Un modello murino di cancro del pancreas Syngeneic per studiare gli effetti dell'elettroporazione irreversibile

L'obiettivo generale di questo modello è studiare gli effetti dell'elettroporazione irreversibile, o IRE, sul cancro del pancreas in topi immunocompetenti. Questo modello può aiutare a rispondere a molte domande chiave riguardanti il ruolo dell'IRE nel cancro del pancreas. Ad esempio, in che modo l'IRE influisce sul microambiente tumorale locale?

Il vantaggio principale di questo modello è che facilita un'accurata valutazione della crescita tumorale in un sistema immunocompetente, senza richiedere modelli murini knockout o mutanti. Questo metodo può fornire informazioni sugli effetti dell'IRE sul sistema immunitario, in un modello murino immunocompetente di cancro al pancreas. Per l'induzione del tumore sottocutaneo, in primo luogo, radere il sito di iniezione su un topo nero di sei settimane anestetizzato, maschio, C57 di sei settimane, e utilizzare un tampone imbevuto di alcol per pulire il sito due volte.

Quindi, caricare una siringa fredda da un millilitro con una o due volte dieci o sette cellule per millilitro e 250 microlitri di matrice della membrana basale. Collegare un ago calibro 25 alla siringa e caricare l'ago con la sospensione delle cellule tumorali. Premere e ritrarre lo stantuffo alcune volte per rimuovere eventuali bolle d'aria.

Inserire con cautela l'ago sotto la pelle del sito di iniezione, con un angolo di 30 gradi. Con l'ago parallelo al corpo, iniettare lentamente 50 microlitri di cellule tumorali. Dopo 10 secondi, estrarre lentamente l'ago, mantenendolo parallelo senza alcun movimento laterale, e pulire delicatamente il sito di iniezione con un tampone imbevuto di alcol, prima di rimettere il topo nella sua gabbia.

Quando il tumore raggiunge i cinque-sette millimetri, utilizzare pinze sterili e micro forbici per asportare il tumore sottocutaneo, in condizioni sterili in un cappuccio di livello di biosicurezza due, facendo attenzione a non perforare la cavità peritoneale. Lavare immediatamente il tumore asportato, due volte, in PBS sterile. E usa bisturi sterili per tritare il tumore in uno o due pezzi di millimetro cubi.

Quindi, trasferire i pezzi di tumore in una capsula di Petri, contenente un terreno basale DMEM freddo e sterile su ghiaccio. Per impiantare i frammenti tumorali, dopo aver confermato la mancanza di risposta al pizzicamento delle dita, applicare un unguento sugli occhi dell'animale ricevente anestetizzato e posizionare il topo sul lato destro, in modo che il lato sinistro dell'addome sia esposto. Rimuovere i peli addominali con la crema depilatoria e rimuovere la crema con una garza.

Dopo aver disinfettato la pelle esposta con tre salviette sequenziali di povidone al 10% più iodio e alcol, utilizzare un bisturi sterile per praticare un'incisione di 1,5 centimetri nella pelle, un centimetro a sinistra della linea mediana, sotto la gabbia toracica e leggermente mediale alla milza. Esternalizzare delicatamente la milza con una pinza a punta piatta e un applicatore di cotone sterile, e utilizzare la pinza per ritrarre lateralmente la coda del pancreas, nella parte inferiore della milza. Usando una pinza sterile, afferrare un pezzo di tumore finemente tritato e far passare un ago da sutura sterile 6-O sottile attraverso il pezzo.

Inserire l'ago contenente il frammento tumorale nella coda del pancreas, facendo passare lentamente la sutura attraverso il tessuto. Fare attenzione ad evitare il contatto tra il tumore e la muscolatura della parete addominale e il peritoneo, per prevenire l'inseminazione del tumore. Quando il frammento tumorale è stato fissato, rimuovere completamente l'ago dal tessuto e mantenere gli organi completamente esternalizzati per altri 60 secondi, ispezionando eventuali segni di emorragia.

Se non si osserva sanguinamento, utilizzare una pinza smussata o un applicatore con punta di cotone per riportare delicatamente la milza, il pancreas e il tumore nella cavità addominale. Prima che il tumore raggiunga i sei millimetri di diametro, posizionare l'animale anestetizzato sul lato destro per consentire l'accesso al tumore e utilizzare un tagliaun'occhie e un tampone imbevuto di alcol per pulire il sito del tumore. Usando una pinza, sollevare la pelle direttamente sotto il tumore e inserire due elettrodi ad ago attraverso la pelle, paralleli al corpo, per fissare il tumore, facendo attenzione che gli elettrodi non penetrino nella cavità peritoneale.

Impostare l'elettroporatore in modo che fornisca 100 impulsi di microsecondi a una frequenza di un hertz, a 1500 volt per centimetro, per un totale di 150 impulsi, e utilizzare il pedale per erogare gli impulsi, separando ogni serie di 10 impulsi per 10 secondi, per consentire la dissipazione del calore tra ogni serie di impulsi. Poiché le contrazioni muscolari si verificano durante l'erogazione dell'IRE e sono più pronunciate durante la serie iniziale di impulsi, assicurarsi che gli elettrodi siano ancora nella posizione desiderata e che l'animale sia ancora sedato dopo ogni serie di impulsi. Dopo non più di 200 secondi di dosaggio, rimuovere gli elettrodi e registrare la tensione effettiva erogata, come visualizzato sull'elettroportatore.

Quindi, rimetti il topo nella sua gabbia. Per l'IRE di un tumore ortotopico, da otto a 10 giorni dopo l'impianto del tumore, utilizzare una pinza a muso smussato per esternalizzare il tumore con la pinza e catturare saldamente il tumore con gli elettrodi di platino della pinzetta, erogare gli impulsi di elettroporazione, come appena dimostrato, mantenendo il tumore esternalizzato per l'ultima serie di impulsi, per almeno 60 secondi, per monitorare eventuali segni di emorragia. Quindi, riportare il tumore nella cavità addominale e chiudere l'incisione, come dimostrato, monitorando l'animale fino a quando non si è completamente ripreso.

In questo esperimento rappresentativo, i tumori sottocutanei, in quasi il 50% dei topi, sono regrediti completamente dopo 150 impulsi IRE, con solo una lieve regressione dopo 75 impulsi. L'analisi istologica del tessuto tumorale, una settimana dopo l'IRE, ha rivelato ampie regioni di necrosi tumorale centrale, che non sono state osservate nei tumori di controllo, non trattati, e che sono state affiancate da tessuto tumorale vivo, nei casi di regressione tumorale incompleta. Il monitoraggio dei tassi di crescita dei tumori ortotopici impiantati ha rivelato una crescita tumorale costante nel tempo negli animali riceventi, che potrebbe anche essere interrotta dall'IRE, dimostrando la capacità di questo modello di simulare gli effetti dell'IRE, in un modello murino immunocompetente.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in 15 minuti per mouse, se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere le dimensioni del tumore entro la distanza di lavoro degli elettrodi IRE disponibili, poiché i tumori più grandi produrranno risposte incoerenti a causa di un'ablazione incompleta. Altri approcci terapeutici, come le radiazioni o la chemioterapia, possono anche essere utilizzati per rispondere a ulteriori domande sul fatto che la combinazione di trattamenti possa migliorare le risposte tumorali all'IRE.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come stabilire i tumori pancreatici sottocutanei e ortotopici nei topi e come eseguire l'IRE su questi tumori.