Name: Segnale Nanosonda rapido aumento di sintesi di nanoparticelle di oro In Situ (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Scopri come amplificare i segnali di nanosonde in biosensori mediante riduzione di acido cloroaurico su nanoparticelle d'oro, argento e ossido di ferro. Questo metodo versatile aumenta la sensibilità analitica di 100 volte.

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Finanziamenti dal Consiglio europeo della ricerca nell'ambito settimo programma dell'Unione europea quadro (FP/2007-2013) / ERC Grant accordo n. 615458, il Consiglio svedese della ricerca ed eccellenza Pronova centro per tecnologia della proteina (VINNOVA - svedese Si ringraziano l'agenzia governativa per i sistemi innovativi).

Campioni di siero umano sono stati ottenuti in conformità con i requisiti legali ed etici del paese di raccolta, vale a dire. con l'approvazione di un comitato etico (o simili) e con il consenso scritto del donatore.
1. preparazione: valorizzazione soluzione:
<ol><li>Preparare un tampone a pH 6 MES 10mm sospendendo MES sale di sodio in acqua deionizzata. Regolare il pH a 6 utilizzando una soluzione di NaOH 4m.</li>
	<li>Preparare una soluzione di4 HAuCl in tampone a pH 6 MES 10mm (soluzione 1) da 5 mM.</li>
	<li>Preparare una soluzione di 1,027 M H2O2 in tampone a pH 6 MES 10mm (soluzione 2). Nota: I volumi di soluzione 1 e 2 di soluzione dipende il numero e le dimensioni dei microarrays per essere migliorata. Ad esempio, un microarray di 10x10 mm richiede 100 μL volume totale (soluzione 1 + soluzione 2) per garantire che l'area di microarray è a contatto con la soluzione di valorizzazione. Dopo la diluizione, H2O2 deve essere utilizzato entro circa 30-45 giorni.</li>
</ol>2. nanoparticelle preparazione:
<ol><li>Preparare 40 nm AuNPs come descritto da Bastús et al. 16 brevemente, iniettare 1 mL di precursore di4 HAuCl acquosa 25 mM in una soluzione bollente di 2,2 mM sodio citrato (149 mL). Attendere fino a quando si osserva un colore rosso-vino. Utilizzare questa soluzione di nanoparticelle come semi per la procedura semi-crescita.</li>
	<li>A 90 ° C, iniettare 1 mL di citrato di sodio 60 mM seguito da 1 mL di 25 mM HAuCl4 nel seme contenente soluzione. Dopo 30 min, la reazione è completa. Ripetere il passaggio di seme-crescita al massimo cinque volte fino a 40 nm nanoparticelle sono ottenute, in come descritto da Bastús et al. 16
</li>
	<li>Misurare l'assorbanza UV-vis della soluzione finale di nanoparticelle per determinare le dimensioni delle nanoparticelle. 17 in alternativa, micrografi di trasmissione (TEM) possono essere acquisiti e utilizzati per determinare le dimensioni delle nanoparticelle.</li>
	<li>Preparare 90 nm AgNPs come descritto da Rivero et al. 18 brevemente, aggiungere dimethylaminoborane (DMAB) ad una soluzione agitata vigorosamente di poli (acido acrilico, sale di sodio) (PAA) e AgNO3. Il volume finale della soluzione è di 50 mL e la concentrazione finale di DMAB, PAA e AgNO3 sono 1,6 mM, 10 mM e 3,33, rispettivamente. Nota: 100 nm IONPs modificato con gruppi carbossilici e 50 nm SiNPs modificato con gruppi carbossilici sono stati acquistati.</li>
	<li>Funzionalizzare la AuNPs con anticorpi seguendo il protocollo descritto da Puertas et al. 19 brevemente, aggiungere 1 mg di COOH-PEG-SH (5000 g · mol− 1) ad una soluzione di 1.2x10-9 M AuNPs (densità ottica 10, OD). Regolare il pH a 12 con una soluzione di NaOH M 4.<ol>
<li>Lasciate che la soluzione durante la notte, incubare a temperatura ambiente (~ 22 ° C), in condizioni di agitazione lieve.</li>
		<li>Rimuovere l'eccesso di PEG mediante centrifugazione la soluzione a 13800 x g per 15 min.</li>
		<li>Risospendere il pellet con 500 μL di acqua deionizzata.</li>
		<li>Incubare il AuNPs PEG-modificato con 5 μmol N.-(3-Dimethylaminopropyl)-n '-ethylcarbodiimide cloridrato (EDC) e 7,5 μmol di N-Idrossisulfosuccinimide sale sodico (sulfo-NHS) a 10 mM a pH 6 MES buffer per 30 min a 37 ° C.</li>
