Name: Determinazione indice del lipido di recupero liquido di fluorescenza nel agente patogeno fungoso Ustilago Maydis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Scopri come determinare l'indice dei goccioli lipidici in Ustilago maydis usando BODIPY 493/503. Questo metodo a fluorescenza permette analisi ad alto rendimento per studiare l'accumulo lipidico in diverse condizioni nutrizionali.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Quest'opera è stata sostenuta da sovvenzioni Instituto Politécnico Nacional-Secretaria de Investigación y integrados (IPN-SIP-20170864), Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT IN222117)-(Universidad Nacional Autónoma de México UNAM) e il Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT 254904-JPP e 256520-GGS). Fundação de Amparo un Pesquisa Rio de Janeiro (FAPERJ-scienziati do Nosso Estado: E 26/103.353/2011). Abbiamo grazie QFB. Oscar Iván Luqueño Bocardo per la descrizione schematica. Ringraziamo il dottor Miguel Tapia Rodríguez per l'aiuto prezioso nella microscopia confocal di LDs. Desideriamo ringraziare il Dr. Bruno Bozaquel Morais per il suo lavoro pionieristico nello sviluppo della tecnica in S. cerevisiae che abbiamo adattato per U. maydis.

1. preparazione del buffer e soluzioni
<ol><li>Per preparare 1 L di fosfato tampone (PBS, pH 7), sciogliere 8 g di NaCl, 0,2 g di KCl, 1,44 g di Na2HPO4, 0,24 g di KH2PO4 in 800 mL di acqua distillata. Regolare il pH a 7.0 con HCl e poi aggiungere acqua per un volume finale di 1 L. PBS può essere fatto come una soluzione di riserva di 10x e conservato a temperatura ambiente.</li>
	<li>Per preparare 10 mL di soluzione di fissaggio, aggiungere 1 mL di formaldeide al 37% o 9 mL di PBS per raggiungere una concentrazione finale del 3,7%. Preparare la soluzione prima dell'uso. Attenzione: Utilizzare guanti per gestire la soluzione di formaldeide.</li>
	<li>Per preparare la soluzione di tempra (500 mM), sciogliere 8,3 g di KI in 100 mL di acqua distillata. Preparare questa soluzione prima dell'uso e conservarle a temperatura ambiente.</li>
	<li>Per preparare la soluzione di riserva di BODIPY 10 mM, sciogliere 10 mg di BODIPY 493/503 in 3,8 mL di solfossido dimetilico (DMSO). Mantenere le aliquote di 100 µ l al buio a-70 ° C.</li>
	<li>Per preparare la soluzione di BODIPY 5 µM-tempra, aggiungere 1 µ l di 10 mM BODIPY 493/503-2 mL di 500 mM tempra di soluzione. Per il dosaggio LFR, una concentrazione finale di 5 µM di BODIPY è richiesta.</li>
	<li>Per preparare la soluzione minerale, aggiungere 0,06 g di H3BO3, 0,14 g di MnCl2-4 H2O, 0,4 g di ZnCl2, 0,04 g di Na2MoO4-2 H2O, 0,1 g di FeCl3-6 H2O e 0,4 g di CuSO 4-5h2O a 1 L di acqua distillata.</li>
	<li>Per preparare la soluzione di sale, aggiungere 16 g di KH2PO4, 4 g di Na2modo4, 8 g di KCl, 2 g di MgSO4, 1 g di CaCl2e 8 mL di soluzione minerale a 1 L di acqua distillata.</li>
	<li>Per preparare il terreno minimo senza una fonte di azoto per U. maydis FB2 (a2b2), aggiungere 10 g di glucosio e 62,5 mL di soluzione salina a 1 L di acqua distillata, secondo Holliday, et al. 31. aggiustare il pH a 7.0 e quindi versare 100 mL di media in matracci da 250 mL e sterilizzarli. Sterilizzare in autoclave per 20 min a 15 psi (1,05 kg/cm2) il ciclo liquido o filtro.</li>
	<li>Per preparare il mezzo di lievito peptone destrosio (YPD), aggiungere 5 g di lievito estratto, 2,5 g di peptone, e 5 g di glucosio a 1 L di acqua distillata. Dispensare 100 mL della soluzione in matracci da 250 mL e sterilizzarli. Sterilizzare in autoclave per 20 min a 15 psi (1,05 kg/cm2) il ciclo liquido o filtro.</li>
</ol>2. cultura condizione e fissazione delle cellule
Nota: Conservare la struttura di LDs fissando le cellule appena possibile. Il fissaggio può essere fatto in microcentrifuga. Celle fisse possono essere mantenute a 4 ° C fino ad un mese se la disidratazione è evitata lasciando un sottile strato d'acqua.
<ol><li>U. maydis cellule in condizioni di coltura crescere pertinenti per lo studio. Avviare la cultura con un iniziale OD600 di 0.05 (1,15 × 106 cellule / mL). Incubare le cellule a 28 ° C, 180 giri/min per 24 h. Un OD600 di 1 corrisponde a 2,3 × 107 cellule / mL.</li>
	<li>Ai selezionati volte, prelevare un'aliquota delle cellule. Per U. maydis, prelevare 5 mL ogni 2 h durante le prime 8 ore. Dopo 8 ore di crescita, le aliquote di 2 mL sono sufficienti.</li>
	<li>Misurare la densità ottica a 600 nm di ciascuna aliquota.</li>
