Isolamento e coltura In Vitro dei macrofagi alveolari murini ed umani

La presente comunicazione descrive le metodologie di isolamento e coltura dei macrofagi alveolari da esseri umani e modelli murini per scopi sperimentali.

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare i macrofagi alveolari umani e di topo dai polmoni e dal liquido di lavaggio broncoalveolare e sviluppare il metodo per la loro coltura in vitro. Questo metodo può aiutare a rispondere ad alcune domande chiave nel campo dell'immunologia polmonare, come il ruolo dei macrofagi alveolari nelle infezioni respiratorie, nell'infiammazione e nell'autoimmunità. Il vantaggio principale di questa tecnica è quello di poter distinguere i macrofagi alveolari dagli altri leucociti polmonari e ottenere una popolazione di macrofagi alveolari altamente purificati a scopo sperimentale.

Posizionare un topo anestetizzato su una superficie di dissezione con il lato ventrale rivolto verso l'alto. Applicare un unguento veterinario oftalmico sugli occhi per prevenire la disidratazione. Pulire l'intera superficie ventrale del mouse con tamponi sterili per la preparazione dell'alcol, imbevuti di isopropanolo al 70%, per disinfettare.

Montare il mouse con tutte e quattro le gambe trattenute. Aprire delicatamente la cavità addominale con strumenti di microdissezione. Bisogna fare attenzione ad aprire quanta più area possibile senza danneggiare gli organi viscerali o creare tessuto sporgente.

Aprire delicatamente la cavità toracica incidendo lentamente la gabbia toracica attraverso il mediastino. Idealmente, la gabbia toracica può essere asportata da un lato all'altro. Bisogna prestare la massima attenzione a non ferire la pleura dei polmoni durante l'apertura della cavità toracica.

Individua la vena cava inferiore e fai un'incisione per dissanguare il topo. Usa dei batuffoli di cotone assorbente per assorbire il sangue. Iniettare 10 millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato ghiacciato nel ventricolo destro per eliminare le cellule del sangue circolanti.

Assorbire il flusso sanguigno con dischetti di cotone assorbente. Una volta completamente perfusi, i polmoni appariranno sbollentati e saranno quindi pronti per il lavaggio. Tagliare delicatamente la pelle e i muscoli del collo per esporre le vie aeree.

Asportare con cura i muscoli, le cartilagini e i tessuti adiposi adiacenti, senza danneggiare la trachea. Successivamente, fai una piccola incisione sulla trachea, posteriormente alla laringe. Questa incisione dovrebbe essere appena sufficiente per inserire un catetere mentre la trachea è ancora attaccata alla laringe.

Il passaggio più critico nella raccolta del fluido BAL è quello di collegare saldamente un catetere alla trachea che ridurrà al minimo le perdite durante il lavaggio. Inserire un catetere da 22 pollici senza ago nella trachea verso i polmoni. Fissare il catetere con una sutura intrecciata di seta e un nodo quadrato.

Avendo mani robuste e per seguire questo passaggio, previene lentamente e delicatamente la rottura della trachea e dei polmoni. Collegare al catetere una siringa da un millilitro, riempita con tampone BAL ghiacciato e instillare lentamente il tampone nei polmoni. Questo gonfierà i polmoni.

Tenere la siringa attaccata al catetere per cinque secondi, quindi aspirare il liquido di lavaggio tirando delicatamente il pistone. Questo sgonfierà i polmoni. Raccogliere il liquido in un tubo conico da 15 millilitri, posto sul ghiaccio.

Ripetere il gonfiaggio e lo sgonfiaggio altre nove volte e raccogliere il liquido di lavaggio. Non superare un millilitro di tampone per lavaggio, poiché ciò potrebbe superare la capacità polmonare e portare alla sua rottura. Centrifugare i 10 millilitri di liquido BAL a 250 volte g e quattro gradi Celsius per 10 minuti.

Il pellet di celle contiene celle BAL. Risospendere le celle BAL in 100 microlitri di tampone di smistamento a flusso. Procedi a colorare e ordinare le celle come descritto nel protocollo di testo.