		<li>Rimuovere l'eccesso di EDC e sulfo-NHS mediante centrifugazione la soluzione a 13800 x g per 5 min.</li>
		<li>Risospendere il pellet in 500 µ l di tampone a pH 6 MES 10mm e aggiungere 100 g·mL-1 dell'anticorpo. Lasciate che la soluzione Incubare per 2 ore a 37 ° C.</li>
		<li>Rimuovere l'eccesso di anticorpo mediante centrifugazione la soluzione a 13800 x g per 10 min due volte e risospendere il pellet in 500 μL di 10 mM sodio fosfato pH 7.5, tampone di NaCl 0,3 M. Lasciate che la soluzione Incubare 30 min a 37 ° C.</li>
		<li>Rimuovere l'anticorpo rilegato aspecifica mediante centrifugazione la soluzione a 13800 x g per 10 min due volte e risospendere il pellet in 500 μL di 1% albumina di siero bovino (BSA) in tampone a pH 6 MES 10 mM. Incubare i campioni a 4 ° C durante la notte.</li>
		<li>Lavare l'eccesso di BSA di centrifugazione la soluzione a 13800 x g per 10 min due volte e risospendere il pellet in 500 μL di tampone a pH 6 MES 10 mM.</li>
		<li>Seguire i passaggi 2.5.1 attraverso 2.5.9 per la modifica di 5 M AgNPs, 0,5 mg di IONPS e 0,5 mg di SiNPs con l'anticorpo, regolando di conseguenza la quantità di EDC e sulfo-NHS.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. verticale flusso saggi basati su carta:
<ol><li>Preparare i microarrays depositando una gradiente concentrazione di proteina G su membrana di nitrocellulosa carta con una stampante robotica. Dopo la stampa, lasciare che i microarrays asciugare durante la notte a temperatura ambiente (~ 22 ° C).</li>
	<li>Eseguire il test di flusso verticale con la membrana racchiusa in un portafiltro. Flusso di una soluzione di 8 M di IgG-modificato AuNPs utilizzando una pompa ultra-siringa ad un tasso di 1 ml · min− 1. Ripetere questo passaggio con una soluzione di 17 M IgG-modificato AgNPs, 0.1 mg·mL− 1 IgG-modificato SiNPs e 0.1 mg·mL− 1 IgG-modificato IONPs.</li>
	<li>Lasciate che i microarray asciugare a temperatura ambiente (~ 22 ° C) per 30 min e analizzarli in uno scanner piano con una risoluzione di 4800 dpi. Salvare le immagini come file TIFF a 24-bit colore.</li>
</ol>4. test di base di vetro commerciali di riferimento:
<ol><li>Incubare le due lastre di vetro per 120 min per il rilevamento di componenti allergeniche con 4 campioni diversi di siero umano a temperatura ambiente.</li>
	<li>Sciacquare i microarray con acqua deionizzata.</li>
	<li>Incubare una diapositiva con un anticorpo di IgE anti-umano coniugato fluorescente a temperatura ambiente (~ 22 ° C) per 30 min. Incubare la seconda diapositiva con IgE anti-umano dell'anticorpo-modificate AuNPs per 30 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Sciacquare i microarray con acqua deionizzata.</li>
	<li>Misurare l'intensità di fluorescenza del microarray che è stato incubato con l'anticorpo di IgE anti-umani fluorescente con un apparato di scansione laser. Digitalizzare il microarray che è stato incubato con anti-l'umano IgE anticorpo-modificato AuNPs con uno scanner piano per acquisizione del segnale colorimetrico.</li>
	<li>Dopo la digitalizzazione, incubare il microarray con la soluzione di valorizzazione a temperatura ambiente (~ 22° C) per 5 min.</li>
	<li>Lavare l'elettrodo con acqua deionizzata e lasciare asciugare per 10 min a temperatura ambiente (~ 22 ° C).</li>
	<li>Digitalizzare il microarray con uno scanner piano con una risoluzione di 4800 dpi per acquisizione del segnale colorimetrico. Salvare le immagini come 16-bit scala di grigi file TIFF.</li>
</ol>5. Microarray incubazione con soluzione di aumento:
<ol><li>Pre-mescolare la stessa quantità di soluzione 1 e soluzione 2 o mescolare direttamente sulla superficie del sensore e assicurarsi che l'area di interesse sul microarray è coperto con la miscela di soluzione.</li>
