Name: Un modello murino di cancro del pancreas Syngeneic per studiare gli effetti dellelettroporazione irreversibile (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Scopri l'elettroporazione irreversibile nel cancro del pancreas usando un modello murino siringeneico immunocompetente. Questo metodo permette di studiare gli effetti sul microambiente tumorale locale e sul sistema immunitario.

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RRW ha ricevuto sostegno per questo lavoro da un assegno di ricerca traslazionale collaborativo finanziato dal C3 San Diego Padres pedale la causa (#PTC2017).

Tutti gli esperimenti sugli animali effettuati seguendo che questo protocollo deve essere approvato dal rispettivo istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC). Tutte le procedure qui descritte sono state approvate da IACUC UCSD.
1. procurarsi animali destinatari
Nota: La linea cellulare 4580 KPC-Luc è stata stabilita da un tumore che presenta in un LSL-KrasG12D / +; LSL-Trp53R172H / +; PDX1Cre / +; LSL-ROSA26 Luc / + mouse (KPC), che è un modello geneticamente costruito del PC su uno sfondo di C57BL/6. Il vantaggio di questa linea cellulare è che esso esprime costitutivamente luciferasi-attivazione del monitoraggio di tumore in Modelli ortotopici. Tuttavia, altre linee cellulari possono anche essere utilizzati, purché siano compatibili con il background genetico dei topi destinatari.
<ol><li>Determinare in anticipo i gruppi sperimentali e il numero di animali per gruppo.</li>
	<li>Scegli l'età (6 - 10 - settimana-vecchi topi consigliati) e sesso degli animali utilizzati secondo l'ipotesi e la linea cellulare utilizzato.</li>
</ol>2. coltura cellule
<ol><li>Uso Dulbecco s modified medium (DMEM) di eagle: miscela nutriente F12 (50: 50) supporti contenenti 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% antibiotico penicillina-streptomicina (media di sviluppo completo) per far crescere cellule 4580 KPC-Luc.</li>
	<li>Se congelato, scongelare le cellule 4 giorni prima dell'impianto del tumore.</li>
	<li>Crescere le cellule a 37 ° C con 5% CO2% e 95% di umidità in condizioni asettiche.</li>
	<li>Tripsinizzano le cellule con 0,25% tripsina per 5 min a 37 ° C prima che raggiungano > confluency di 80% e neutralizzare la tripsina aggiungendo due volte il volume dei mezzi di crescita completa. Nota: Queste cellule non stabilire i tumori in modo efficiente in topi se vengono utilizzati al 100% confluency o se essi sono attraversate per più di 12 volte. Quindi, si consiglia di congelare le cellule alle precedenti passaggi sotto confluency di ottimale.</li>
	<li>Contare le celle utilizzando un emocitometro e procedere per induzione del tumore in se un numero sufficiente è presente (0,5 - 1 x 106 cellule/mouse). In caso contrario, espandere le cellule per un passaggio più fino a numeri di cellulare adeguata sono ottenuti.</li>
</ol>3. induzione di tumori SQ
<ol><li>Preparare i materiali richiesti: P1000 e P100 pipette e puntali, siringa da 1 mL, 25G aghi, matrice della membrana basale (BMM), media basale di DMEM, 1,5 mL provette da centrifuga. Mantenere tutto il materiale sterile e freddo (4 ° C) fino alla fine della procedura. Anche tenere tosatrici e tamponi imbevuti di alcool pronto per l'uso di animali.</li>
	<li>Tripsinizzano (secondo passaggio 2.4) e contare le celle e risospendere li ad una concentrazione di 2-4 x 107 cellule/mL di DMEM freddo.</li>
	<li>Aggiungere un volume equivalente di 100% BMM fare una sospensione cellulare finale in 50% BMM. Il volume finale dovrebbe ammontare a 50 µ l di sospensione cellulare per ogni mouse richiesto. Preparare 10% in eccesso per ospitare lo spazio morto nella siringa e per eventuali errori di pipettaggio.</li>
	<li>Aliquotare la sospensione in 550 volumi µ l in provette da 1,5 mL Centrifuga messo in ghiaccio.</li>
	<li>Trattenere gli animali (6 - settimana-vecchio maschi topi C57BL/6) utilizzando un dispositivo di ritenuta o manualmente. Nota: In alternativa, topi possono essere anestetizzati con isoflurano 2,5% in gas di ossigeno ad un flusso di 2 L/min utilizzando un vaporizzatore di precisione.</li>
	<li>Il sito di iniezione, che è preferibilmente su un fianco sopra una gamba, utilizzando un clipper la barba. Pulire con un batuffolo imbevuto di alcool, nel sito di iniezione due volte.</li>
	<li>Disegnare 250 µ l di sospensione cellulare ad una concentrazione finale di 1-2 x 107 cellule/mL in siringa 1 mL fredda e rimuovere eventuali bolle d'aria muovendo il pistone su e giù. Inserire un ago 25G nella siringa e assicurarsi di riempire lo spazio all'interno dell'ago.</li>
	<li>Inserire delicatamente l'ago sotto la pelle verso il corpo vicino ai fianchi, assicurandosi che l'ago non perforare la cavità peritoneale o la muscolatura degli arti con un'angolazione di 30°.</li>
	<li>Appiattire l'ago parallelo al corpo e appiattire le rughe sulla pelle. Iniettare lentamente 50 µ l di sospensione cellulare. Tenere l'ago al sito di iniezione per 10 s per consentire il BMM a solidificare per evitare eventuali perdite.</li>