Preparare un topo anestetizzato per la dissezione, eseguire le incisioni e dissanguare il topo come prima. Iniettare 10 millilitri di PBS ghiacciato nel ventricolo destro per eliminare le cellule del sangue circolanti. Una volta completamente perfusi, i polmoni appariranno sbollentati e saranno pronti per il raccolto.

Sezionare i polmoni recidendo la trachea, i vasi sanguigni e i legamenti in un tubo conico da 15 millilitri, con cinque millilitri di DMEM freddo. Mantienilo sul ghiaccio fino al passaggio successivo. Trasferire i polmoni perfusi in una piastra di coltura sterile e apirogena da 60 millimetri con tre millilitri di DMEM.

Con l'aiuto di una pinza da dissezione, estrarre le vie aeree e altro materiale di tessuto duro non polmonare, se presente. Tritare il tessuto polmonare con un bisturi di dimensioni inferiori al millimetro. Aggiungere 300 microgrammi per millilitro di Liberase TL e cinque unità per millilitro di DNAsi uno.

Miscelare pipettando e incubare a 37 gradi Celsius in un'incubatrice per 25 minuti. Dopo 10 minuti, mescolare delicatamente una volta pipettando. Far passare i polmoni dissociati attraverso un filtro cellulare da 100 micron installato su un tubo conico da 50 millilitri.

Utilizzare il dorso di uno stantuffo di una siringa da un millilitro per schiacciare i grumi di cellule sul filtro. Lavare il filtro con 20 millilitri di tampone di lavaggio. Centrifugare a 500 volte g e quattro gradi Celsius per cinque minuti.

Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 20 millilitri di tampone di lavaggio. Ripetere due volte le fasi di filtrazione e centrifugazione, cambiando ogni volta il filtro e la provetta. Infine, preparare la sospensione a cella singola aggiungendo 100 microlitri di tampone di smistamento del flusso al pellet cellulare.

Eseguire la colorazione degli anticorpi e lo smistamento delle cellule, come descritto nel protocollo di testo. Dopo la cernita delle cellule, raccogliere le cellule centrifugando a 250 volte g e quattro gradi Celsius per 10 minuti. Risospendere le AM di topo in un millilitro di terreno di coltura AM di topo.

In base alla resa e alla necessità sperimentale, seminare le cellule in vetrini da camera, piastre di coltura o fiasche di coltura. Idealmente, seminare le AM a 100.000 per millilitro con 10 millilitri di terreno in un pallone di coltura tissutale T 25. Incubare le cellule in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con atmosfera di anidride carbonica al 5%.

A 24 ore dalla semina, gli AM dovrebbero essere aderenti e non essere staccati da un leggero cambio di terreno di coltura. Rimuovere il terreno mediante aspirazione da un'estremità e rabboccare con terreno fresco preriscaldato a 37 gradi Celsius. Infine, osservare il pallone al microscopio invertito.

Viene mostrata la valutazione citofluorimetrica dei macrofagi alveolari nel liquido di lavaggio alveolare dei bronchi di topo. I macrofagi alveolari sono positivi e identificati per essere cellule CD45 positive, CD11c positive e Siglec-F positive. Qui è mostrato un risultato rappresentativo di macrofagi alveolari di topo coltivati in vitro per 24 ore.

Le cellule sono diventate aderenti e un delicato cambio di terreno di coltura non le staccherà. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa due ore, se eseguita correttamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come distinguere i macrofagi alveolari del topo e dell'uomo da altre cellule polmonari.

Inoltre, come le procedure per ottenere una bella popolazione di macrofagi alveolari per esperimenti a valle. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che non tutti i macrofagi o i fagociti polmonari residenti sono macrofagi alveolari. I macrofagi alveolari sono un tipo di cellule specializzate presenti nei polmoni fin dalla nascita.

Per l'isolamento dei macrofagi alveolari, l'attenzione dovrebbe essere rivolta a metodi di estrazione praticabili dal microambiente alveolare. Il metodo di coltura in vitro qui sviluppato supporta la crescita dei macrofagi alveolari in una condizione di laboratorio che può essere utilizzata in saggi molecolari e cellulari. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come il trasferimento di cellule adottive, la presentazione dell'antigene e la valutazione della risposta agli stimoli infiammatori per rispondere a ulteriori domande sulla biologia dei macrofagi alveolari.