Name: Isolamento e coltura In Vitro dei macrofagi alveolari murini ed umani (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Impara l'isolamento e la coltura in vitro di macrofagi alveolari murini e umani per studiare le infezioni respiratorie e l'infiammazione. Questo metodo fornisce popolazioni altamente pure per ricerche accurate in immunologia polmonare.

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Ringraziamo Clare Prendergast per assistenza con il manoscritto di editing. DKN è supportato da una ricerca concedere (n. 2095) della Fondazione di Flinn e TM è supportato da sovvenzioni dal National Institutes of Health (R01HL056643 e R01HL092514). DKN ha sviluppato i metodi, progettato lo studio e ha scritto il manoscritto; OM assistito con gli studi sugli animali e gli acquisti di campioni clinici; SB assistita con analisi cytometric di flusso e ordinamento delle cellule; TM sotto la supervisione degli studi e il manoscritto è esaminata.

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dalla cura istituzionale degli animali ed uso Committee (IACUC) e Institutional Review Board (IRB) a San Giuseppe Hospital and Medical Center.
1. isolamento di AMs dal fluido murino lavaggio broncoalveolare (BAL)
<ol><li>Anestetizzare un mouse C57BL/6 otto-settimana-vecchio con ketamina (87,5 mg/kg di peso corporeo) e xilazina (12,5 mg/kg di peso corporeo) cocktail tramite un'iniezione intraperitoneale. Procedere quando mouse raggiunge l'anestesia chirurgica con perdita dei riflessi e rilassamento dei muscoli.</li>
	<li>Posizionare il mouse su una superficie di dissezione con il lato ventrale rivolto verso l'alto. Applicare unguento oftalmico veterinario sugli occhi per prevenire la disidratazione e pulire l'intera superficie ventrale del mouse con prep tamponi imbevuti di alcool sterili saturate con 70% di isopropanolo per disinfettare.</li>
	<li>Montare il mouse con tutti e quattro i piedini trattenuti.</li>
	<li>Aprire delicatamente la cavità addominale con strumenti di micro dissezione. Deve prestare attenzione a tanto spazio all'aperto come possibile senza danneggiare alcun organi viscerali o creazione di tessuto sovrastante.</li>
	<li>Aprire delicatamente la cavità toracica di pungere lentamente la gabbia toracica attraverso il mediastino. Idealmente, la gabbia toracica può essere asportata da lato a lato. Cura estrema deve essere presa non per ferire la pleura dei polmoni durante l'apertura della cavità toracica.</li>
	<li>Individuare la vena cava inferiore e fare un'incisione a sanguinare il mouse. Utilizzare tamponi di cotone assorbente per assorbire il sangue.</li>
	<li>Iniettare 10 mL ghiacciata tamponato fosfato salino (PBS) nel ventricolo di destra (usando la siringa da 10 mL e ago 25G) per svuotare le cellule circolanti del sangue. Assorbire il flusso di sangue con tamponi di cotone assorbente. Una volta completamente irrorati, polmoni compaiono sbollentati e quindi sono pronti per il lavaggio.</li>
	<li>Delicatamente tagliare aperto la pelle e muscolo del collo per esporre le vie respiratorie. Asportare con cura i muscoli adiacenti, cartilagini e tessuti grassi senza danneggiare la trachea.</li>
	<li>Praticare una piccola incisione (< 2 mm) sulla trachea posteriore alla laringe. Questa incisione deve essere appena sufficiente per inserire un catetere nella mentre la trachea è ancora attaccata alla laringe. Inserire un catetere 22g 1-inch senza ago nella trachea verso i polmoni. Fissare il catetere con una sutura seta intrecciata (4-0; non assorbibili) con un nodo quadrato. Nota: Il catetere deve essere tagliata sulla base delle dimensioni del mouse. Cateteri estremamente brevi o lunghi tendono a fuoriuscire e/o strappare le vie respiratorie durante il lavaggio. Lunghezza catetere deve essere tale che, quando inserito completamente i resti di punta ben all'interno della trachea e non raggiungere i bronchi primari.</li>
	<li>Attaccare una siringa 1 mL riempita con gelida buffer di BAL (Ca2 + e Mg2 + gratis PBS + 1 mM acido etilendiamminotetracetico, EDTA) per il catetere e infondere lentamente il buffer nei polmoni. Questo si gonfia i polmoni. Tenere la siringa collegata al catetere per cinque secondi e quindi aspirare il fluido di lavaggio tirando delicatamente il pistone. Questo si sgonfierà i polmoni. Raccogliere il liquido in una provetta conica da 15 mL posizionato su ghiaccio.</li>
	<li>Ripetere i passaggio 1.10 per nove volte di più e il fluido di lavaggio della piscina. Non superare 1 mL di tampone per ogni svuotamento, che può superare la capacità polmonare e portare alla sua rottura.</li>
	<li>Eutanasia il mouse con la dose eccessiva di CO2 dal protocollo di IACUC approvato.</li>
	<li>Centrifugare il liquido 10ml BAL a 250 x g a 4 ° C per 10 minuti. Il pellet cellulare contiene cellule di BAL. Attenzione: Il pellet può essere molto piccolo, quindi prestare attenzione quando aspirare il supernatante.</li>