	<li>Estrarre lentamente l'ago tenendolo parallelo senza alcun movimento laterale. Pulire il sito di iniezione con un batuffolo imbevuto di alcool delicatamente e rilasciare il mouse nella sua sede. Nota: Se il mouse è stato anestetizzato durante la procedura, monitorare l'animale fino a quando si riacquista i suoi riflessi di raddrizzamento.</li>
	<li>Monitorare la crescita del tumore usando regolarmente pinze fino a 5 mm di diametro.</li>
</ol>4. induzione di tumori di Orthotopic
<ol><li>Preparare i materiali richiesti. Autoclave la chirurgica strumenti come forbici, bisturi, aghi driver e punta e pinze a punta piatta. Mantenere utile suture sterili (6-0 assorbibili e non assorbibili 4-0), tamponi imbevuti di alcool, tosatrici, crema depilatoria, lubrificante occhio, garza di cotone, soluzione di iodio povidone 10%, teli chirurgici, termofori, buprenorfina e agenti anestetici.</li>
	<li>Eutanasia di un mouse di donatore (preferibilmente dello stesso sfondo richiesto per il modello ortotopico) che trasportano un tumore SQ KPC utilizzando una camera di riempimento lento CO2 . Asportare il tumore SQ attentamente in condizioni sterili in una cappa di BSL-2 usando pinze sterili e microforbici poco prima dell'impianto ortotopico. Durante l'asportazione del tumore fare attenzione a non forare la cavità peritoneale e lavare il tumore immediatamente con 2 scambi di PBS sterile.</li>
	<li>Utilizzando il bisturi sterile, tritare il tumore asportato in 1 mm3 pezzi, metterli su una piastra Petri contenente freddo sterile DMEM media basale e conservare il ghiaccio fino al momento dell'impianto.</li>
	<li>Amministrare il destinatario mouse 0.05 - 1 mg/kg buprenorfina analgesico SQ, 30 min prima della chirurgia.</li>
	<li>Anestetizzare i topi destinatari con isoflurano 2-3% in ossigeno (2 L/min) utilizzando un vaporizzatore di precisione (o altri agenti anestetici). Tenere il topi su un 37 ° C riscaldamento pad per l'interezza della procedura. Applicare il lubrificante per gli occhi per evitare il disseccamento. Prova la profondità dell'anestesia da mancanza di sorprendente riflesso inizialmente e confermare l'anestesia chirurgica aereo dalla mancanza del pedale riflesso a un pizzico di delicata punta. Mantenere l'anestesia durante l'intera procedura chirurgica.</li>
	<li>Posizionare il mouse sul dorso e girare delicatamente al suo lato destro in modo che il lato sinistro dell'addome è esposto. Rimuovere i capelli addominali del mouse usando la crema depilatoria e pulire con una garza per garantire che capelli gratis non entra l'incisione di post addome. Preparare l'addome di sinistra per chirurgia usando 3 cicli di iodio povidone 10% seguita da salviettine imbevute di alcool per disinfettare la pelle.</li>
	<li>Usando un bisturi sterile, praticare un'incisione trasversa o obliqua di 1.5 cm nella pelle, 1 cm a sinistra della linea mediana, sotto la gabbia toracica, leggermente mediale alla milza. Quindi, estendere l'incisione attraverso la muscolatura addominale, l'incisione superficiale sovrastante di mirroring.</li>
	<li>Individuare la milza usando piatta con punta forcipe e delicatamente esternare e dalla cavità addominale. Ritrarre la milza utilizzando un applicatore di cotone sterile e trovare la coda del pancreas attaccato al fondo della milza.</li>
	<li>Utilizzando le pinze a punta piatta, ritrarre lateralmente la coda del pancreas.</li>
	<li>Prendere un tumore finemente macinate pezzo dal mouse donatore con la punta di un ago di sutura sterile di belle (6-0) e la posizione utilizzando pinze sterili.</li>
	<li>Mentre delicatamente di retrazione lateralmente il coda/corpo del pancreas, inserire l'ago di sutura contenente il frammento di tumore nella coda del pancreas. Passare la sutura lentamente attraverso il tessuto, che tiene il tumore a contatto con la coda del pancreas. Applicare una o due suture supplementari a seconda dell'orientamento del frammento rispetto il tessuto.</li>
	<li>Rimuovere completamente l'ago dal tessuto e mantenere il pancreas/milza esteriorizzata per un supplemento di 60 s durante l'ispezione per eventuali segni di emorragia o di perdita. Quindi, di interiorizzare delicatamente nella cavità addominale utilizzando forcipe smussato.</li>
	<li>Chiudere la muscolatura addominale utilizzando una sutura riassorbibile 6-0 sia con una cucitura continua o interrotta e la pelle sovrastante utilizzando un 3-0 a 6-0 suturare interrotti non assorbibili. Interrompere l'anestesia a questo punto.</li>
	<li>Consentire il mouse per recuperare nella sua gabbia a casa con libero accesso al cibo e acqua. Posizionare la gabbia su un rilievo di riscaldamento per facilitare il recupero. Monitorare i segni vitali quali la respirazione, aspersione ecc., durante il processo di recupero.</li>
	<li>Confermare i segni del riflesso di raddrizzamento una volta recupera il mouse, e poi tornare la gabbia può regolare alloggiamento.</li>
	<li>Amministrare la buprenorfina 0,05 - 0,1 mg/kg 8-12 h dopo l'intervento chirurgico e ogni 8-12 h dopo la procedura se necessario per i segni di dolore.</li>
	<li>Monitorare la crescita del tumore usando un bioluminescenza in vivo imaging system (Vedi la Tabella materiali).<ol>
