></td></tr><tr><td>Condrociti Basal Medium (CBM)</td><td>Lonza</td><td>CC-3217</td><td></td></tr><tr><td>SingleQuots of Growth Supplements</td><td>Lonza</td><td>CC-4409</td><td></td></tr><tr><td>Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Lonza</td><td>DE14-801F</td><td></td></tr><tr><td>Desametasone</td><td>Sigma</td><td>D8893</td><td></td></tr><tr><td>Acido L-ascorbico 2-fosfato (AA2P)</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di crescita trasformante umano-&beta; 1 (TGF-&beta; 1)</td><td>Millipore</td><td>GF111</td><td></td></tr><tr><td>tampone RIPA</td><td>Sigma</td><td>R0278</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della proteasi</td><td>Roche</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>Membrana in polivinilidene difluoruro (PVDF)</td><td>Invitrogen</td><td>LC 2005</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Substrato chemiluminescente</td><td>Thermo Scientific</td><td>34080</td><td></td></tr><tr><td>Anti-actina</td><td>SCBT</td><td>sc-1615</td><td></td></tr><tr><td>Anti-collagene I</td><td>Abcam</td><td>ab138492</td><td></td></tr><tr><td>Anti-collagene II</td><td>Abcam</td><td>ab3092</td><td></td></tr><tr><td>Anti-collagene X</td><td>Abcam</td><td>ab182563</td><td></td></tr><tr><td>Anticapra IgG-HRP</td><td>Abcam</td><td>ab97100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-topo IgG-HRP</td><td>Abcam</td><td>ab97023</td><td></td></tr><tr><td>Anti-coniglio IgG-HRP</td><td>Abcam</td><td>ab97051</td><td></td></tr></tbody></table>

coltura di cellule di mammifero in scaffold tridimensionale peptide

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

Una tecnica utile per la coltura di cellule in nanofibra autoassemblanti impalcatura tridimensionale (3D) è descritto. Questo sistema di coltura ricrea un ambiente che imita molto attentamente le caratteristiche strutturali del tessuto non polarizzato. Inoltre, la struttura particolare nanofibra intrinseco dell'impalcatura rende trasparente alla luce visibile, che consente una visualizzazione semplice del campione al microscopio. Questo vantaggio è stato ampiamente utilizzato per studiare la migrazione cellulare, organizzazione, proliferazione e differenziazione e così qualsiasi sviluppo della loro particolare funzione cellulare mediante colorazione con coloranti specifici o sonde. Inoltre, in questo lavoro descriviamo la buona prestazione di questo sistema per studiare facilmente la redifferentiation di espanso chondrocytes articolari umani in tessuto cartilaginoso. Cellule erano incapsulate in auto-assemblanti peptide impalcature e coltivate in condizioni specifiche per promuovere chondrogenesis. Le colture tridimensionali hanno mostrato buona redditività durante le 4 settimane dell'esperimento. Come previsto, campioni coltivati con induttori condrogenica (rispetto ai controlli non indotta) macchiato forte positivi per il blu di toluidina (che le macchie di glicosaminoglicani (gag) che sono altamente presenti nella matrice extracellulare della cartilagine) ed espresso marcatori molecolari specifici, tra cui collagene di tipo I, II e X, secondo analisi Western Blot. Questo protocollo è facile da eseguire e può essere utilizzato in laboratori di ricerca, industrie e per scopi didattici nei corsi di laboratorio.