	<li>Risospendere le cellule di BAL in 100 μL di flusso/ordinamento buffer (PBS + 2% calore inattivato siero bovino fetale (FBS) + 1 mM EDTA + 25 mM acido N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic (HEPES)).</li>
	<li>Bloccare il grippaggio non specifico dell'anticorpo al ricevitore di Fc aggiungendo del mouse Fc blocco (clone di 2.4G2, 10 μg/mL) e incubare per 20 minuti sul ghiaccio.</li>
	<li>Eseguire anticorpo che macchia insieme a fluorescenza meno uno (FMO) e single-macchia controlli11,25. Valutare il BAL cellule da un analizzatore delle cellule (Vedi Tabella materiali) seguirono dall'analisi di citometria a flusso di cella singola da software di analisi appropriato (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>AMs di isolare da una fluorescenza-attivato delle cellule sorter (Vedi Tabella materiali) direttamente nel mouse 1 mL sono terreno di coltura quando AMs sono destinati per la cultura in vitro o in vivo delle cellule di trasferimento. In alternativa, sorta di AMs in 1 mL di tampone di lisi (Vedi Tabella materiali) completati con 10 μL/mL di β-mercaptoetanolo per estrazione del RNA.</li>
</ol>2. isolamento di AMs dal polmone del topo, cella singola sospensione
<ol><li>Anestetizzare un mouse C57BL/6 otto-settimana-vecchio con ketamina (87,5 mg/kg di peso corporeo) e xilazina (12,5 mg/kg di peso corporeo) cocktail tramite un'iniezione intraperitoneale. Procedere quando mouse raggiunge l'anestesia chirurgica con perdita dei riflessi e rilassamento dei muscoli.</li>
	<li>Posizionare il mouse su una superficie di dissezione con il lato ventrale rivolto verso l'alto. Applicare unguento oftalmico veterinario sugli occhi per prevenire la disidratazione e pulire l'intera superficie ventrale del mouse con tamponi imbevuti di alcool sterili saturate con 70% di isopropanolo per disinfettare.</li>
	<li>Montare il mouse con tutti e quattro i piedini trattenuti.</li>
	<li>Aprire delicatamente la cavità addominale con strumenti di micro dissezione. Deve prestare attenzione a tanto spazio all'aperto come possibile senza danneggiare alcun organi viscerali o creazione di tessuto sovrastante.</li>
	<li>Aprire delicatamente la cavità toracica di pungere lentamente la gabbia toracica attraverso il mediastino. Idealmente, la gabbia toracica può essere asportata da lato a lato. Cura estrema deve essere presa non per ferire la pleura dei polmoni durante l'apertura della cavità toracica.</li>
	<li>Individuare la vena cava inferiore e fare un'incisione a sanguinare il mouse. Utilizzare tamponi di cotone assorbente per assorbire il sangue.</li>
	<li>Iniettare 10 mL di PBS ghiacciata nel ventricolo di destra (usando la siringa da 10 mL e ago 25G) per svuotare le cellule circolanti del sangue. Una volta completamente irrorati, polmoni compaiono sbollentati e sono pronti per il raccolto.</li>
	<li>Sezionare i polmoni da recidere la trachea, vasi sanguigni e legamenti in una provetta conica da 15 mL con 5 mL di freddo esente per volta Eagle di Dulbecco (DMEM). Mantenere il ghiaccio fino al passaggio successivo.</li>
	<li>Eutanasia il mouse con la dose eccessiva di CO2 dal protocollo di IACUC approvato.</li>
	<li>Trasferire i polmoni irrorati in una piastra di coltura sterile e apirogeno 60 mm con 3 mL DMEM. Con l'aiuto del forcipe di dissezione tirarne fuori le vie respiratorie e altro materiale di tessuto polmonare non duro, se presente. Tritare il tessuto polmonare con un bisturi per < dimensione di 1 mm.</li>
	<li>Aggiungere 300 µ g/mL Liberase TL e 5 U/mL dnasi I, Miscelare pipettando e incubare a 37° C in un incubatore per 25 minuti. Mescolare delicatamente una volta pipettando dopo 10 minuti.</li>
	<li>Passare i polmoni dissociati attraverso un colino di cella µm 100 installato in una provetta conica da 50 mL. Utilizzare il retro di uno stantuffo dalla siringa da 1 mL per mash up del cellulare ciuffi sul filtro. Lavare il filtro con 20 mL di tampone di lavaggio (PBS + 2% calore inattivato FBS + 2 mM EDTA).</li>
	<li>Centrifugare a 500 x g a 4 ° C per 5 minuti. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 20 mL di tampone di lavaggio.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 2.12 e 2.13 due volte, cambiando il filtro e il tubo ogni volta. Pre-ammollo il filtro nel tampone di lavaggio per più di cinque minuti aumenta il rendimento di AM. Preparare la sospensione unicellulare aggiungendo 100 μL flusso/ordinamento buffer per il pellet cellulare.</li>
	<li>Bloccare l'associazione di anticorpi non specifici per il recettore Fc aggiungendo del mouse Fc blocco (clone di 2.4G2, 10 μg/mL) e incubare per 20 minuti sul ghiaccio.</li>
	<li>Eseguire anticorpo che macchia insieme a FMO e singolo-macchia controlli11,25. Valutare il polmone cellule da un analizzatore delle cellule (Vedi Tabella materiali) seguirono da citometria a flusso di cella singola analisi di analisi software.</li>
