Chirurgia stereotassica per la manipolazione genetica in cellule striatali di cervelli di topo neonatale

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nello sviluppo genetico e neurologico, ad esempio durante lo sviluppo postnatale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che si tratta di una tecnica semplice con un dispositivo fatto in casa. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale perché fare iniezioni mirate nel cervello richiede la massima attenzione ai dettagli.

Per iniziare, crea un supporto per utilizzare i cuccioli neonatali in un apparato stereotassico. Per prima cosa prepara il vassoio per la testa. Tagliare circa 1/5 del fondo di una provetta da centrifuga da 1,5 millilitri per creare un'apertura per la testa di un cucciolo neonatale.

Quindi, selezionare una scatola di puntali per pipette vuota che si adatti al piedistallo dell'apparato stereotassico. Quindi utilizzare la colla a caldo per fissare il vassoio della testa alla base della scatola della punta. Quindi, incolla una cassetta per incorporare i fazzoletti sulla scatola in modo che possa sostenere il busto del cucciolo mentre la sua testa è fissata.

Ora prepara aghi in acciaio inossidabile calibro 30 per l'iniezione. Per prima cosa, prepuliteli immergendoli nel cloroformio per tre giorni in una fiala di vetro. Tre giorni dopo, rimuovere con cura gli aghi e lavarli con etanolo assoluto per 20 minuti e con 50 giri al minuto di agitazione.

Quindi lavarli tre volte in etanolo al 70% per 10 minuti per lavaggio anche con agitazione. Dopo i lavaggi, lascia asciugare gli aghi all'aria e conservali in una scatola pulita a temperatura ambiente fino al momento dell'uso. Per l'assemblaggio della microiniezione, utilizzare un segmento di cinque centimetri di tubo in polietilene PE20 per collegare il tubo PE10 a una siringa da 26 gauge da 10 microlitri.

Fissare la giunzione con cianoacrilato. Quindi, montare il nuovo ago per iniezione calibro 30 sull'altra estremità del tubo PE10. Ora caricare la siringa per microiniezione da 10 microlitri.

Rimuovere lo stantuffo e utilizzare un'altra siringa da 25 gauge per caricare nuovamente il gruppo con acqua distillata autoclavata per rimuovere l'aria dal tubo. Quindi riposizionare lo stantuffo nella siringa da microlitro e spingere lo stantuffo fino a quando rimangono solo due microlitri di acqua distillata nella canna e non meno. Quindi, montare con cautela la siringa da microlitri sulla pompa a siringa a microflusso.

Quindi pipettare piccole quantità di colorante Fast Green filtrato allo 0,1% nei liquidi virali sperimentali su un pezzo di parafilm. Ora aspirare una piccola quantità d'aria nella siringa fino a quando non è visibile una bolla d'aria tra l'ago per iniezione e il tubo. Quindi caricare 0,7 microlitri di soluzione Fast Green filtrata per testare il flusso di fluidi nel tubo di microiniezione.

Se il flusso è buono, aspirare un altro piccolo volume d'aria per creare una seconda bolla d'aria e seguire caricando la soluzione di iniezione nel tubo di microiniezione. Collegare e fissare l'ago per microiniezione all'apparato stereotassico e procedere con la microiniezione dei topi neonati. In preparazione all'intervento, pulire accuratamente lo strumento stereotassico con etanolo al 70% e sterilizzare gli strumenti chirurgici con etanolo al 70%.

Quindi anestetizzare un neonato usando l'ipotermia. Metti il cucciolo in un guanto di lattice e immergilo nel ghiaccio tritato fino al collo per cinque minuti. Quindi pizzicare i piedi del cucciolo con una pinza per assicurarsi che non ci sia alcun riflesso del pedale.

Quindi, posiziona il cucciolo con il guanto nel vassoio per la testa e metti del ghiaccio tritato attorno al manicotto in lattice per mantenere l'anestesia per ipotermia. Quindi strofina la testa del cucciolo con etanolo al 70% e individua il punto di riferimento lambda. Segnalo con un pennarello.

Quindi puntare la punta dell'ago verso la lambda e impostare le coordinate anteriore/posteriore e mediale/laterale su zero. Successivamente, consultando un atlante cerebrale, spostare il braccio di iniezione nel sito bersaglio. Ad esempio, lo striato dei cuccioli di P2 è 2,4 millimetri anteriormente alla lambda, 1,0 millimetri su entrambi i lati della linea mediana e 1,7 millimetri ventrale.

Quindi, segnare la posizione del colorante Fast Green sul tubo PE10 usando una penna. Quindi inizia lentamente a penetrare l'ago attraverso la pelle e il cranio fino a quando la punta dell'ago non tocca la superficie del cranio. Impostare la coordinata dorsale/ventrale su zero.

Quindi abbassare lentamente l'ago fino al sito target. Una volta in posizione, attendere un minuto per consentire al parenchima di tornare alla sua forma normale. Quindi eseguire il programma di microiniezione a 100 nanolitri al minuto.

Durante l'iniezione, osservare il colorante Fast Green muoversi nel tubo in PE. È fondamentale far penetrare lentamente l'ago attraverso la pelle e il cranio fino a quando la punta dell'ago non tocca la superficie del cranio. Durante l'iniezione, è imperativo osservare il colorante Fast Green muoversi nel tubo in PE.

Al termine dell'iniezione, attendere un minuto e poi sollevare lentamente l'ago a 1/2 della profondità DV penetrata. Attendi poi altri 30 secondi prima di procedere con il lento ritiro dell'ago dalla testa del cucciolo. Dopo il completamento dell'iniezione, è importante attendere un minuto prima di portare lentamente l'ago a 1/2 della profondità DV penetrata.

Quindi attendi altri 30 secondi prima di ritirare lentamente l'ago dalla testa del cucciolo. Dopo che tutti i siti mirati sono stati iniettati, riscalda il cucciolo per 20 minuti in un'incubatrice a 33 gradi Celsius. Controlla il cucciolo ogni cinque minuti fino a quando non ha riacquistato la decubito sternale.

Quindi riportare il cucciolo alla sua diga. 200 nanolitri di virus che esprimono la ricombinasi del DNA Cre fusi con GFP sono stati iniettati nello striato P2 di topi Ai14. Questi topi hanno espresso il gene reporter tdTomato dopo la delezione mediata da Cre di una cassetta di stop fiancheggiata da loxP.

I cervelli sono stati raccolti a P14 per l'immunocolorazione di GFP e tdTomato. Molte cellule GFP positive trasdotte con AAV erano presenti in tutto lo striato, indicando un'estesa infezione delle cellule striatali da parte dei virus AAV EGFP Cre. Un'espressione estesa simile di tdTomato è stata trovata anche nello striato.

Dopo l'esame microscopico ad alto ingrandimento, è stato riscontrato chiaramente che tutte le cellule striatali positive alla GFP co-esprimono il gene reporter tdTomato. Inoltre, i segnali di tdTomato sono stati rilevati presumibilmente nei terminali assonali nel globo pallido, nella substantia nigra pars reticulata, nelle regioni bersaglio dei neuroni di proiezione striatonigrale e striatopallidale. Insieme, questi risultati suggeriscono una ricombinazione del DNA mediata da Cre loxP indotta dall'espressione mediata da AAV dell'attività di Cre nei neuroni striatali neonatali.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 30 minuti per l'iniezione striatale bilaterale se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che si tratta di un delicato intervento chirurgico al cervello neonatale che richiede pazienza e attenzione. Da questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come l'optogenetica e la chemiogenetica per analizzare la maturazione durante lo sviluppo postnatale.