Nel presente lavoro, un protocollo semplice e veloce alle cellule di cultura in 3D utilizzando SAPS è descritto per ottenere dati qualitativi e quantitativi affidabili. SAPS crea un microambiente 3D con proprietà uniche che permettono alle cellule coltivate in condizioni desiderate per procedere alla manutenzione delle cellule, proliferazione e/o differenziazione3,4,5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12. nel nostro gruppo, diversi studi sono stati effettuati utilizzando cellule di tessuto adiposo umano derivato progenitrici (hAPC), espanso chondrocytes articolari umani (hACh) e fibroblasti cutanei umani normali (hNDF) alla cultura, espandere e differenziarli in cartilagine-come il tessuto10,11,12. Qui, descriviamo la cultura 3D e la re-differenziazione di hACh espansa nel tessuto della cartilagine-come, come descritto in precedenza11. Quindi, abbiamo incapsulano le cellule in 3D-SAPS e cultura li in mezzo di induzione condrogenica, come descritto in Figura 1 (e nel protocollo). Dopo 24 h, i campioni sono stati valutati per la vitalità con le analisi di fattibilità/citotossicità Live/Dead. I risultati indicano che una piccola percentuale delle cellule erano morta (rosso) dopo 5 giorni di incapsulamento e quasi nessun cellule morte sono state osservate dopo 4 settimane di cultura (Figura 2). Successivamente, li abbiamo macchiato per la deposizione di glicosaminoglicani (GAG) presso la matrice extracellulare, utilizzando il metodo di colorazione blu di toluidina. Come previsto, il gruppo di induzione ha risposto correttamente al trattamento, mostrando forte colorazione (Figura 2).
Infine, marcatori molecolari degli indicatori Condrogenesi e ipertrofia, compreso il collagene di tipo I, II e X, sono stati analizzati mediante western blot (Figura 3). Collagene di tipo che i (COL1) stavo osservato nei sistemi 2D e 3D, ma una banda inferiore di ~ 130 kDa (che rappresentano le proteine trasformate di COL1 matura per essere assemblato presso la matrice extracellulare) è stato osservato solo in 3D. Questo risultato indica chiaramente che le cellule in fase di differenziazione in tre dimensioni procedere in modo più fisiologico. Notevolmente, collagene di tipo II (COL2) è stato rilevato - come una singola banda di peso molecolare previsto presente presso la matrice extracellulare - solo in 3D costrutti coltivate in condizioni di chondrogenic. Infine, collagene di tipo X (COL10) è stato rilevato nei costrutti sia 2D che 3D, coltivate in condizioni di chondrogenic, che indica un certo grado di ipertrofia dopo 4 settimane di cultura.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57259/57259fig1v2.jpg"> Figura 1: rappresentazione schematica di incapsulamento di cellule in 3D-SAPS. Rappresentazione schematica del incapsulamento hACh è descritto per ottenere cellule dislocate casualmente all'interno di 3D-SAPS. 1. auto-assemblanti preparazione del peptide dell'impalcatura (SAPS); 2. cella preparazione della sospensione; e 3. 3D-cell incapsulamento in SAPS. Si noti che lo schema elettrico Mostra solo passaggi 3.1-3.4.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57259/57259fig2.jpg"> Figura 2: differenziazione condrogenica e prestazioni nelle culture di 3D-SAPS cellulare. Macchiatura di attuabilità delle cellule eseguita a 5 giorni e 4 settimane di cultura rilevato sotto un microscopio a fluorescenza (cellule vive in cellule verde e morte in rosso). Scala bar = 200 µm. impegno generale chondrogenesis valutata dal blu di toluidina colorazione (i glycosaminoglycans solfonati in blu) di 3D-SAPS costrutti coltivate nei mezzi di controllo e chondrogenic. Scala bar = 500 µm. Questa figura è stata modificata da L. Recha-Sancho et al. 11. <a href="/files/ftp_upload/57259/57259fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57259/57259fig3.jpg"> Figura 3: collagene I, II e X espressione di hACh in fase di chondrogenesis. hACh coltivate in un monostrato di 2D e 3D-SAPS dopo 4 settimane in chondrogenic media e controlli sono stati valutati per l'espressione del collagene di tipo I (COL1), collagene di tipo II (COL2) e collagene di tipo X (COL10). Espressione dell'actina è stata utilizzata come controllo interno. Questa figura è stata modificata da L. Recha-Sancho et al. 11. <a href="/files/ftp_upload/57259/57259fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Qui, presentiamo un protocollo per ottenere sistemi 3D-cultura in auto-assemblanti peptide impalcature per promuovere la differenziazione dei chondrocytes articolari umani dedifferentiated in cartilagine-come il tessuto.