	<li>Centrifugare la sospensione cellulare a 14.000 x g per 1 min a 4 ° C, utilizzando una centrifuga da tavolo. Scartare il surnatante.</li>
	<li>Sospendere il pellet di cellule in 1 mL di PBS-formaldeide 3,7% tampone. Incubare le cellule per 15 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Dopo l'incubazione, centrifugare la sospensione cellulare a 14.000 x g per 1 min a 4 ° C. Scartare il surnatante.</li>
	<li>Lavare il pellet di cellule due volte con un simile volume di acqua distillata (1 mL). Centrifugare la sospensione cellulare a 14.000 x g per 1 min a 4 ° C. Eliminare il supernatante dopo ogni fase di lavaggio.</li>
	<li>Regolare il pellet cellulare a 5 OD600 (1,15 x 108 cell / mL) con acqua distillata acqua (equazione 1). <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57279/57279eq1.jpg">    Equazione 1.
</li>
	<li>Conservare il campione a 4 ° C fino al suo utilizzo.</li>
</ol>3. analisi di fluorescenza di liquido recupero (LFR)
<ol><li>Accendere lo spettrofotometro e aprire il software di Skanlt. Fare clic su nuova sessionee scegliere Avvia e quindi Varioskan Lux. Selezionare protocollo dall'albero della sessione, immettere le impostazioni per le lunghezze d'onda di fluorescenza (eccitazione 485 nm/emissione 510 nm; densità ottica 600 nm) e scegliete guadagno automatico fotomoltiplicatore. Per larghezza di banda di eccitazione, selezionare 12 nm. Nell'ottica, seleziona top (eccitazione del campione è dalla parte superiore del pozzo).</li>
	<li>Immettere una delicata e continua agitazione (300 giri/min). Selezionare RUN piastra OUTe Pausa fino a quando l'azione dell'utente (tempo impiegato per l'aggiunta del campione nei pozzetti). Ripetere il protocollo cinque volte. Fare clic su Salva e scrivere un nome per la sessione sul Campo nome sessione. Il protocollo è ora pronto per l'analisi di campioni.</li>
	<li>Aggiungere 200 µ l della BODIPY 5 µM - estiguuto soluzione in ciascun pozzetto di una piastra 96 ben nero-chiaro inferiore.</li>
	<li>Posizionare la piastra all'interno della camera di spettrofotometro e incubare per 5 minuti a 30 ° C. Da questo punto, proteggere la piastra dalla luce quanto più possibile.</li>
	<li>Fare clic sul pulsante START e leggere la fluorescenza (eccitazione 485/emissione 510) e il OD600 corrispondente per gli spazii in bianco.</li>
	<li>Aggiungere 5 µ l di sospensione cellulare formaldeide-fisso ai pozzetti durante la pausa. Mescolare accuratamente i campioni con la pipetta. Mettere la piastra all'interno dello spettrofotometro e fare clic su continua. Quindi, i campioni saranno trattati secondo il protocollo progettato sopra.</li>
	<li>Ripetere tre aggiunte successive di 5 µ l di sospensione cellulare. Assicurarsi che le celle non precipitare. (Figura 1).</li>
</ol>4. calcolo dell'indice LD
<ol><li>Per ciascun campione in micropiastra, tracciare un grafico della fluorescenza e assorbanza contro il volume di ogni successiva aggiunta (5 punti tra cui il vuoto). In questo studio, è necessario utilizzare software Microsoft Excel per i calcoli. Per tracciare i dati, immettere il volume, fluorescenza e dati di assorbanza nella prima, seconda e terza colonna del foglio dati, rispettivamente. Quindi, selezionare tutti i dati con il cursore, fare clic su Inserisci e selezionare a dispersione (XY).</li>
	<li>Selezionare i punti per ogni linea nel grafico e inserire la rispettiva Linea di tendenza con la casella Visualizza equazione selezionata. Annotare i valori delle piste delle due linee rette, secondo l'equazione 2: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57279/57279eq2.jpg">    Equazione 2 Dove y = fluorescenza o densità ottica, x = volume del campione (0, 5, 10, 15, 20 µ l), m = pendenza della fluorescenza o linea di densità ottica e b = intercetta.</li>
	<li>Dividere la pendenza della retta di fluorescenza dalla pendenza della linea densità ottica per ottenere l'indice di LD, equazione 3. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57279/57279eq3.jpg">    Equazione 3 L'indice di LD corrisponde al quoziente della fluorescenza e piste di densità ottica.</li>
</ol>5. analisi dei dati qualità
<ol><li>Calcolare il coefficiente di correlazione di ogni linea retta: fare clic su Creazione guidata funzione (fx) e scegliete la correlazione. Se r &lt; 0,9, scartare i dati e ripetere le letture. Se r ≥ 0.9, letture sono affidabili.</li>
</ol>