	<li>AMs di ordinamento di un sorter delle cellule (Vedi Tabella materiali) direttamente nel mouse 1 mL sono terreno di coltura quando AMs sono destinati per la cultura in vitro o in vivo delle cellule di trasferimento. In alternativa, è possibile ordinare AMs in 1 mL di tampone di lisi completati con 10 μL/mL di β-mercaptoetanolo per estrazione del RNA.</li>
</ol>3. isolamento di AMs da umano liquido di BAL
<ol><li>Organizzare il trasferimento del fluido BAL umano dalla clinica al laboratorio a 4 ° C.</li>
	<li>Centrifugare il liquido di BAL (10-50 mL) a 250 x g a 4 ° C per 10 minuti. Il pellet cellulare contiene cellule di BAL11.</li>
	<li>Lavare la pallina con 20 mL di tampone di lavaggio (PBS + 2% calore inattivato FBS + 2 mM EDTA) e centrifugare a 250 x g a 4 ° C per 10 minuti.</li>
	<li>Risospendere le cellule di BAL sono in 100 μL di flusso/ordinamento buffer (PBS + 2% calore inattivato FBS + 1 mM EDTA + 25mm HEPES).</li>
	<li>Bloccare l'associazione di anticorpi non specifici per il recettore Fc aggiungendo umana Fc blocco (clone di Fc1.3070, 25 μg/mL) e incubare per 20 minuti sul ghiaccio.</li>
	<li>Eseguire anticorpo che macchia insieme FMO e singolo-macchia controlli11,24. Valutare il BAL cellule da un analizzatore delle cellule (Vedi Tabella materiali) seguirono da citometria a flusso di cella singola analisi di analisi software.</li>
	<li>AMs di ordinamento di un sorter delle cellule (Vedi Tabella materiali) direttamente nel terreno di coltura umana AM da 1 mL o 1 mL di tampone di lisi completati con 10 μL/mL di β-mercaptoetanolo.</li>
</ol>4. in vitro cultura di AMs
<ol><li>In seguito l'ordinamento delle cellule, raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 250 x g a 4 ° C per 10 min.</li>
	<li>Risospendere umano AMs in 1ml terreno di coltura umana AM [Roswell Park Memorial Institute medie (RPMI) 1640 supplementato con 10% FBS, 20% L-929 cultura surnatante (come fonte di fattore (M-CSF), una concentrazione finale di 100 U/mL di stimolazione della Colonia del macrofago), piruvato di sodio di 1 mM, 10 mM acido N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic (HEPES) e 1 x penicillina/streptomicina (facoltativa)]. Allo stesso modo, risospendere mouse AMs in 1ml mouse AM terreno di coltura [DMEM completati con 10% FBS, 20% L-929 cultura surnatante (come fonte di M-CSF, una concentrazione finale di 100 U/mL), 1 mM sodio piruvato, 10 mM HEPES e 1x penicillina/streptomicina (opzionale )].</li>
	<li>Enumerare il trypan blu-escludendo cellule vitali di un contatore di cellule e regolare la concentrazione di cellule vitali a 1 x 106/ml. Nota: Idealmente, fino a 5 x 105 AMs può essere isolato dal liquido di BAL raccolto da un topo maschio di 8-10 settimane vecchio C57BL/6. La resa di AM dal digest di polmone del mouse è variabile e può essere leggermente inferiore a quella del fluido del mouse BAL. Rendimento AM da umano liquido di BAL dipende dal volume di liquido di BAL, il volume totale di soluzione salina utilizzata per il lavaggio e condizioni cliniche del paziente.</li>
	<li>Basato sul rendimento e sulla necessità sperimentali, seme le cellule in camera diapositive, piastre di coltura o matracci di cultura. Idealmente, seme l'AMs a 1 x 105/ml con 10 mL di terreno in un matraccio di cultura del tessuto T25.</li>
	<li>Incubare le cellule in un incubatore a 37 ° C con 5% CO2 ambiente. Nota: AMs crescerà come cellule aderenti e sono estremamente a crescita lenta (tempo di raddoppiamento > 7 giorni).</li>
	<li>24 ore post-semina, AMs deve essere aderente e non verranno disconnessi da un delicato cambiamento del terreno di coltura. Rimuovere il supporto dall'aspirazione da un'estremità e saziatevi con medium fresco pre-riscaldato a 37 ° C. Nota: Le cellule possono ora utilizzabile per valutare la fisiologia AM o gli effetti di stimoli. AMs cresciuto nelle diapositive di camera può essere convenientemente macchiato con gli anticorpi adatti e sono ideali per la visualizzazione al microscopio. Per la valutazione cytometric di flusso, AMs vengono raccolte tramite incubazione con non-enzimatica delle cellule dissociazione della soluzione.</li>
	<li>Aspirare il terreno di coltura e aggiungere dissociazione soluzione abbastanza per coprire la superficie di cultura (circa 2 mL per fiaschetta T25) e incubare a 37 ° C per 5-10 minuti. Non raschiare sarà necessario, e non è consigliabile per raschiare le cellule meccanicamente. Picchiettare delicatamente i lati, aggiungere 1-2 mL di buffer di flusso/ordinamento e pipettare delicatamente su e giù per staccare la maggior parte delle cellule aderenti.</li>
	<li>Per gli studi di RNA, lisare le cellule direttamente sulla piastra di coltura con l'aggiunta di tampone di lisi.</li>
</ol>