<li>Seguire la crescita del tumore da imaging a partire il giorno 4 dopo l'impianto ortotopico ed eseguire due volte a settimana di imaging.</li>
		<li>Il giorno dell'imaging, amministrare (iniezione intraperitoneale) 30 mg/kg D-luciferina per un anestetizzati (2-3% isoflurane in ossigeno (2 L/min)) destinatario mouse 10 min prima di formazione immagine.</li>
		<li>Immagine per l'attività luciferasica utilizzando l'impostazione di luminescenza senza alcun filtro di emissione per un minimo di 5 s esposizione in un imager di luminescenza con piatto riscaldato gratuito auto-fluorescenza e pur mantenendo l'anestesia per i topi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. IRE dei tumori SQ
<ol><li>Preparare i materiali richiesti: quadrato onda electroporator, interruttore di sicurezza a pedale, elettrodi (matrice dell'ago contro pinzette-trode) e adattatori. Mantenere sterile suture (non assorbibile 4-0), tamponi imbevuti di alcool, tosatrici, crema depilatoria, lubrificante di occhio, garza di cotone, buprenorfina e anestetici nelle vicinanze.</li>
	<li>Sterilizzare la pinzetta o aghi elettrodi di matrice utilizzando la sterilizzazione a gas. Sterilizzazione in autoclave non è raccomandato. Utilizzare uno sterilizzatore del branello di vetro per sterilizzare gli elettrodi fra gli animali.</li>
	<li>Amministrare la buprenorfina 0,05 - 0,1 mg/Kg per i topi del tumore-cuscinetto 30 min prima della procedura.</li>
	<li>Procedura 4.4-4.5 per con successo inducono anestesia in topi una volta che l'impianto SQ tumore raggiunge 5 mm di diametro.</li>
	<li>Posizionare il mouse anestetizzato su un lato per accedere il tumore SQ sul fianco. Rimuovere i capelli utilizzando clippers e pulire la pelle usando un batuffolo imbevuto di alcool.</li>
	<li>Per i tumori SQ, utilizzare matrice 2 aghi elettrodi. Elevare la pelle direttamente sotto il sito del tumore usando il forcipe e inserire gli elettrodi attraverso la pelle parallela al corpo assicurandosi che non penetrano nella cavità peritoneale. Una volta attraverso la pelle, posizionare gli elettrodi in modo tale che essi staffa il tumore.</li>
	<li>Programma electroporator a consegnare 100 µs impulsi ad una frequenza di 1 Hz a 1.500 V/cm per un totale di 150 impulsi. Consegnare gli impulsi utilizzando il comando a pedale. Separare ogni set di 10 impulsi di 10 s, al fine di consentire la dissipazione di calore e confermare la corretta posizione degli elettrodi. Nota: Senza l'uso di agenti paralitici, topi verificherà le contrazioni muscolari con IRE che possono causare lo spostamento degli elettrodi se non manualmente fissata.</li>
	<li>Rimuovere gli elettrodi dopo il dosaggio completo, che non devono superare i 200 Record s. consegnata la tensione effettiva, che viene visualizzato sulla electroporator. Consentire i topi recuperare dopo IRE secondo passi 4,14-4,16.</li>
</ol>6. IRE di Orthotopic tumori
Nota: IRE di orthotopic tumori coinvolge un secondo ambulatorio di sopravvivenza sul mouse stesso che richiede un'autorizzazione speciale da IACUC locale prima di iniziare.
<ol><li>Preparare i materiali richiesti: autoclave gli strumenti chirurgici come forbici, bisturi, aghi driver, puntato forcipe e piatta con punta forcipe. Tenere i seguenti nelle vicinanze pure: suture sterili (6-0 assorbibili e non assorbibili 4-0), tamponi imbevuti di alcool, tosatrici, crema depilatoria, occhio lubrificante, garza di cotone, 10% soluzione di iodio povidone, teli chirurgici, termofori, onda quadra electroporator, interruttore di sicurezza a pedale, elettrodi e loro adattatori, buprenorfina e anestetici.</li>
	<li>Valutare i topi per la crescita del tumore di orthotopic da in vivo imaging (Vedi punto 4.17) iniettando 30 mg/kg di D-luciferina intraperitonealmente. Nota: I tumori di orthotopic sono ideali per IRE trattamento 8-10 giorni dopo l'impianto quando i tumori sono chiaramente visibili e ancora confinato al pancreas può essere visto sulle immagini di luminescenza di Luciferase (Vedi i Risultati rappresentante).</li>
	<li>Procedura 4.4-4.9, per individuare il tumore impiantato. Se il tumore non è facile da individuare, utilizzare pinze dal naso smussate per spostare lo stomaco e la milza delicatamente per identificare il tumore.</li>
	<li>Esternare il tumore con il forcipe dal naso smussato e catturare il tumore strettamente con gli elettrodi di platino di pinzette-trode. Consegnare gli impulsi di elettroporazione come programmato nel passaggio 5.7 utilizzando il electroporator onda quadra in set di 10 impulsi controllati dall'interruttore a pedale.</li>
	<li>Mantenere il tumore esteriorizzato per almeno 60 post s IRE per monitorare eventuali segni di emorragia. Reinserire il tumore nella cavità addominale e chiudere l'incisione come descritti (passaggi precedenti 4,13-4,16) e monitorare il mouse fino a quando si recupera.</li>
	<li>Monitorare gli effetti delle IRE sulla crescita del tumore usando la formazione immagine in vivo luciferasi secondo passo 4,17.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno alcuna informazioni finanziarie rilevanti.