<ol><li>Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 749-752 (2009).</li>
<li>Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+roles+for+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Expanding roles for lipid droplets.</a> Current Biology. 25 (11), R470-R481 (2015).</li>
<li>Sestric, R., Munch, G., Cicek, N., Sparling, R., Levin, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+neutral+lipid+synthesis+by+Yarrowia+lipolytica+on+various+carbon+substrates+under+nutrient-sufficient+and+nutrient-limited+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technology%22%5BJournal%5D)">Growth and neutral lipid synthesis by Yarrowia lipolytica on various carbon substrates under nutrient-sufficient and nutrient-limited conditions.</a> Bioresource Technology. 164, 41-46 (2014).</li>
<li>Raimondi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+lipids+from+glycerol%3A+new+perspectives+on+biotechnological+exploitation+of+Candida+freyschussii%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Getting lipids from glycerol: new perspectives on biotechnological exploitation of Candida freyschussii.</a> Microbial Cell Factories. 13, 83(2014).</li>
<li>Cescut, J., Fillaudeau, L., Molina-Jouve, C., Uribelarrea, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+accumulation+in+Rhodotorula+glutinis+induced+by+nitrogen+limitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+for+Biofuels%22%5BJournal%5D)">Carbon accumulation in Rhodotorula glutinis induced by nitrogen limitation.</a> Biotechnology for Biofuels. 7, 164(2014).</li>
<li>Galafassi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+production+for+second+generation+biodiesel+by+the+oleaginous+yeast+Rhodotorula+graminis%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technology%22%5BJournal%5D)">Lipid production for second generation biodiesel by the oleaginous yeast Rhodotorula graminis.</a> Bioresource Technology. 111, 398-403 (2012).</li>
<li>Kot, A. M., Blazejak, S., Kurcz, A., Gientka, I., Kieliszek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodotorula+glutinis-potential+source+of+lipids%2C+carotenoids%2C+and+enzymes+for+use+in+industries%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Rhodotorula glutinis-potential source of lipids, carotenoids, and enzymes for use in industries.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (14), 6103-6117 (2016).</li>
<li>Rakicka, M., Lazar, Z., Dulermo, T., Fickers, P., Nicaud, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+production+by+the+oleaginous+yeast+Yarrowia+lipolytica+using+industrial+by-products+under+different+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+for+Biofuels%22%5BJournal%5D)">Lipid production by the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica using industrial by-products under different culture conditions.</a> Biotechnology for Biofuels. 8, (2015).</li>
<li>Zhu, Z. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+Lipid+Droplet+Proteome+of+the+Oleaginous+Yeast+Rhodosporidium+toruloides%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the Lipid Droplet Proteome of the Oleaginous Yeast Rhodosporidium toruloides.</a> Eukaryotic Cell. 14 (3), 252-264 (2015).</li>
<li>Kolouchova, I., Mat'atkova, O., Sigler, K., Masak, J., Rezanka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Palmitoleic+and+Linoleic+Acid+in+Oleaginous+and+Nonoleaginous+Yeast+Biomass%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Production of Palmitoleic and Linoleic Acid in Oleaginous and Nonoleaginous Yeast Biomass.</a> International Journal of Analytical Chemistry. , (2016).</li>
<li>Radulovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emergence+of+lipid+droplets+in+yeast%3A+current+status+and+experimental+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genetics%22%5BJournal%5D)">The emergence of lipid droplets in yeast: current status and experimental approaches.</a> Current Genetics. 59 (4), 231-242 (2013).</li>
<li>Takahashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perilipin-Mediated+Lipid+Droplet+Formation+in+Adipocytes+Promotes+Sterol+Regulatory+Element-Binding+Protein-1+Processing+and+Triacylglyceride+Accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Perilipin-Mediated Lipid Droplet Formation in Adipocytes Promotes Sterol Regulatory Element-Binding Protein-1 Processing and Triacylglyceride Accumulation.</a> Plos One. 8 (5), e64605(2013).</li>
<li>Thiam, A. R., Farese Jr, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biophysics+and+cell+biology+of+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The biophysics and cell biology of lipid droplets.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 775-786 (2013).</li>
<li>Penno, A., Hackenbroich, G., Thiele, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipids+and+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Phospholipids and lipid droplets.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1831 (3), 589-594 (2013).</li>
<li>Ageitos, J. M., Vallejo, J. A., Veiga-Crespo, P., Villa, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oily+yeasts+as+oleaginous+cell+factories%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Oily yeasts as oleaginous cell factories.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 90 (4), 1219-1227 (2011).</li>
<li>Athenstaedt, K., Daum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+life+cycle+of+neutral+lipids%3A+synthesis%2C+storage+and+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">The life cycle of neutral lipids: synthesis, storage and degradation.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 63 (12), 1355-1369 (2006).</li>