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<li>Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+macrophages+and+dendritic+cell+subsets+in+the+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 49 (4), 503-510 (2013).</li>
<li>Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+function+of+lung-resident+macrophages+and+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells.</a> Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).</li>
<li>Eguiluz-Gracia, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+persistence+of+human+donor+alveolar+macrophages+in+lung+transplant+recipients%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Long-term persistence of human donor alveolar macrophages in lung transplant recipients.</a> Thorax. 71 (11), 1006-1011 (2016).</li>
<li>Yu, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+myeloid+cells+in+human+blood%2C+bronchoalveolar+lavage%2C+and+lung+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. , (2015).</li>
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Gli autori non hanno conflitti di interesse di dichiarare.

AMs sono longevi polmone residenti macrofagi che popolano i polmoni inizia alla nascita e sopportando sopra l' intero ciclo di vita26. Loro ruolo nella fisiologia polmonare7 e patologia12 e il loro potenziale di prevedere di autoimmunità polmonare24 è stati riconosciuti. Perché AMs hanno una presenza a lungo termine in polmoni11,27 e perché sono coinvolti nell'attivazi...

Il microambiente polmonare è un ecosistema complesso in modo univoco con un condotto dell'aria elaborata e sistema vascolare. L'aria inalata viaggia attraverso la trachea e numerosi rami di bronchi e bronchioli prima di raggiungere gli alveoli, dove avviene lo scambio di gas del sangue-aria. A causa del contatto diretto con l'atmosfera, la superficie respiratoria richiede protezione dagli effetti potenzialmente nocivi delle particelle e sostanze inquinanti. Un numero di barriere fisiche, chimiche e immunologiche protegge i polmoni. In particolare, la distribuzione dei fagociti in superficie respiratoria serve un sistema di difesa di prima linea importante. I macrofagi alveolari (ma) sono un tipo di polmone-residente fagociti, e che costituiscono la stragrande maggioranza della piscina del macrofago polmonare. Come suggerisce il nome, AMs sono principalmente localizzati al lume del alveolare e si presentano come cellule sessile che costantemente assaggiare l'atmosfera ambiente e comunicano con l' epitelio alveolare1. In stato stazionario polmoni, oltre il 95% dei fagociti nello spazio alveolare sono AMs2, cui composizione può alterare a causa di infiammazione, infezione o l'esposizione cronica alle sostanze inquinanti.
AMs è partecipare a una vasta gamma di funzioni che possono essere locali ai polmoni e/o di importanza sistemica. Ad esempio, AMs sono essenziali per lo sviluppo e il funzionamento ottimale dei polmoni; sorveglianza immune; e liquidazione dei detriti cellulari, invadendo gli agenti patogeni e particelle inalate3,4,5,6,7. Lo svuotamento mirato di AMs è conosciuto per alterare la clearance del virus respiratori e batteri4,8. Oltre il loro ruolo di fagociti e un difensori di prima linea dell'omeostasi polmonare, AMs sono noti per funzionare come cellule presentanti l'antigene in suscitamento T delle cellule dell'immunità9, rafforza l'efficacia del vaccino intranasale10 e influenzare autoimmunità polmone-limitati dopo trapianto del polmone11,12. Carenza nella funzione di AM è stata collegata a proteinosi alveolare polmonare (PAP), una circostanza derivando da una mutazione genetica, la malignità o l'infezione che altera la clearance di surfattanti polmonari13,14. Trapianto di AMs è ora in fase di studio come un approccio terapeutico per il trattamento di PAP 15,16.
AMs sono noti per provenire durante l'embriogenesi e persistono nei polmoni per tutta la vita senza essere sostituiti facendo circolare i leucociti2,17. Sebbene, fatturato AM è rilevabile nei polmoni omeostatici, diversi livelli di fatturato AM sono stati segnalati in determinate condizioni cliniche compresa l'infezione da influenza virus4, myeloablative irradiazione18, esposizione all'endotossina 19e20di vecchiaia. AMs sono creduti per auto-rinnovarsi tramite un basso grado di proliferazione17,21, ma alcuni studi recenti sostengono che i monociti possono dar luogo ad una popolazione di intravascolare polmonare macrofagi22,23 sotto condizioni sperimentali, ma la funzionalità di questi macrofagi polmonari appena convertiti devono ancora essere definiti nelle malattie polmonari. Inoltre, comprendere la soglia di stimolo nel contesto di attivazione è una zona potenzialmente interessante, come il polmone tenta di mantenere un equilibrio tra segnali infiammatori ed il macchinario immunoregulatory.
Le alterazioni fisiologiche o patologiche che portano alla perdita della regolazione immune sono importanti per valutare in varie regolazioni cliniche (ad es., infezioni respiratorie, malattie infiammatorie polmonari e malattia polmonare fibrotica). Tuttavia, AMs sono sempre più riconosciuti come indicatori o anche determinanti di salute polmonare11,24. Attualmente, non esistono Nessun protocollo unificato disponibile per la raccolta, la caratterizzazione, e/o mantenimento AMs da esseri umani e preclinici modelli murini. Mancanza di un consenso sui precursori AM e fenotipi e l'assenza di una metodologia dettagliata era stato l'ostacolo importante nel decifrare uno o più ruoli di AM in malattia e salute polmonare. Il seguente protocollo offre una definitiva identificazione, isolamento e in vitro cultura strategia che permette di avanzare la comprensione del comportamento di AM e facilitare AM-mirati studi diagnostici e terapeutici.