In questo studio, abbiamo dimostrato un modello di topo immunocompetenti per PC che può essere utilizzato per studiare gli effetti dell'IRE sulla crescita del tumore. Attualmente, IRE è utilizzata come una tecnica di ablazione non termico solo in altamente selezionati pazienti localmente avanzati del PC che non dispongono di progressione di malattia a distanza dopo mesi di terapia preoperatoria. Suo uso è stato limitato quindi perché la maggior parte dei pazienti con localmente avanzato PC sviluppare malattia metastatica...

L'adenocarcinoma duttale pancreatico (PC) è proiettato a diventare la seconda causa principale delle morti del cancro negli Stati Uniti intorno 20201. La stragrande maggioranza dei pazienti diagnosticati con il PC alla fine muoiono dalla malattia metastatica a distanza2. Il microambiente di PC è notoriamente immunosopressivo e chemioresistente. Relativo stroma desmoplastico contiene una scarsità di cellule T effettrici (anti-tumorale) e una prominenza dei leucociti immunosoppressori, tra cui i macrofagi associati al tumore (TAM), cellule mieloidi soppressore derivate (MDSC) e cellule T regolatorie (Treg)3 . Questi sono alla base della necessità di sviluppare strategie multimodali che neutralizzano questi effetti del microambiente.
IRE è stata sviluppata come un metodo non-termica di ablazione del tumore. A differenza delle tecniche di ablazione termica, IRE non causa necrosi coagulativa rapida ma invece si traduce in graduale apoptotica delle cellule morte4. D'importanza per i tumori pancreatici, IRE non è vulnerabile agli effetti di "dissipatore di calore" e può essere eseguita proprio accanto a vasi sanguigni5. Questa tecnologia ha spazio di 510 (k) dalla FDA6 ed è attualmente utilizzata clinicamente, per i pazienti selezionati con cancro pancreatico resecabile localmente avanzato o borderline. La più grande serie pubblicati di IRE per PC7, la sopravvivenza mediana dei pazienti sottoposti a IRE era approssimativamente doppia la sopravvivenza dei pazienti trattati con chemioterapia moderna da solo senza resezione8,9.
Parecchi studi hanno dimostrato che l'ablazione termica induce una risposta immunitaria sistemica in altri tipi di tumore (rivisto in Chu et al. 10). l'ablazione di radiofrequenza (RFA) in modelli animali del tumore comporta aumentata delle cellule di T si infiltra11,12, compreso un aumento in cellule attivato natural killer (NK) epatocellulare cancro pazienti13, 14e una diminuzione in immunosopressiva Treg nel polmone cancro pazienti15. Un numero molto inferiore di studi hanno esaminato immunitario, microambiente e danno risposte a IRE16. IRE ha dimostrata di stimolare una risposta immunitaria sistemica in modelli di topi immunocompetenti in cui la crescita di osso omoplastico secondario (controlaterale) renale delle cellule è stato ridotto o evitata con IRE di un tumore primario due settimane precedenti17. Essi hanno anche osservato che i topi immunocompetenti richiesto meno tensione per regressione completa che ha fatto topi immunocompromessi. È stato ipotizzato che potrebbe causare IRE presentazione antigenica migliorata rispetto alla necrosi coagulativa di ablazione termica, ma questo non è stato specificamente studiato.
Abbiamo sviluppato un modello syngeneic del topo del PC dalla linea cellulare KPC-Luc 4580 (regalo da J.J. Yeh presso University of North Carolina), che è stato derivato da un tumore sviluppatosi in un maschio LSL-KrasG12D / +; LSL-Trp53R172H / +; PDX1Cre / +; LSL-ROSA26 Luc / + mouse, per studiare gli effetti locali e sistemici di IRE18,19. Questa linea cellulare che esprime luciferasi è immunogenico e anche cancerogeni in topi C57BL/6 immunocompetenti quando iniettato SQ o orthotopically e produce in modo affidabile le metastasi del fegato quando iniettato nella milza. Abbiamo utilizzato un generatore di impulsi programmabile onda quadra per consegnare 100 µs impulsi di energia elettrica ad un rapporto di tensione/distanza di 1.500 V/cm utilizzando una sonda di allineamento di due aghi (separati da 5 mm) o platino pinzette-elettrodi ai tumori SQ o ortotopico, rispettivamente, in topi di modellare gli effetti di IRE in un piccolo animale.