	<li>Lasciate che il sensore Incubare a temperatura ambiente con la soluzione di potenziamento per fino a 5 min di incubazione più lungo di tempo può portare una migliore sensibilità così come il più alto rapporto segnale/rumore, soprattutto per i microarrays basati su carta.</li>
	<li>Lavare il microarray di immergendo in acqua deionizzata una volta per 5 s. lasciare asciugare a temperatura ambiente. Nota: Al momento della fase di asciugatura dipende dal materiale del microarray. Per un microarray basati su carta, la fase di asciugatura richiede circa 30 min. Per un microarray di base di vetro, la fase di asciugatura richiede circa 5-10 min.</li>
</ol>6. imaging analisi:
<ol><li>Analizzare l'intensità di fluorescenza con strumento software. Prendere in considerazione tutti i risultati che sono uguali o superiori a 0,3 unità di standardizzare Isac (ISU), seguendo le indicazioni d'uso (DfU) del produttore del sensore.</li>
	<li>Analizzare le intensità colorimetriche utilizzando uno strumento software. Invertire i file di immagine, misurare l'intensità di ogni spot e calcolare l'intensità media pixel. Utilizzare i valori dei punti tripli per calcolare il valore di segnale finale come una media di tre intensità di spot media pixel.</li>
</ol>

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<li>Bastús, N. G. N., Comenge, J. J., Puntes, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetically+controlled+seeded+growth+synthesis+of+citrate-stabilized+gold+nanoparticles+of+up+to+200+nm%3A+size+focusing+versus+Ostwald+ripening%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Kinetically controlled seeded growth synthesis of citrate-stabilized gold nanoparticles of up to 200 nm: size focusing versus Ostwald ripening.</a> Langmuir. 27 (17), 11098-11105 (2011).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Attualmente, tecniche di aumento del segnale per le analisi con rilevazione basata su Nanosonda sono entrambi basati su enzima12, richiedono un secondo set di nanoparticelle per destinazione il rilevamento nanosonde21 o, nel caso di tecniche di colorazione, sono limitate a l'uso di AuNPs o AgNPs come sonde di rilevamento. 22 qui, un metodo semplice, veloce e privo di enzima è descritto per il potenziamento del segnale di saggi basati sul rilevamento Nanosonda. Con questo metodo, è stato possibile migliorare il segnale colorimetrico fornito da 4 tipi di nanosonde: AuNPs, AgNPs, IONPs e SiNPs.
Il fattore di amplificazione osservata per ogni set di nanosonde era di 100 volte, tranne per il SiNPs dove non era possibile a causa della mancanza di segnali di pre-miglioramento quantificazione del fattore di potenziamento. Questo fattore di potenziamento suggerisce che l'efficienza del protocollo è simile in tutti i tipi di nanosonde. Inoltre, quando il protocollo di potenziamento è stato effettuato su un supporto di carta dove è stata stampata una serie di diluizioni di una sospensione AuNPs stock, è stato osservato un fattore di 10000-fold amplificazione. Precedente alla valorizzazione, le macchie visibili con il minor numero di AuNPs erano dove sono state stampate circa 10000 nanoparticelle, dopo il miglioramento le macchie che harboring le nanoparticelle meno di 10 è diventato visibile. 20
Le condizioni stabilite per il protocollo di potenziamento qui presentato hanno permesso approfittando della riduzione di Au3 + Au0 per migliorare il segnale, mantenendo al minimo il rumore di fondo. La valorizzazione può essere eseguita subito dopo il test viene fatto così come sui microarrays che sono stati conservati per fino a parecchi mesi dopo l'analisi è stata eseguita. La soluzione di valorizzazione è costituito da una miscela di 1:1 di soluzione 1 e soluzione 2. Entrambe le soluzioni possono essere precedentemente mescolate o misti direttamente quando pipettato sul microarray. La differenza tra pre-miscelazione o miscelazione diretta colpisce solo la shelf-life della soluzione di potenziamento. Quando pre-miscelati la shelf-life è di 5-7 giorni aumenta a 30-45 giorni se non pre-miscelata.