<table><tbody><tr><td>Soluzione dissociante cellulare non enzimatica</td><td>Millipore-Sigma</td><td>C5789</td><td></td></tr><tr><td>Puralube Vet Unguento</td><td>Dechra</td><td>620300</td><td></td></tr><tr><td>22G Catetere</td><td>Terumo Medical Products</td><td>SR-OX2225CA</td><td></td></tr><tr><td>4-0 Sutura intrecciata in seta non assorbibile&nbsp;</td><td>Kent Scientific</td><td>SUT-15-2</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' soluzione salina tamponata con fosfato&nbsp;</td><td>Corning</td><td>21-031-CM</td><td></td></tr><tr><td>Blocco Fc per mouse&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di lisi (kit di RNA PureLink)</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>12183018A</td><td></td></tr><tr><td>b-Mercaptoetanolo&nbsp;</td><td>Millipore-Sigma</td><td>M6250&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Selezionatore cellulare FACSAria II&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>644832</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina&nbsp; (Ketathesia)</td><td>Henry Schein</td><td>56344</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina&nbsp; (AnaSed)</td><td>Akorn</td><td>139-236</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>10-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TL&nbsp;</td><td>Millipore-Sigma</td><td>5401020001</td><td></td></tr><tr><td>DNasi I</td><td>Millipore-Sigma</td><td>AMPD1-1KT</td><td></td></tr><tr><td>100&mu; filtro cellulare m&nbsp;</td><td>Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Blocco Fc umano</td><td>BD Biosciences</td><td>564220</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Corning</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>Contacellule automatizzato Countess II</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>AMQAX1000</tr><tr><td>Soluzione blu di tripano</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>15250061</tr><tr><td>HEPES</td><td>Corning</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150H</td><td></td></tr><tr><td>linea cellulare L-929</td> American <td>Type Culture Collection</td><td>ATCC,&nbsp; CCL-1</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina&nbsp;</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Corning</td><td>25-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>T25 Pallone per coltura tissutale</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>156367</tr><tr><td>piatto di coltura da 60 mm&nbsp;</td><td>Millipore-Sigma</td><td>CLS3261</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Provetta conica&nbsp;</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>provetta conica da 50 mL</td><td>Corning</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>LSRControllo cellulare di erba</td><td>BD Biosciences</td><td>657669</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo</td><td>v10.4</td><td>Software di analisi</td></tr><tr><td>Anti-CD45 (Topo)</td><td>Biolegend</td><td>147709</td><td>Clone I3/2.3, FITC coniugato</td></tr><tr><td>Anti-CD11b (Topo)</td><td>Biolegend</td><td>101228</td><td>Clone M1/70, PerCP/Cy5.5 coniugato</td></tr><tr><td>Anti-CD11c (Topo)</td><td>BD Biosciences</td><td>565452</td><td>Clone N418, BV 421 coniugato</td></tr><tr><td>Anti-I-Ab (Topo)</td><td>Biolegend</td><td>116420</td><td>Clone AF6-120.1, PE/Cy7 coniugato</td></tr><tr><td>Anti-Siglec-F (Topo)</td><td>BD Biosciences</td><td>562757</td><td>Clone E50-2440, PE-CF594 coniugato</td></tr><tr><td>Anti-Siglec-H (Topo)</td><td>Biolegend</td><td>129605</td><td>Clone 551, PE coniugato</td></tr><tr><td>Anti-F4/80 (Topo)</td><td>Biolegend</td><td>123118</td><td>Clone BM8, APC/Cy7 coniugato</td></tr><tr><td>Anti-Ly-6C (Topo)</td><td>Biolegend</td><td>128035</td><td>Clone HK1.4, BV605 coniugato</td></tr><tr><td>Anti-CD64 (Topo)</td><td>Biolegend</td><td>139311</td><td>Clone X54-5/7.1, BV711 coniugato</td></tr><tr><td>Anti-CD24 (Topo)</td><td>BD Biosciences</td><td>563115</td><td>Clone M1/69, BV510 coniugato</td></tr><tr><td>Anti-CD103 (Topo)</td><td>BD Biosciences</td><td>745305</td><td>Clone OX-62, BV650 coniugato</td></tr><tr><td>Anti-CD317 (Topo)</td><td>Biolegend</td><td>127015</td><td>Clone 927, APC coniugato</td></tr><tr><td>Anti-CXCR1 (Topo)</td><td>Biolegend</td><td>149029</td><td>Clone SA011F11, BV785 coniugato</td></tr><tr><td>Anti-CD45 (Umano)</td><td>Biolegend</td><td>304017</td><td>Clone HI30, AF488 coniugato</td></tr><tr><td>Anti-CD11b (Umano)</td><td>Biolegend</td><td>101216</td><td>Clone M1/70, PE/Cy7 coniugato</td></tr><tr><td>Anti-HLA-DR (Umano)</td><td>Biolegend</td><td>307618</td><td>Clone L243, APC/Cy7 coniugato</td></tr><tr><td>Anti-CD169 (Umano)</td><td>Biolegend</td><td>346008</td><td>Clone 7-239, APC coniugato</td></tr><tr><td>Anti-CD206 (Umano)</td><td>Biolegend</td><td>321106</td><td>Clone 15-2, PE coniugato</td></tr><tr><td>Anti-CD163 (Umano)</td><td>Biolegend</td><td>333612</td><td>Clone GHI/61, BV421 coniugato</td></tr></tbody></table>