<table><tbody><tr><td>ECM 830 elettroporatore a onda quadra</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BTX # 45-0002 ( 58018-004 )</td><td></td></tr><tr><td>2 needle array</td><td>elettrodo Harvard Apparatus</td><td>45-0167</td><td></td></tr><tr><td>Interruttore a pedale di sicurezza</td><td>Harvard Apparatus</td><td>45-0211</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Tweezer-trode</td><td>Harvard Apparatus</td><td>&nbsp; 45-0486</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12 media</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning&nbsp;</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td></td><td></td>792632</tr><tr><td>Lacrilube</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>19090646</tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>NC1292810</tr><tr><td>D-luciferrina</td><td>Perkin Elmer</td><td>122799</td><td></td></tr><tr><td>IVIS&nbsp; Sistema di imaging in vivo a spettro</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td></td></tr><tr><td>ceppo di topo C57BL / 6J</td><td>Il laboratorio Jackson</td><td>Linea cellulare 000664/Black 6</td><td></td></tr><tr><td>(KPC-Luc 4580)</td><td>J.J. Yeh Lab presso l'Università della Carolina</td><td></td><td></td>del Nord</tr><tr><td>Aghi per siringa BD Precisionglide</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td></td><td></td>Z192406</tr><tr><td>tampone imbevuto di alcol (70% alcol isopropilico)</td> <td>BD</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>Calibri digitali</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-648-17</td><td></td></tr><tr><td>bisturi monouso, applicatori sterili</td><td>VWR</td><td>21909</td><td></td></tr> con <tr><td>punta in cotone VWR</td><td></td><td>89198</td><td></td></tr><tr><td>ago da sutura, 45 cm, misura 6-0</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-3308</td><td></td></tr><tr><td>Ago da sutura, 45 cm, misura 4-0</td><td>Apparecchio Harvard</td><td>72-3314</td><td></td></tr><tr><td>Povidone-iodio 10%</td><td>BD</td><td>29900-404</td><td></td></tr><tr><td>Cuscinetto riscaldante monouso&nbsp;</td><td>KENT SCIENTIFIC CORP.</td><td>TP-3E</td><td></td></tr><tr><td>Tosaerba per topi</td><td>KENT SCIENTIFIC CORP.</td><td>CL8787</td><td></td></tr><tr><td>Telo chirurgico</td><td>Harvard Apparatus</td><td>59-7421</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr></tbody></table>

un modello murino di cancro del pancreas syngeneic per studiare gli effetti dell'elettroporazione irreversibile