<li>Marshall, L. L., Stimpson, S. E., Hyland, R., Coorssen, J. R., Myers, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+lipid+droplet+accumulation+associated+with+a+peripheral+sensory+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Increased lipid droplet accumulation associated with a peripheral sensory neuropathy.</a> Journal of Biological Chemistry. 7 (2), 67-76 (2014).</li>
<li>Filipe, A., McLauchlan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+C+virus+and+lipid+droplets%3A+finding+a+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hepatitis C virus and lipid droplets: finding a niche.</a> Trends in Molecular Medicine. 21 (1), 34-42 (2015).</li>
<li>Greenberg, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+lipid+droplets+in+metabolic+disease+in+rodents+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The role of lipid droplets in metabolic disease in rodents and humans.</a> Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2102-2110 (2011).</li>
<li>Aguilar, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+accumulation+and+other+biochemical+changes+induced+in+the+fungal+pathogen+Ustilago+maydis+under+nitrogen-starvation%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets accumulation and other biochemical changes induced in the fungal pathogen Ustilago maydis under nitrogen-starvation.</a> Archives of Microbiology. , (2017).</li>
<li>Bozaquel-Morais, B. L., Madeira, J. B., Maya-Monteiro, C. M., Masuda, C. A., Montero-Lomeli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+fluorescence-based+method+identifies+protein+phosphatases+regulating+lipid+droplet+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A new fluorescence-based method identifies protein phosphatases regulating lipid droplet metabolism.</a> PLoS One. 5 (10), e13692(2010).</li>
<li>Madeira, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TORC1+Inhibition+Induces+Lipid+Droplet+Replenishment+in+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">TORC1 Inhibition Induces Lipid Droplet Replenishment in Yeast.</a> Molecular and Cellular Biology. 35 (4), 737-746 (2015).</li>
<li>Maya-Monteiro, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptin+induces+macrophage+lipid+body+formation+by+a+phosphatidylinositol+3-kinase-+and+mammalian+target+of+rapamycin-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Leptin induces macrophage lipid body formation by a phosphatidylinositol 3-kinase- and mammalian target of rapamycin-dependent mechanism.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (4), 2203-2210 (2008).</li>
<li>Listenberger, L. L., Brown, D. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aListenberger%2C+LL+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22">Current Protocols in Cell Biology</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).</li>
<li>Jump, D. B., Torres-Gonzalez, M., Olson, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soraphen+A%2C+an+inhibitor+of+acetyl+CoA+carboxylase+activity%2C+interferes+with+fatty+acid+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Soraphen A, an inhibitor of acetyl CoA carboxylase activity, interferes with fatty acid elongation.</a> Biochemical Pharmacology. 81 (5), 649-660 (2011).</li>
<li>Hobro, A. J., Smith, N. I. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0924203116302995">An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging.</a> Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).</li>
<li>Chen, Y. T., Wan, L., Zhang, D. P., Bian, Y. Z., Jiang, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+spectroscopic+property+of+Bodipy+derivates+through+tuning+the+molecular+configuration%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemical+%26+Photobiological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Modulation of the spectroscopic property of Bodipy derivates through tuning the molecular configuration.</a> Photochemical & Photobiological Sciences. 10 (6), 1030-1038 (2011).</li>
<li>Pagac, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SEIPIN+Regulates+Lipid+Droplet+Expansion+and+Adipocyte+Development+by+Modulating+the+Activity+of+Glycerol-3-phosphate+Acyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">SEIPIN Regulates Lipid Droplet Expansion and Adipocyte Development by Modulating the Activity of Glycerol-3-phosphate Acyltransferase.</a> Cell Reports. 17 (6), 1546-1559 (2016).</li>
<li>Qiu, B., Simon, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BODIPY+493%2F503+Staining+of+Neutral+Lipid+Droplets+for+Microscopy+and+Quantification+by+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">BODIPY 493/503 Staining of Neutral Lipid Droplets for Microscopy and Quantification by Flow Cytometry.</a> Bio-protocol. 6 (17), (2016).</li>
<li>Rumin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+fluorescent+Nile+red+and+BODIPY+for+lipid+measurement+in+microalgae%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+for+Biofuels%22%5BJournal%5D)">The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae.</a> Biotechnology for Biofuels. 8, 42(2015).</li>
<li>Holliday, R. Ustilago maydis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHolliday%2C+R+%22Handbook+of+genetics%22">Handbook of genetics</a>. King, R. , Plenum. New York. 575-595 (1974).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a divulgazione