Coltura di cellule di mammifero in scaffold tridimensionale Peptide

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave, come il comportamento delle cellule in un microambiente 3D, l'interazione cellula-cellula e cellula-matrice, il modo in cui proliferano, migrano, si differenziano e formano tessuti funzionali. Questa tecnica è vantaggiosa, in quanto crea un microambiente cellulare più vicino alle condizioni fisiologiche. A dimostrare la procedura sarà Nausika Betriu, una studentessa laureata del mio laboratorio.Le implicazioni del metodo si estendono alla terapia dei tessuti danneggiati, in quanto può essere utilizzato per ottenere equivalenti tissutali per la medicina riparativa o rigenerativa. Il metodo può essere applicato anche ad altri sistemi, come i modelli tumorali, il diabete o le malattie neurodegenerative. Per iniziare, preparare 500 microlitri di una soluzione allo 0,5% di peptide RAD16-I in saccarosio al 20% in peso in volume in una provetta da microcentrifuga.Sonicare la soluzione in un bagno ad ultrasuoni alla massima potenza per 20 minuti. Successivamente, diluire 300 microlitri della soluzione peptidica preparata in precedenza con 200 microlitri di saccarosio al 10% per ottenere 500 microlitri di soluzione allo 0,3% di peptide RAD16-I. Quindi, posizionare la provetta da microcentrifuga contenente la soluzione peptidica in un bagno a ultrasuoni a temperatura ambiente per 20 minuti.Quindi, centrifugare la sospensione cellulare precedentemente preparata. Quindi, utilizzando una pipetta Pasteur collegata alla linea del vuoto, rimuovere il surnatante. Aggiungere due millilitri di saccarosio al 10% al pellet cellulare.Quindi, utilizzare un contatore di celle manuale per contare le cellule. Dopo aver risospeso le cellule, centrifugare la sospensione cellulare a temperatura ambiente per cinque minuti. Rimuovere il surnatante e sospendere il pellet cellulare nel volume necessario di saccarosio al 10% per ottenere la concentrazione desiderata di quattro milioni di cellule per millilitro.Successivamente, sonicare la soluzione peptidica precedentemente preparata nel bagno a ultrasuoni alla massima potenza per cinque minuti a temperatura ambiente. Posizionare un inserto di coltura tissutale in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti. Quindi, mescolare 120 microlitri di soluzione RAD16-I con un volume uguale di sospensione cellulare in una provetta da microcentrifuga.Mescolare lentamente, evitando la formazione di bolle, pipettando su e giù. Un fattore importante da tenere in considerazione è la miscelazione delle cellule con una soluzione peptidica. È fondamentale essere delicati durante la miscelazione, lentamente, per evitare la formazione di bolle, pipettando su e giù.Quindi, utilizzando una micropipetta, caricare 80 microlitri di RAD16-I e la miscela di sospensione cellulare in ciascun inserto. Il caricamento rapido di 80 microlitri del RAD16-I e della miscela di sospensione cellulare in ciascun inserto deve essere eseguito rapidamente. Aggiungere 500 microlitri di terreno sul fondo di ciascun pozzetto per bagnare la membrana dell'inserto.Lasciare gelificare il peptide per 20 minuti nella cappa a flusso laminare. L'aggiunta di 500 microlitri di terreno sul fondo di ciascun pozzetto per bagnare la membrana dell'inserto favorirà la formazione di gel e l'equilibrio della coltura 3D con i terreni. Dopo 20 minuti, aggiungere 40 microlitri di terreno all'inserto molto lentamente e lasciarlo scivolare lungo la parete interna fino al gel.Quindi, incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Al termine dell'incubazione, aggiungere 60 microlitri di terreno alla parete interna dell'inserto e lasciarlo scorrere lungo la parete. Quindi, aspirare il terreno ricco di saccarosio dal pozzetto e aggiungere 500 microlitri di terreno fresco.Quindi, aggiungere 60 microlitri di terreno all'inserto. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Quindi, aspirare il terreno fuori dal pozzo.Aggiungere 2,5 millilitri di terreno fresco nel pozzetto e 200 microlitri di terreno nell'inserto. Incubare la piastra in un'incubatrice a 37 gradi Celsius. Per eseguire il test di vitalità cellulare, preparare una soluzione di due micromolari di calceina AM e due micromolari di etidio-1 omodimero-1 in PBS in una provetta da 15 millilitri.Agitare per 10 secondi e coprire il tubo con un foglio di alluminio. Successivamente, utilizzando una micropipetta, sciacquare tre volte i campioni 3D-SAPS con due millilitri di PBS. Aggiungere la soluzione di omodimero calceina/etidio sui campioni.Quindi, coprire i campioni con un foglio di alluminio e incubare a temperatura ambiente per 40 minuti. Al termine dell'incubazione, sciacquare i costrutti con due millilitri di PBS cinque volte. Infine, visualizza i campioni al microscopio a fluorescenza utilizzando un ingrandimento 20X.In questo protocollo, viene descritto un metodo semplice e veloce per coltivare cellule in 3D utilizzando SAPS. Il test di vitalità cellulare dopo la formazione del costrutto 3D mostra poche cellule morte, come illustrato dalle cellule colorate di rosso dopo cinque giorni di incapsulamento. Dopo quattro settimane di coltura, non si osservano quasi più cellule morte.I marcatori molecolari per la condrogenesi e l'ipertrofia sono analizzati mediante western blot. La banda del collagene di tipo uno si osserva sia nei sistemi 2D che 3D. Tuttavia, la banda inferiore che rappresenta la proteina di collagene matura e processata si osserva solo nel sistema 3D, indicando che la differenziazione in 3D procede in modo più fisiologico.Inoltre, il collagene di tipo due viene rilevato solo nei costrutti 3D. Il collagene di tipo 10 viene rilevato sia nei costrutti 2D che in quelli 3D, il che è indicativo di un certo grado di ipertrofia dopo quattro settimane di coltura. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due ore se eseguita correttamente.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'incapsulamento tridimensionale delle cellule di collagene di tipo uno per rispondere a ulteriori domande, come il comportamento cellulare in un'impalcatura naturale degradabile. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come ottenere la tua coltura tridimensionale del tipo di cellula desiderato. Non dimenticare che lavorare con cellule tumorali umane può essere pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura dovrebbero sempre essere prese precauzioni, come l'uso di strutture di classe di biosicurezza due e la conoscenza del lavoro in condizioni sterili.