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

Cancro del pancreas (PC), una malattia che uccide circa 40.000 pazienti ogni anno negli Stati Uniti, ha eluso con successo diversi approcci terapeutici che le strategie immunoterapeutiche promettente. Elettroporazione irreversibile (IRE) è una tecnica di ablazione non termica che induce la morte delle cellule tumorali senza distruzione delle strutture adiacenti collagene, consentendo in tal modo la procedura deve essere eseguita nei tumori molto vicino ai vasi sanguigni. A differenza delle tecniche di ablazione termica, IRE risultati nella morte cellulare apoptotica graduale, insieme a necrosi immediata ablazione indotto ed è attualmente in uso clinico per i pazienti selezionati con PC localmente avanzato. Un ablativo, non bersaglio procedura specifica come IRE può indurre una miriade di risposte nel microambiente tumorale. Pochi studi hanno affrontato gli effetti di IRE sulla crescita del tumore in altri tipi di tumore, ma nessuno si sono concentrati sul PC. Abbiamo sviluppato un modello syngeneic del topo del PC in cui sottocutaneo (SQ) e orthotopic tumori possono essere trattati con successo con IRE in un ambiente altamente controllato, facilitando le varie routine di post di studi longitudinali. Questo modello animale serve come un sistema robusto per studiare gli effetti dell'IRE e modi per migliorare l'efficacia clinica di IRE.

Abbiamo seguito la procedura descritta sopra e generato tumori SQ sul 5-6 settimana vecchio tipo selvatico C57BL/6 topi inoculati con 1 x 106 cellule con 50% BMM. Quando le dimensioni del tumore ha raggiunto 5-6 mm di diametro, alcuni dei topi sono stati sacrificati, i loro tumori sono stati asportati e impiantato orthotopically in un destinatario topi C57BL/6. IRE è stata effettuata 10 giorni dopo l'impianto come illustrato nella timeline nella Figura 1</s...

Elettroporazione irreversibile (IRE) è una tecnica di ablazione non-termica utilizzata per il trattamento del cancro del pancreas localmente avanzato. Essendo una tecnica relativamente nuova, gli effetti di IRE sulla crescita del tumore sono capiti male. Abbiamo sviluppato un modello syngeneic del topo che facilita lo studio degli effetti dell'IRE su cancro del pancreas.

Un modello murino di cancro del pancreas Syngeneic per studiare gli effetti dell'elettroporazione irreversibile