LFR è un nuovo metodo che è stato applicato per la prima volta studiare il metabolismo dei lipidi in S. cerevisiae e versioni successive è stato correttamente implementato in U. maydis20,21. Anche se l'indice di LD non dà valore assoluto dei tag accumulati nelle cellule, esso fornisce una rapida idea del contenuto lipidico delle cellule, e l'interpretazione dei dati è semplice, quando vengono confrontati con indice di LD da due o più condizioni ...

Le goccioline del lipido (LDs) sono corpi grassi intracellulari onnipresenti composti da un nucleo di lipidi neutri, principalmente tag ed esteri dello sterolo (SE). Il nucleo è circondato da un monostrato di fosfolipidi che interagisce con le proteine come perilipina ed enzimi coinvolti nella sintesi di lipidi neutri, come il diacilglicerolo acil-transferasi, acetil-CoA carbossilasi e acil-CoA sintasi1. A causa del suo comportamento dinamico, strato monomolecolare del fosfolipide contiene anche triacilglicerolo lipasi che idrolizzano tag e SE2. A seconda del tipo di cellula e l'organismo, stored lipidi neutri possono essere utilizzati per generare energia, o sintetizzano fosfolipidi e molecole di segnalazione. In lieviti e altri funghi, il contenuto di LDs cambia in risposta a variazioni nel rapporto carbonio/azoto in terreni di coltura, che indica che la disponibilità di azoto in diminuzione potrebbe essere la chiave per aumentare la produzione di lipidi neutri3,4 ,5. La produzione di elevate quantità di tag in lievito ha un potenziale impiego in biotecnologia come fonte di biocarburanti e nell'industria alimentare. Alcuni lipidi stored contengono proporzioni elevate degli acidi grassi polinsaturi, come omega 3 e omega 6, con dietetica e nutrizionale 6,7,8,9,10 , 11. LDs di cellule di mammiferi, tra cui le cellule umane, anche contenere tag ed esteri del colesterolo. Il monostrato di fosfolipide interagisce con i mammiferi omologo delle proteine descritto nel lievito LDs e con una proteina supplementare, Perilipina, che è assente in S. cerevisiae12. Una proposta di ruolo per il monostrato di fosfolipidi e le proteine associate è per stabilizzare la struttura LDs e consentire l'interazione di LDs con organelli come mitocondri, reticolo endoplasmatico, peroxisomes e vacuoli, principalmente per lo scambio dei lipidi 13,14. È interessante notare che, negli esseri umani, LDs sembrano essere coinvolti in patologie come il diabete di tipo 2, aterosclerosi, steatoepatite e malattia coronarica, in cui vi è un aumento nel loro numero di 15,16,17 . Alcuni tipi di virus utilizzano LDs come piattaforme per assemblare i virioni 2,18,19.
Dovuto le implicazioni della SSL in patologie umane e loro potenziale utilizzo biotecnologica, l'esatta determinazione sperimentale della formazione di LDs è un compito importante. Questo articolo descrive un'analisi affidabile basata sul recupero della fluorescenza (LFR) di BODIPY 493/503 (4, 4-difluoro-1, 3, 5, 7, 8-pentametil-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene), per ottenere un valore relativo del contenuto di lipidi neutri in cellule. Con questa analisi, è possibile seguire le dinamiche dell'accumulo di lipidi neutri in funghi come U. maydis e S. cerevisiaee anche in cellule di mammifero, senza la necessità di lipidi estrazione 20. Il metodo è stato applicato per la prima volta in S. cerevisiae per identificare le proteine fosfatasi e chinasi coinvolte nella regolazione del metabolismo dei lipidi. Ciò era possibile senza estrazione dei lipidi o proteine purificazione21,22. LFR è stato utilizzato anche per stabilire le dinamiche di formazione di LDs in macrofagi peritoneali23. L'uso di BODIPY 493/503 ha alcuni vantaggi rispetto ad altri coloranti di lipidi neutri come Nilo rosso. BODIPY 493/503 è altamente specifico per lipidi neutri e con uno spettro di emissione stretto, facilitando la rilevazione simultanea di segnali da coloranti come proteina fluorescente rossa o Mito-Tracking, quando i campioni sono analizzati mediante microscopia confocale. Purtroppo, BODIPY 493/503 è sensibile al photobleaching, ma questo processo può essere evitato utilizzando un reagente antiquenching durante l'esposizione a luce24.
Per eseguire il test LFR in cellule di lievito, che vengono allevati nelle condizioni nutrizionali desiderate, e le aliquote siano revocate in momenti diversi. Successivamente, le cellule sono fissate con formaldeide, che preserva l'integrità della LDs per mesi quando le cellule sono conservate a 4 ° C. Altre tecniche di fissaggio dovrebbero essere evitati, soprattutto quelli che utilizzano metanolo o acetone freddo, poiché conducono alla degradazione di LDs nelle cellule24. Per misurare l'indice di LD, formaldeide-fisso cellule sono sospese in acqua per ottenere una concentrazione definita. Quindi, vengono aggiunti a una soluzione che contiene il fluoroforo BODIPY 493/503 bonificato di KI, e quando il fluoroforo entra nella cella e associa il LDs, c'è una ripresa della sua fluorescenza. Concomitante alla misurazione della fluorescenza (485 nm/510 nm), la concentrazione di cellule è quantificata misurando la densità ottica a 600 nm. Ogni campione viene letto quattro volte con l'aggiunta di successivi 5 aliquote µ l di sospensione cellulare formaldeide-fisso per lo stesso bene. Spazii in bianco di fluorescenza e di assorbanza sono acquisite prima dell'aggiunta delle cellule. La qualità della fluorescenza e i dati di assorbanza sono valutati determinando la linearità delle misurazioni: se r < 0,9, i dati vengono eliminati. Il valore di r è importante perché fondamentalmente l'intensità della fluorescenza deve produrre una risposta lineare a concentrazioni crescenti di cella. Se la concentrazione delle cellule è troppo alta, la linearità viene persa. Il dosaggio LFR fornisce un metodo veloce, semplice ed economico per selezionare il fenotipo desiderato di LD in esperimenti di alto-rendimento. Dopo aver selezionato le condizioni desiderate, il contenuto di LD di singole celle possa essere studiato mediante microscopia confocale, utilizzando le stesse cellule di formaldeide-fisso macchiate con BODIPY, fornendo un'immagine di LDs nella cella. Tag e il loro contenuto SE ora può essere ulteriormente analizzati mediante cromatografia su strato sottile.

