Isolamento e caratterizzazione di cellule Stromal Mesenchymal cardiache da Endomyocardial campioni bioptici di pazienti cardiomiopatia aritmogena

Gli obiettivi generali di questo protocollo sono isolare le cellule stromali mesenchimali cardiache da pazienti con cardiomiopatia aritmogena, testare la loro attitudine alla differenziazione adipogenica e fenotipizzare i loro marcatori di superficie. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della cardiomiopatia aritmogena, come il coinvolgimento delle cellule stromali cardiache nella adipo-sostituzione e sottolineare i meccanismi molecolari. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'isolamento delle cellule dello stoma può essere eseguito con pochi semplici passaggi da campioni cardiaci molto piccoli.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sullo studio della cardiomiopatia aritmogena. Può essere applicato anche ad altri sistemi come lo studio delle malattie cardiovascolari per le quali è indicata una biopsia endomiocardica. Abbiamo studiato per la prima volta l'idea di questo metodo quando abbiamo capito che potevamo ridimensionare la procedura di isolamento delle cellule stomiche per applicarla alle biopsie cardiache e all'elettrofisiologia che poteva fornirci.

Per questo protocollo, prelevare una biopsia endomiocardica dal ventricolo destro di un paziente con ACM utilizzando la mappatura elettroanatomica integrata e la fluoroscopia cardiaca. Prelevare circa cinque grammi di tessuto e spedirlo al laboratorio in mezzo TMES. In laboratorio, allestire la cabina di sicurezza biologica necessaria per eseguire la procedura fino alla digestione ensomatica.

Quindi trasferire la biopsia su una piastra e lavarla due volte con PBS. A questo punto, la biopsia può essere fotodocumentata al microscopio. Quindi trasferire la biopsia in una provetta da due millilitri contenente un millilitro della soluzione di collagenasi.

In questo modo, tagliare il campione in piccoli frammenti, larghi tra 0,5 e un millimetro. Quindi incubare il tessuto per 90 minuti a 37 gradi Celsius con agitazione rotante continua. Quindi, centrifugare la soluzione digerita, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in un millilitro di PBS.

Quindi centrifugare nuovamente la provetta, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in un millilitro di TMES. Ora piastra la sospensione su una piastra da 60 millimetri e riempi la piastra fino a tre millilitri usando il TMES, ma non oltre. Quindi la coltura e l'espansione delle cellule secondo il protocollo di testo.

Prima di iniziare, preparare il reagente di dissociazione cellulare, il tampone di lavaggio e gli anticorpi necessari pronti per l'uso. Quando il numero stimato di cellule della coltura raggiunge i tre milioni, lavare due volte la piastra da 100 millimetri con 10 millilitri di PBS sterile. Successivamente, aggiungere cinque millilitri di un reagente di dissociazione cellulare alle cellule e incubare la piastra per sette-10 minuti a temperatura ambiente per staccare le cellule.

Una volta staccate le cellule, aggiungere 15 millilitri di PBS alle cellule e trasferire la sospensione in una provetta da 50 millilitri. A questo punto, centrifugare le celle e risospendere il pellet in un millilitro di tampone di lavaggio. Quindi contare le cellule e trasferirne tre milioni in una nuova provetta in un volume finale di 1,5 millilitri di tampone di lavaggio.

Quindi, dividere la sospensione in 12 tubi fax. In ogni provetta, aggiungere gli anticorpi utilizzati per caratterizzare le CMSC alle concentrazioni raccomandate. Assicurati di includere i controlli isotipici.

Una volta preparate, incubare le provette per 15 minuti a temperatura ambiente, al riparo dalla luce. Successivamente aggiungere un millilitro di tampone di lavaggio a ciascun tubo per fermare le reazioni. Quindi centrifugare le cellule, rimuovere il surnatante e risospendere i pellet in 250 microlitri di tampone di lavaggio.

Ora procedi a caratterizzare le cellule utilizzando la citometria a flusso. Dopo la differenziazione adipogenica delle cellule, utilizzare la colorazione ORO per verificare l'accumulo di lipidi. Prima di iniziare, assicurati di avere una soluzione funzionante ORO.

Prima di colorare le cellule, rimuovere il terreno e lavare le cellule due volte con due millilitri di PBS. Quindi coprire le cellule con il 4% di paraformaldeide e lasciarle fissare per cinque minuti a temperatura ambiente. Successivamente, scartare la paraformaldeide e lavare le cellule due volte con due millilitri di PBS.

Dopo il secondo lavaggio, aggiungere una quantità sufficiente di soluzione di lavoro ORO per coprire le celle. Quindi incubare la piastra per un'ora a temperatura ambiente. Questa incubazione deve essere effettuata in un ambiente in cui l'autosoluzione non funzionerà, quindi si sconsiglia l'uso di stanze piene.

Dopo l'incubazione, aspirare la soluzione di ORO e lavare più volte le cellule con due millilitri di PBS fino a quando la colorazione non è più visibile nel lavaggio PBS e fino a quando, se osservata al microscopio, non viene rilevata una colorazione aspecifica. Ora, utilizzando un microscopio a contrasto di fase per colture tissutali invertito, è possibile acquisire 20 immagini di ciascun pozzetto con un ingrandimento di 20x. I dettagli sono forniti nel protocollo di testo.

Le CMSC sono state isolate da biopsie endomiocardiche come descritto. Per confermare il loro lignaggio mesenchimale, le cellule sono state incubate con appropriati anticorpi coniugati florofour e analizzate mediante citometria a flusso. Le CMSC erano positive per gli antigeni specifici della superficie mesenchimale CD29, CD44 e CD105.

È noto che la frazione di cellule CD90 positive è variabile. I marcatori per l'eredità endoteliale, l'eredità di monociti o macrofagi, l'eredità onomatopeica e per il complesso maggiore di istocompatibilità non sono stati espressi. Successivamente, le CMSC sono state coltivate in terreno T.ADIPO per il differenziamento adipogenico e colorate con ORO per cercare goccioline lipidiche intracellulari.

Le CMSC di pazienti con cardiomiopatia aritmogena hanno accumulato più goccioline lipidiche rispetto alle cellule dei controlli sani. Queste differenze sono state misurate in condizioni di differenziazione a 72 ore e a sette giorni. Una volta padroneggiata, la risoluzione cellulare può essere eseguita in tre ore, la colorazione può essere eseguita in due ore e l'analisi fax può essere completata in tre ore.

Seguendo questa procedura, potrebbero essere eseguiti altri metodi come i test antidroga per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio se possiamo usare le cellule dello stoma degli stessi pazienti per rispondere a stimoli diversi. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della cardiomiopatia aritmogena per esplorare il coinvolgimento delle cellule dello stroma cardiaco umano nella patogenesi della malattia.