isolamento e coltura in vitro dei macrofagi alveolari murini ed umani

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

I macrofagi alveolari sono macrofagi terminalmente differenziati, polmone-residente di origine prenatale. I macrofagi alveolari sono unici nella loro lunga vita e il loro importante ruolo nello sviluppo polmonare e funzione, come pure le loro risposte del polmone localizzato all'infezione ed infiammazione. Ad oggi, non esiste alcun metodo unificato per la gestione dei macrofagi alveolari da esseri umani e topi, isolamento e identificazione. Tale metodo è necessario per gli studi su questi importanti cellule immuni innate nei diversi contesti sperimentali. Il metodo descritto qui, che può facilmente essere adottato da qualsiasi laboratorio, è un approccio semplificato alla raccolta macrofagi alveolari dal fluido di lavaggio broncoalveolare o dal tessuto polmonare e il loro mantenimento in vitro. Poiché i macrofagi alveolari si verificano principalmente come cellule aderenti negli alveoli, il focus di questo metodo è il loro sloggiare prima del raccolto e l'identificazione. Il polmone è un organo altamente vascolarizzato, e vari tipi di cellule di origine mieloide e linfoide abitano, interagiscono e sono influenzati da microambiente polmonare. Utilizzando il set di marcatori di superficie descritto qui, ricercatori possono senza ambiguità e facilmente distinguere macrofagi alveolari da altri leucociti e li purifica per applicazioni a valle. Il metodo di coltura sviluppato nel presente documento supporta sia umane e macrofagi alveolari per la crescita in vitro il mouse ed è compatibile con studi molecolari e cellulari.

L'approccio di cytometric di flusso ad identificare mouse AMs è illustrato nella Figura 1. Questo include l'analisi di un insieme minimo di indicatori della superficie necessari nella distinzione AMs da altri fagociti residenti del polmone o del polmone-infiltrazione. Analisi differenziale è necessaria per identificare positivamente AMs da interstiziali macrofagi, cellule dendritiche, neutrofili, monociti e macrofagi polmonari monocito-derivato che si verific...

La presente comunicazione descrive le metodologie di isolamento e coltura dei macrofagi alveolari da esseri umani e modelli murini per scopi sperimentali.