<table><tbody><tr><td>Spettrofotometro</td><td>Varioskan Lux lettura micropiastra multimodale</td><td>D5879</td><td>Filtro 493/503 o rivelatore monocromatore</td></tr><tr><td>Piastra costar</td><td>Corning Inc.</td><td>3615</td><td>96 pozzetti parete nera/fondo trasparente</td></tr><tr><td>costar</td><td>Corning Inc</td><td>3598</td><td>96 pozzetti piastra per coltura cellulare costar</td></tr><tr><td>BODIPY 493/503</td><td>Invitrogen/ Thermofisher</td><td>D3922</td><td>4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene</td></tr><tr><td>Soluzione di formaldeide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>252549</td><td>reagente ACS, 37% in peso di H2O, contiene il 10-15% di metanolo per prevenire la polimerizzazione</td></tr><tr><td>Ioduro di potassio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>60399</td><td>BioUltra, &ge; 99,5% (AT)</td></tr><tr><td>FB2 Ustilago maydis</td><td>ATCC</td><td>201384</td><td>Basidiomicete-Lievito</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>746398</td><td>reagente ACS, sale inorganico</td></tr><tr><td>Fosfato di potassio monobasico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0662</td><td>reagente ACS</td></tr><tr><td>Seleziona estratto di lievito</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y100</td><td>Miscela di aminiacidi, peptidi, idrosolubili, vitamine e carboidrati per terreni di coltura</td></tr><tr><td>Valigetta N-Z più</td><td>Sigma aldrich</td><td>N4642</td><td>Idrolizzato enzimatico di caseina da latte bovino</td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G-8270</td><td>D (+) glucosio</td></tr><tr><td>Pallone di Skaker</td><td>Pirex</td><td>CLS4450250-6EA</td><td>Agitatore in vetro borosiicato</td></tr><tr><td></td><td>SEV M&eacute; xico</td><td>INO650V-7</td><td>Agitatore orbitale</td></tr><tr><td>Tavolo da centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>5415C</td><td>Microprovette per centrifuga</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z606340</td><td>Eppendorf</td></tr><tr><td>Punte per pipette</td><td>Axygen scientific</td><td>T-200-Y</td><td>Puntali universali per pipette con estremità smussata, 200 microlitri, non sterile</td></tr><tr><td>pipetta mLine</td><td>Biohit</td><td>725130</td><td>8 canali, gamma di volume 5-100 uL</td></tr></tbody></table>

determinazione indice del lipido di recupero liquido di fluorescenza nel agente patogeno fungoso ustilago maydis

Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis

L'articolo viene illustrato come implementare l'analisi di indice di LD, che è un test sensibile micropiastra per determinare l'accumulo di trigliceridi (tag) in goccioline del lipido (LDs). Indice di LD è ottenuto senza estrazione lipidica. Esso permette di misurare il contenuto di LDs negli esperimenti di alto-rendimento in condizioni diverse, come la crescita in ricchi o media di azoto impoverito. Anche se il metodo è stato descritto per la prima volta di studiare il metabolismo di gocciolina del lipido in Saccharomyces cerevisiae, è stato applicato con successo per il basidiomicete Ustilago maydis. Interessante, e perché LDs sono organelli filogeneticamente conservati nelle cellule eucariotiche, il metodo può essere applicato a una grande varietà di cellule, da lievito per cellule di mammifero. L'indice di LD è basato sull'analisi di recupero liquido di fluorescenza (LFR) di BODIPY 493/503 in condizioni di tempra, con l'aggiunta di cellule fissato con formaldeide. Lo iodio potassio è usato come un quencher di fluorescenza. Il rapporto fra la fluorescenza e i pendii di densità ottica è denominato indice di LD. Piste sono calcolate da linee rette ottenute quando BODIPY fluorescenza e densità ottica a 600 nm (OD600) vengono confrontate con aggiunta dei campioni. Qualità ottimale dei dati si riflette dai coefficienti di correlazione pari o sopra 0,9 (r ≥ 0,9). Campioni multipli possono essere letti contemporaneamente, poiché può essere implementata in una micropiastra. Poiché BODIPY 493/503 è un fluorescente lipofilico tingere che partizioni nelle gocce di lipidi, può essere utilizzato in molti tipi di cellule che si accumulano LDs.

LFR, con BODIPY 493/503 come la sonda fluorescente è un metodo semplice e affidabile per studiare l'accumulo dinamico di LDs in U. maydis, a prescindere le condizioni di crescita. Quando le cellule sono state coltivate nel terreno di YPD, c'era un aumento nell'indice LD durante la fase esponenziale, seguito da un declino in fase stazionaria (Figura 2A). Al contrario, in cellule coltivate in fame di azoto, c'era un costante aumento nell'indice di LD i...

Qui, descriviamo un protocollo per ottenere l'indice di gocciolina del lipido (indice di LD) per studiare la dinamica dei triacilgliceroli in cellule coltivate in esperimenti di alto-rendimento. Il dosaggio di indice di LD è un metodo facile e affidabile che utilizza BODIPY 493/503. Questo test non necessita di estrazione lipidica dispendious o analisi di microscopia.

Determinazione indice del lipido di recupero liquido di fluorescenza nel agente patogeno fungoso Ustilago Maydis

The article shows how to implement the LD index assay, which is a sensitive microplate assay to determine the accumulation of triacylglycerols (TAGs) in ...

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare l'indice delle goccioline lipidiche di cellule coltivate in diverse condizioni nutrizionali. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella gocciolina lipidica e nel campo lipidico, come la dinamica dell'accumulo e le diverse condizioni nutrizionali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è possibile leggere più campioni contemporaneamente, perché può essere implementata nella micropiastra.Con l'inizio di questo metodo, quando osserviamo la rifrazione delle cellule di Ustilago maydis coltivate sotto fame di azoto e poi ci rendiamo conto che questo potrebbe significare che questi istruttori potrebbero essere goccioline lipidiche. Così abbiamo contattato Monica Montero dell'Universidade Fédérale do Rio de Janeiro in Brasile che ha implementato il Liquid Florescence Recovery Assay of lipid droplets in Saccharomyces cerevisiae per avviare una collaborazione per adattare la procedura per Ustilago maydis. Il primo passo di questo protocollo è la preparazione dei tamponi e delle soluzioni necessarie.Per preparare una soluzione madre BO-DP da 10 millimolari, sciogliere 10 milligrammi di BO-DP 493-503 e 3,8 milli

lipid-index-determination-liquid-fluorescence-recovery-fungal

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biochemistry

Biochimica

Descriviamo un nuovo metodo quantitativo per l'identificazione lipidomica numerose specie lipidico nel lievito con sondaggio-scan ionizzazione elettrospray spettrometria di massa (ESI / MS). Questo metodo supera attualmente i metodi disponibili per l'identificazione e la quantificazione dei lipidi nella capacità di risolvere le varie forme molecolari dei lipidi, la sensibilità e la velocità.

Una valutazione quantitativa del Lipidome lievito con ionizzazione Electrospray Spettrometria di massa

Introduciamo un digiuno a base di test a fluorescenza che controlla il tasso di estinzione di fluorescenza come una misura di attività del canale gramicidina. I canali gramicidina sono utilizzati come trasduttori di forza molecolare per monitorare i cambiamenti nelle proprietà del doppio strato lipidico, come rilevato da proteine ​​doppio strato spanning.