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

L'obiettivo generale di questo modello è studiare gli effetti dell'elettroporazione irreversibile, o IRE, sul cancro del pancreas in topi immunocompetenti. Questo modello può aiutare a rispondere a molte domande chiave riguardanti il ruolo dell'IRE nel cancro del pancreas. Ad esempio, in che modo l'IRE influisce sul microambiente tumorale locale?Il vantaggio principale di questo modello è che facilita un'accurata valutazione della crescita tumorale in un sistema immunocompetente, senza richiedere modelli murini knockout o mutanti. Questo metodo può fornire informazioni sugli effetti dell'IRE sul sistema immunitario, in un modello murino immunocompetente di cancro al pancreas. Per l'induzione del tumore sottocutaneo, in primo luogo, radere il sito di iniezione su un topo nero di sei settimane anestetizzato, maschio, C57 di sei settimane, e utilizzare un tampone imbevuto di alcol per pulire il sito due volte.Quindi, caricare una siringa fredda da un millilitro con una o due volte dieci o sette cellule per millilitro e 250 microlitri di matrice della membrana basale. Collegare un ago calibro 25 alla siringa e caricare l'ago con la sospensione delle cellule tumorali. Premere e ritrarre lo stantuffo alcune volte per rimuovere eventuali bolle d'aria.Inserire con cautela l'ago sotto la pelle del sito di iniezione, con un angolo di 30 gradi. Con l'ago parallelo al corpo, iniettare lentamente 50 microlitri di cellule tumorali. Dopo 10 secondi, estrarre lentamente l'ago, mantenendolo parallelo senza alcun movimento laterale, e pulire delicatamente il sito di iniezione con un tampone imbevuto di alcol, prima di rimettere il topo nella sua gabbia.Quando il tumore raggiunge i cinque-sette millimetri, utilizzare pinze sterili e micro forbici per asportare il tumore sottocutaneo, in condizioni sterili in un cappuccio di livello di biosicurezza due, facendo attenzione a non perforare la cavità peritoneale. Lavare immediatamente il tumore asportato, due volte, in PBS sterile. E usa bisturi sterili per tritare il tumore in uno o due pezzi di millimetro cubi.Quindi, trasferire i pezzi di tumore in una capsula di Petri, contenente un terreno basale DMEM freddo e sterile su ghiaccio. Per impiantare i frammenti tumorali, dopo aver confermato la mancanza di risposta al pizzicamento delle dita, applicare un unguento sugli occhi dell'animale ricevente anestetizzato e posizionare il topo sul lato destro, in modo che il lato sinistro dell'addome sia esposto. Rimuovere i peli addominali con la crema depilatoria e rimuovere la crema con una garza.Dopo aver disinfettato la pelle esposta con tre salviette sequenziali di povidone al 10% più iodio e alcol, utilizzare un bisturi sterile per praticare un'incisione di 1,5 centimetri nella pelle, un centimetro a sinistra della linea mediana, sotto la gabbia toracica e leggermente mediale alla milza. Esternalizzare delicatamente la milza con una pinza a punta piatta e un applicatore di cotone sterile, e utilizzare la pinza per ritrarre lateralmente la coda del pancreas, nella parte inferiore della milza. Usando una pinza sterile, afferrare un pezzo di tumore finemente tritato e far passare un ago da sutura sterile 6-O sottile attraverso il pezzo.Inserire l'ago contenente il frammento tumorale nella coda del pancreas, facendo passare lentamente la sutura attraverso il tessuto. Fare attenzione ad evitare il contatto tra il tumore e la muscolatura della parete addominale e il peritoneo, per prevenire l'inseminazione del tumore. Quando il frammento tumorale è stato fissato, rimuovere completamente l'ago dal tessuto e mantenere gli organi completamente esternalizzati per altri 60 secondi, ispezionando eventuali segni di emorragia.Se non si osserva sanguinamento, utilizzare una pinza smussata o un applicatore con punta di cotone per riportare delicatamente la milza, il pancreas e il tumore nella cavità addominale. Prima che il tumore raggiunga i sei millimetri di diametro, posizionare l'animale anestetizzato sul lato destro per consentire l'accesso al tumore e utilizzare un tagliaun'occhie e un tampone imbevuto di alcol per pulire il sito del tumore. Usando una pinza, sollevare la pelle direttamente sotto il tumore e inserire due elettrodi ad ago attraverso la pelle, paralleli al corpo, per fissare il tumore, facendo attenzione che gli elettrodi non penetrino nella cavità peritoneale.Impostare l'elettroporatore in modo che fornisca 100 impulsi di microsecondi a una frequenza di un hertz, a 1500 volt per centimetro, per un totale di 150 impulsi, e utilizzare il pedale per erogare gli impulsi, separando ogni serie di 10 impulsi per 10 secondi, per consentire la dissipazione del calore tra ogni serie di impulsi. Poiché le contrazioni muscolari si verificano durante l'erogazione dell'IRE e sono più pronunciate durante la serie iniziale di impulsi, assicurarsi che gli elettrodi siano ancora nella posizione desiderata e che l'animale sia ancora sedato dopo ogni serie di impulsi. Dopo non più di 200 secondi di dosaggio, rimuovere gli elettrodi e registrare la tensione effettiva erogata, come visualizzato sull'elettroportatore.Quindi, rimetti il topo nella sua gabbia. Per l'IRE di un tumore ortotopico, da otto a 10 giorni dopo l'impianto del tumore, utilizzare una pinza a muso smussato per esternalizzare il tumore con la pinza e catturare saldamente il tumore con gli elettrodi di platino della pinzetta, erogare gli impulsi di elettroporazione, come appena dimostrato, mantenendo il tumore esternalizzato per l'ultima serie di impulsi, per almeno 60 secondi, per monitorare eventuali segni di emorragia. Quindi, riportare il tumore nella cavità addominale e chiudere l'incisione, come dimostrato, monitorando l'animale fino a quando non si è completamente ripreso.In questo esperimento rappresentativo, i tumori sottocutanei, in quasi il 50% dei topi, sono regrediti completamente dopo 150 impulsi IRE, con solo una lieve regressione dopo 75 impulsi. L'analisi istologica del tessuto tumorale, una settimana dopo l'IRE, ha rivelato ampie regioni di necrosi tumorale centrale, che non sono state osservate nei tumori di controllo, non trattati, e che sono state affiancate da tessuto tumorale vivo, nei casi di regressione tumorale incompleta. Il monitoraggio dei tassi di crescita dei tumori ortotopici impiantati ha rivelato una crescita tumorale costante nel tempo negli animali riceventi, che potrebbe anche essere interrotta dall'IRE, dimostrando la capacità di questo modello di simulare gli effetti dell'IRE, in un modello murino immunocompetente.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in 15 minuti per mouse, se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere le dimensioni del tumore entro la distanza di lavoro degli elettrodi IRE disponibili, poiché i tumori più grandi produrranno risposte incoerenti a causa di un'ablazione incompleta. Altri approcci terapeutici, come le radiazioni o la chemioterapia, possono anche essere utilizzati per rispondere a ulteriori domande sul fatto che la combinazione di trattamenti possa migliorare le risposte tumorali all'IRE.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come stabilire i tumori pancreatici sottocutanei e ortotopici nei topi e come eseguire l'IRE su questi tumori.

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Il video spiega un metodo chirurgico graduale per l'impianto ortotopico di un frammento tumorale da un donatore canceroso al pancreas di un topo ricevente non canceroso per lo sviluppo del cancro al pancreas. Il PDAC impiantato ortotopicamente potrebbe ricatturare il microambiente tissutale dei tumori del pancreas umano rispetto ai modelli sottocutanei convenzionali (SC) in modo più accurato.