Isolamento e coltura In Vitro dei macrofagi alveolari murini ed umani

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare i macrofagi alveolari umani e di topo dai polmoni e dal liquido di lavaggio broncoalveolare e sviluppare il metodo per la loro coltura in vitro. Questo metodo può aiutare a rispondere ad alcune domande chiave nel campo dell'immunologia polmonare, come il ruolo dei macrofagi alveolari nelle infezioni respiratorie, nell'infiammazione e nell'autoimmunità. Il vantaggio principale di questa tecnica è quello di poter distinguere i macrofagi alveolari dagli altri leucociti polmonari e ottenere una popolazione di macrofagi alveolari altamente purificati a scopo sperimentale.Posizionare un topo anestetizzato su una superficie di dissezione con il lato ventrale rivolto verso l'alto. Applicare un unguento veterinario oftalmico sugli occhi per prevenire la disidratazione. Pulire l'intera superficie ventrale del mouse con tamponi sterili per la preparazione dell'alcol, imbevuti di isopropanolo al 70%, per disinfettare.Montare il mouse con tutte e quattro le gambe trattenute. Aprire delicatamente la cavità addominale con strumenti di microdissezione. Bisogna fare attenzione ad aprire quanta più area possibile senza danneggiare gli organi viscerali o creare tessuto sporgente.Aprire delicatamente la cavità toracica incidendo lentamente la gabbia toracica attraverso il mediastino. Idealmente, la gabbia toracica può essere asportata da un lato all'altro. Bisogna prestare la massima attenzione a non ferire la pleura dei polmoni durante l'apertura della cavità toracica.Individua la vena cava inferiore e fai un'incisione per dissanguare il topo. Usa dei batuffoli di cotone assorbente per assorbire il sangue. Iniettare 10 millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato ghiacciato nel ventricolo destro per eliminare le cellule del sangue circolanti.Assorbire il flusso sanguigno con dischetti di cotone assorbente. Una volta completamente perfusi, i polmoni appariranno sbollentati e saranno quindi pronti per il lavaggio. Tagliare delicatamente la pelle e i muscoli del collo per esporre le vie aeree.Asportare con cura i muscoli, le cartilagini e i tessuti adiposi adiacenti, senza danneggiare la trachea. Successivamente, fai una piccola incisione sulla trachea, posteriormente alla laringe. Questa incisione dovrebbe essere appena sufficiente per inserire un catetere mentre la trachea è ancora attaccata alla laringe.Il passaggio più critico nella raccolta del fluido BAL è quello di collegare saldamente un catetere alla trachea che ridurrà al minimo le perdite durante il lavaggio. Inserire un catetere da 22 pollici senza ago nella trachea verso i polmoni. Fissare il catetere con una sutura intrecciata di seta e un nodo quadrato.Avendo mani robuste e per seguire questo passaggio, previene lentamente e delicatamente la rottura della trachea e dei polmoni. Collegare al catetere una siringa da un millilitro, riempita con tampone BAL ghiacciato e instillare lentamente il tampone nei polmoni. Questo gonfierà i polmoni.Tenere la siringa attaccata al catetere per cinque secondi, quindi aspirare il liquido di lavaggio tirando delicatamente il pistone. Questo sgonfierà i polmoni. Raccogliere il liquido in un tubo conico da 15 millilitri, posto sul ghiaccio.Ripetere il gonfiaggio e lo sgonfiaggio altre nove volte e raccogliere il liquido di lavaggio. Non superare un millilitro di tampone per lavaggio, poiché ciò potrebbe superare la capacità polmonare e portare alla sua rottura. Centrifugare i 10 millilitri di liquido BAL a 250 volte g e quattro gradi Celsius per 10 minuti.Il pellet di celle contiene celle BAL. Risospendere le celle BAL in 100 microlitri di tampone di smistamento a flusso. Procedi a colorare e ordinare le celle come descritto nel protocollo di testo.Preparare un topo anestetizzato per la dissezione, eseguire le incisioni e dissanguare il topo come prima. Iniettare 10 millilitri di PBS ghiacciato nel ventricolo destro per eliminare le cellule del sangue circolanti. Una volta completamente perfusi, i polmoni appariranno sbollentati e saranno pronti per il raccolto.Sezionare i polmoni recidendo la trachea, i vasi sanguigni e i legamenti in un tubo conico da 15 millilitri, con cinque millilitri di DMEM freddo. Mantienilo sul ghiaccio fino al passaggio successivo. Trasferire i polmoni perfusi in una piastra di coltura sterile e apirogena da 60 millimetri con tre millilitri di DMEM.Con l'aiuto di una pinza da dissezione, estrarre le vie aeree e altro materiale di tessuto duro non polmonare, se presente. Tritare il tessuto polmonare con un bisturi di dimensioni inferiori al millimetro. Aggiungere 300 microgrammi per millilitro di Liberase TL e cinque unità per millilitro di DNAsi uno.Miscelare pipettando e incubare a 37 gradi Celsius in un'incubatrice per 25 minuti. Dopo 10 minuti, mescolare delicatamente una volta pipettando. Far passare i polmoni dissociati attraverso un filtro cellulare da 100 micron installato su un tubo conico da 50 millilitri.Utilizzare il dorso di uno stantuffo di una siringa da un millilitro per schiacciare i grumi di cellule sul filtro. Lavare il filtro con 20 millilitri di tampone di lavaggio. Centrifugare a 500 volte g e quattro gradi Celsius per cinque minuti.Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 20 millilitri di tampone di lavaggio. Ripetere due volte le fasi di filtrazione e centrifugazione, cambiando ogni volta il filtro e la provetta. Infine, preparare la sospensione a cella singola aggiungendo 100 microlitri di tampone di smistamento del flusso al pellet cellulare.Eseguire la colorazione degli anticorpi e lo smistamento delle cellule, come descritto nel protocollo di testo. Dopo la cernita delle cellule, raccogliere le cellule centrifugando a 250 volte g e quattro gradi Celsius per 10 minuti. Risospendere le AM di topo in un millilitro di terreno di coltura AM di topo.In base alla resa e alla necessità sperimentale, seminare le cellule in vetrini da camera, piastre di coltura o fiasche di coltura. Idealmente, seminare le AM a 100.000 per millilitro con 10 millilitri di terreno in un pallone di coltura tissutale T 25. Incubare le cellule in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con atmosfera di anidride carbonica al 5%.A 24 ore dalla semina, gli AM dovrebbero essere aderenti e non essere staccati da un leggero cambio di terreno di coltura. Rimuovere il terreno mediante aspirazione da un'estremità e rabboccare con terreno fresco preriscaldato a 37 gradi Celsius. Infine, osservare il pallone al microscopio invertito.Viene mostrata la valutazione citofluorimetrica dei macrofagi alveolari nel liquido di lavaggio alveolare dei bronchi di topo. I macrofagi alveolari sono positivi e identificati per essere cellule CD45 positive, CD11c positive e Siglec-F positive. Qui è mostrato un risultato rappresentativo di macrofagi alveolari di topo coltivati in vitro per 24 ore.Le cellule sono diventate aderenti e un delicato cambio di terreno di coltura non le staccherà. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa due ore, se eseguita correttamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come distinguere i macrofagi alveolari del topo e dell'uomo da altre cellule polmonari.Inoltre, come le procedure per ottenere una bella popolazione di macrofagi alveolari per esperimenti a valle. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che non tutti i macrofagi o i fagociti polmonari residenti sono macrofagi alveolari. I macrofagi alveolari sono un tipo di cellule specializzate presenti nei polmoni fin dalla nascita.Per l'isolamento dei macrofagi alveolari, l'attenzione dovrebbe essere rivolta a metodi di estrazione praticabili dal microambiente alveolare. Il metodo di coltura in vitro qui sviluppato supporta la crescita dei macrofagi alveolari in una condizione di laboratorio che può essere utilizzata in saggi molecolari e cellulari. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come il trasferimento di cellule adottive, la presentazione dell'antigene e la valutazione della risposta agli stimoli infiammatori per rispondere a ulteriori domande sulla biologia dei macrofagi alveolari.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Qui, descriviamo i protocolli per la raccolta murini macrofagi alveolari, che risiedono le cellule immunitarie innate nei polmoni, e di esaminare la loro attivazione in risposta a co-coltura con nanoparticelle polianidride.