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Bioingegneria

Descriviamo un chip basato su piattaforma per il tridimensionale coltura di cellule in micro-bioreattori. Un chip in grado di ospitare fino a 10 milioni. cellule che possono essere coltivate in condizioni ben definite in relazione al flusso del fluido, tensione ecc ossigeno in una sterile, la circolazione ad anello chiuso.

Basato su chip tridimensionale coltura cellulare in perfuso Micro-bioreattori

Descriviamo un metodo semplice, rapido di generare 3D tessuti come sferoidi e la loro potenziale applicazione di quantificare le differenze nelle interazioni cellula-cellula.

Un semplice Hanging goccia Cultura protocollo cellulare per la generazione di sferoidi 3D

Qui si descrive l'uso di un auto-assemblaggio 3-dimensionale patibolo alla cultura cellule umane progenitrici neurali. Vi presentiamo un protocollo per liberare le cellule dai ponteggi da analizzare successivamente, ad esempio mediante citometria di flusso. Questo protocollo potrebbe essere adattato per altri tipi di cellule per effettuare studi dettagliati meccanicisticamente.

La coltivazione di cellule progenitrici neurali umane in un 3-dimensionale di auto-assemblaggio Peptide Hydrogel

Questo video mostra la creazione di un modello di tessuto neurale polarizzato in 3D utilizzando scaffold di seta-collagene. Descrive in dettaglio il processo di semina delle cellule neuronali su scaffold di seta porosa, l'incubazione per l'attaccamento cellulare, l'incorporazione dell'impalcatura con il collagene e sottolinea l'importanza della matrice di collagene di supporto nella formazione di un modello di tessuto neurale polarizzato 3D.

Sviluppo di un modello 3D ingegnerizzato basato su seta-collagene di tessuto neurale polarizzato

Biocompatibili pH reattivo nanosensori sol-gel possono essere incorporati in poli (acido lattico-co-glicolico) (PLGA) ponteggi elettrofilate. Le impalcature self-reporting prodotti possono essere utilizzati per il monitoraggio in situ delle condizioni microambientali mentre coltura di cellule sul patibolo. Questo è vantaggioso in quanto il costrutto cellulare 3D può essere monitorato in tempo reale senza disturbare l'esperimento.

Ponteggi self-reporting per coltura cellulare 3-Dimensional

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