Trapianto di tumore omotrapianto ortotopico: una tecnica per generare modelli murini di tumore pancreatico

Questo video descrive la procedura per eseguire l'elettroporazione irreversibile (IRE) per l'ablazione non termica dei tumori pancreatici nei topi. Sia i tumori sottocutanei (SQ) che quelli ortotopici possono essere trattati con successo con IRE in un contesto altamente controllato, facilitando vari studi post-procedura.

Elettroporazione irreversibile: una tecnica per l'ablazione del tumore pancreatico nel topo

Questo video dimostra il protocollo per l'impianto ortotopico di cellule tumorali pancreatiche fluorescenti verdi che esprimono proteine nel pancreas del topo. Il modello murino ortotopico aiuta a studiare l'efficacia di nuove terapie su tumori primari e metastatici.

Modello murino ortotopico fluorescente: impianto di cellule tumorali che esprimono GFP nel topo per valutare la progressione del tumore in vivo

Questo video mostra un modello ortotopico di cancro al pancreas che utilizza Matrigel per la somministrazione di cellule localizzate e l'imaging a bioluminescenza in vivo per il monitoraggio non invasivo della progressione del tumore. Il modello ortotopico è adatto sia a modelli singenici che a xenotrapianti e potrebbe essere utilizzato in studi preclinici per studiare l'impatto di nuove terapie antitumorali sulla crescita del tumore pancreatico primario e sulle metastasi.

Modello murino di carcinoma pancreatico ortotopico bioluminescente: una tecnica non invasiva per monitorare la progressione del cancro nei topi

Un preclinico, modello murino di metastasi epatiche effettuato tramite una tecnica di iniezione hemispleen.

Un preclinici Modello murino di metastasi epatiche

L'obiettivo di questo protocollo è applicare la risonanza magnetica con contrasto dinamico (DCE-MRI) per xenotrapianti di tumore pancreatico ortotopico nei topi. La DCE-MRI è un metodo non invasivo per analizzare la microvascolarizzazione in un tessuto bersaglio ed è utile per valutare la risposta vascolare in un tumore a seguito di una nuova terapia.

Contrasto dinamico migliorato risonanza magnetica di un modello ortotopico cancro del pancreas mouse

Qui viene presentata una procedura per impiantare cellule tumorali pancreatiche che esprimono proteine fluorescenti verdi (PANC-1 GFP) ortotopicamente nel pancreas di topi Balb-c Ola Hsd-Fox1nu per valutare la progressione del tumore e le metastasi.

Fluorescente ortotopico modello murino di cancro al pancreas

Descriviamo un protocollo per l'impianto guidato ad ultrasuoni di linee cellulari adenocarcinoma pancreatiche derivate da murini direttamente nel sito tumorale nativo. Questo approccio ha portato a tumori pancreatici rilevabili dalla scansione a ultrasuoni entro 2-4 settimane dall'iniezione, e ha ridotto significativamente la proporzione di semina delle cellule tumorali sulla parete peritoneale rispetto all'impianto ortotopico chirurgico.

Impianto ortotopico a ultrasuoni dell'adenocarcinoma dugalese Murine

Nel contesto clinico, i pazienti con cancro al pancreas localizzato saranno sottoposti a pancreatectomia seguita da un trattamento adiuvante. Questo protocollo qui riportato mira a stabilire un metodo sicuro ed efficace per modellare questo scenario clinico nei topi nudi, attraverso l'impianto ortotopico del cancro al pancreas seguito da pancreatectomia distale e splenectomia.

Un modello ortotopico di topo resezionale del cancro al pancreas

Gli allotrapianti ortotopici singeneici di topo dell'adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) ricapitolano la biologia, i fenotipi e le risposte terapeutiche dei sottotipi di malattia. Grazie alla loro progressione tumorale rapida e riproducibile, sono ampiamente utilizzati negli studi preclinici. Qui, mostriamo pratiche comuni per generare questi modelli, iniettando colture di PDAC murino singeneico nel pancreas.

Allotrapianti ortotopici singeneici di topo per modello di cancro del pancreas

Il presente protocollo descrive un nuovo approccio alla modellazione della pancreatite cronica ostruttiva, che prevede la visualizzazione del dotto pancreatico e l'elettrocoagulazione del dotto pancreatico per causare l'ostruzione del dotto pancreatico.

Un modello di pancreatite cronica ostruttiva stabilito attraverso l'elettrocoagulazione

Scopri l'elettroporazione irreversibile nel cancro del pancreas usando un modello murino siringeneico immunocompetente. Questo metodo permette di studiare gli effetti sul microambiente tumorale locale e sul sistema immunitario.

Un modello murino di cancro del pancreas Syngeneic per studiare gli effetti dell'elettroporazione irreversibile

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