Raccolta murini macrofagi alveolari e Valutare l&#39;attivazione cellulare indotta da nanoparticelle polianidride

Presentiamo un protocollo semplice ed efficiente per la generazione di macrofagi umani. Buffy coats sono trattati con doppia centrifugazione in gradiente di densità e monociti isolati sono poi differenziate a macrofagi in sacchi di coltura cellulare teflonato. Questo massimizza i rendimenti macrofagi e facilita la raccolta di cellule per esperimenti successivi.

Isolamento di monociti umani con un doppio centrifugazione in gradiente e la loro differenziazione a macrofagi in coltura cellulare Borse teflonato

Un metodo per valutare la capacità di isolato macrofagi alveolari del mouse per controllare la crescita di spore di Aspergillus fagocitati mediante microscopia confocale.

Valutare l&#39;attività anti-fungina isolato Alveolar macrofagi dal Microscopia confocale

Descriviamo qui un semplice protocollo per isolare i macrofagi peritoneali murini. Questa procedura è seguita dall'estrazione dell'RNA per effettuare l'analisi dell'espressione genica dopo la stimolazione dei recettori Toll-like.

Isolamento di murini peritoneale macrofagi di effettuare analisi di espressione genica Al Toll-like recettori stimolazione

Le cellule del midollo osseo coltivate con il fattore stimolante le colonie di macrofagi granulociti (GM-CSF) generano una coltura eterogenea contenente macrofagi e cellule dendritiche (DC). Questo metodo evidenzia l'utilizzo del legame MHCII e ialuronano (HA) per differenziare i macrofagi dalle DC nella coltura GM-CSF. I macrofagi in questa cultura hanno molte somiglianze con i macrofagi alveolari.

Generazione e identificazione di GM-CSF Derivato alveolo-come macrofagi e dendritiche cellule da midollo osseo di topo

Viene presentato un protocollo per la coltura cellulare di macrofagi derivati da monociti umani differenziati da fattori stimolanti le colonie di macrofagi (M-CSF). Il protocollo utilizza la crioconservazione dei monociti accoppiata alla loro differenziazione di massa in macrofagi. Quindi i macrofagi raccolti possono essere seminati in pozzetti di coltura alle densità cellulari richieste per l'esecuzione degli esperimenti.

Cultura dei macrofagi macrofagi colony-stimulating factor differenziata umana derivate da monociti

Qui segnaliamo i metodi comuni per analizzare la funzione fagocitica dei macrofagi alveolari murini e lo spazio batterico dal polmone. Questi metodi di studio in vitro fagocitosi dei branelli di isotiocianato di fluorescina e fagocitosi in vivo di Pseudomonas aeruginosa Green Fluorescent Protein. Inoltre descriviamo un metodo per l'eliminazione di p. aeruginosa nei topi.

Fagocitosi del macrofago alveolare e la Clearance di batteri nei topi

Descriviamo un metodo per la lavorazione del fluido di lavaggio bronchoalveolar e corrisponde al sangue periferico di individui cronicamente affetti da HIV sulla terapia antiretrovirale per valutare i serbatoi polmonari di HIV. Questi metodi portano all'acquisizione di cellule T CD4 altamente pure e macrofagi alveolar che possono successivamente essere utilizzati per immunofenofizzazione e quantificazioni HIV DNA/RNA mediante reazione a catena di polimerasi ultrasensibili.

Trattamento del bronchoalveolar Lavage Fluid e del sangue abbinato per il macrofago alveoere e CD4- Immunofenotyping a cellule T e valutazione del serbatoio dell'HIV

Presentato qui è un protocollo ottimizzato per isolare, coltivare, tradurre e differenziare i monociti primari umani da individui infettati dall'HIV e dai controlli sani.

Isolamento, trasfezione e cultura dei monociti umani primari

Qui è presentato un protocollo per l'isolamento primario del sangue monocito umano, nonché la loro differenziazione in macrofagi e cellule dendritiche e assemblaggio con cellule epiteliali in un modello polmonare umano multicellulare. Vengono confrontate le risposte biologiche delle coculture composte da cellule immunitarie differenziate dai monociti appena isolati o scongelati, dopo l'esposizione a stimoli proinfiammatori.

Modello alveolare umano multicellulare composto da cellule epiteliali e cellule immunitarie primarie per la valutazione del pericolo

Il presente protocollo descrive l'isolamento e la coltura di macrofagi derivati dal midollo osseo dai topi.

Isolamento e coltura di macrofagi derivati dal midollo osseo da topi

Impara l'isolamento e la coltura in vitro di macrofagi alveolari murini e umani per studiare le infezioni respiratorie e l'infiammazione. Questo metodo fornisce popolazioni altamente pure per ricerche accurate in immunologia polmonare.

Isolamento e coltura In Vitro dei macrofagi alveolari murini ed umani

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