Gramicidina a base di fluorescenza di analisi, per determinare piccole molecole Potenziale Modifica delle proprietà del doppio strato lipidico

La devastazione delle colture di cereali da semi-infezione funghi ha spinto numerosi sforzi di ricerca per comprendere meglio le interazioni pianta-patogeno. Per studiare le interazioni semi-fungine in un ambiente di laboratorio, abbiamo sviluppato un metodo affidabile per la quantificazione della riproduzione fungina, la biomassa, e la contaminazione da micotossine mediante biotest del kernel.

Quantificazione di colonizzazione fungina, sporogenesi, e la produzione di micotossine Uso Bioassays Kernel

Un semplice protocollo per determinare il contenuto di lipidi neutri di cellule algali utilizzando una procedura di colorazione rosso Nilo è descritto. Questa tecnica consente di risparmiare tempo offre un'alternativa ai protocolli di quantificazione lipidi basato gravimetrici tradizionali. E 'stato progettato per la specifica applicazione di monitoraggio delle prestazioni bioprocess.

Una semplice e rapida il protocollo per la misurazione lipidi neutri in cellule algali Uso fluorescenza

L'articolo descrive un metodo che aumenta il throughput, mentre equilibra lo sforzo e la precisione per l'estrazione dei lipidi dalle membrane cellulari di microrganismi per l'uso nella caratterizzazione di entrambi i lipidi totali e l'abbondanza relativa dei lipidi indicatori per determinare la struttura della comunità microbica del suolo negli studi con molti campioni.

Un metodo di estrazione e analisi lipidica per la caratterizzazione dei microbi del suolo negli esperimenti con molti campioni

Qui, presentiamo un'implementazione MATLAB di rilevamento automatico e descrizione quantitativa delle goccioline lipidiche nelle immagini di microscopia a fluorescenza di fissione e cellule di lievito in erba.

Analisi del contenuto delle goccioline lipidi in Fissione e lieviti in forati utilizzando l'elaborazione automatizzata delle immagini

Questo protocollo descrive la fabbricazione di liposomi e come questi possono essere immobilizzati su una superficie e immagine individualmente in modo parallelo massiccio utilizzando la microscopia a fluorescenza. Ciò consente la quantificazione delle dimensioni e dell'inomogeneità compositiva tra singoli liposomi della popolazione.

Un saggio di liposoma singolo basato sulla microscopia quantitativa per rilevare l'inomogeneità compositiva tra i singoli liposomi

I coloranti fluorescenti vitali sono strumenti essenziali per l'analisi dell'imaging a cellule vive nella moderna biologia delle cellule fungine. Questo documento descrive in dettaglio l'applicazione di coloranti fluorescenti affermati e meno noti per il monitoraggio della dinamica della membrana plasmatica, dell'endo/esocitosi e della morfogenesi delle pareti cellulari nei funghi filamentosi.

Applicazione di coloranti fluorescenti selettivi a membrana e a parete cellulare per l'imaging a celle vive di Filamentous Fungi

Vi presentiamo un protocollo che utilizza la cromatografia liquida accoppiata con la spettrometria di massa tandem per identificare e quantificare i principali lipidi cellulari in Saccharomyces cerevisiae. Il metodo descritto per una valutazione quantitativa delle principali classi lipidiche all'interno di una cellula di lievito è versatile, robusto e sensibile.

Analisi quantitativa del Lipidome cellulare di Saccharomyces Cerevisiae Utilizzando la cromatografia Liquida Accoppiata con la Spettrometria di Massa Tandem

Presentiamo un protocollo di imaging live senza etichette che utilizza tecniche di microscopia ottica trasmessa per catturare immagini, analizzare e quantificare la cinetica di crescita del fungo filamentoso A. nidulans sia in colture sommerse che in mezzi solidi. Questo protocollo può essere utilizzato in combinazione con la microscopia a fluorescenza.

Analisi quantitativa del tasso di crescita di Aspergillus nidulans utilizzando la microscopia dal vivo e il software open source

Questo protocollo descrive un modello di accumulo di lipofuscina in colture epiteliali di pigmenti retinici (RPE) umane altamente differenziate e polarizzate e un test di fagocitosi del segmento esterno (OS) migliorato per rilevare il consumo totale di OS / capacità di degradazione dell'RPE. Questi metodi superano i limiti dei precedenti modelli di lipofuscina e dei classici saggi di fagocitosi del segmento esterno a inseguimento del polso.

Miglioramento dei modelli di lipofuscina e quantificazione della capacità di fagocitosi del segmento esterno in colture epiteliali di pigmenti retinici umani altamente polarizzate

Scopri come determinare l'indice dei goccioli lipidici in Ustilago maydis usando BODIPY 493/503. Questo metodo a fluorescenza permette analisi ad alto rendimento per studiare l'accumulo lipidico in diverse condizioni nutrizionali.

Determinazione indice del lipido di recupero liquido di fluorescenza nel agente patogeno fungoso Ustilago Maydis

Esplora altri video