Un'ulteriore analisi dei risultati ha mostrato che il metodo di valorizzazione non interferisce con l'analisi quantitativa del biosensore. Una correlazione lineare tra l'intensità osservata e la concentrazione dell'analita è stata mantenuta (tabella 1). I dati ottenuti per 4 campioni clinici pre-caratterizzati usando il base di vetro allergene componente microarray immunoassay, con rilevazione della fluorescenza standard e rilevazione colorimetrica, ha mostrato una buona concordanza tra i due metodi di rilevamento. Confronto tra l'intensità media di fluorescenza (MFI) e l'intensità media colorimetrico (MCI), un media R2 = 0.79 + /-0.08 è stata ottenuta quando i dati sono registrati 10 su entrambi gli assi. Questo esperimento ha mostrato che il metodo di valorizzazione può essere applicato a un kit commerciale se utilizza le nanosonde per il rilevamento o può essere adattato per rilevazione basata su Nanosonda.
L'efficacia del metodo di valorizzazione si basa su due aspetti critici. È importante assicurare che la miscela di soluzione 1 e soluzione 2 è omogeneo. Senza una miscela omogenea, il sensore sarà a contatto con le frazioni della soluzione di valorizzazione dove è predominante rispetto a altra soluzione 1 o 2. Che ridurrà l'efficienza della riduzione di Au3 + Au0, danneggiando così l'efficienza del potenziamento. È anche importante avere l'intera area di interesse del microarray a contatto con la soluzione di aumento durante il periodo di incubazione.
Per raggiungere ultrasensibile valorizzazione di un segnale, un tempo di incubazione più lungo (circa 5 min) con la soluzione di aumento sarà richiesto. Per evitare lo sviluppo di rumore di fondo che possa interferire con l'acquisizione del segnale, la superficie di microarray deve essere precedentemente bloccati (ad es. BSA, PEG) per evitare la rapida deposizione aspecifici di Au0 e conseguente formazione di un oro strato.
Una limitazione per il metodo di valorizzazione è l'efficacia intrinseca del dosaggio. Il test richiede avere controlli negativi e positivi da garantire che il potenziamento del segnale osservato può essere attribuito a risultati positivi true. Se c'è un'interazione aspecifica delle nanosonde con il bersaglio, segnali acquisiti dopo aumento non sarà valido.
Altre tecniche di valorizzazione si basano sulla o aggregazione di nanoparticelle o colorazione delle nanoparticelle con un materiale che consente l'acquisizione del segnale migliorata. Promuovendo la raccolta del numero di nanoparticelle presso il sito di rilevamento, l'acquisizione del segnale sarà possibile sia visivamente o misurazioni UV-Vis. 5 queste tecniche di potenziamento del segnale si basano su un sistema di rilevazione in due fasi, la rilevazione iniziale dell'analita di interesse e una seconda fase dove il reporter è necessario per associare al costrutto di rilevamento iniziale. Tali strategie non universalità a causa della necessità di ottimizzazione dei protocolli specifici di potenziamento per ogni tipo di analisi.
Le tecniche di potenziamento colorazione, come macchiatura d'argento, molto come il protocollo qui presentato, consentono la valorizzazione diretta dei costrutti di rilevamento segnale. Tuttavia, a differenza del protocollo che è mostrato qui, macchiatura d'argento ha solo dimostrata di essere applicato a AuNPs o AgNPs. 6 , 7 , 8 , 9
L'applicabilità di questo metodo probabilmente potrebbe estendersi su qualsiasi test che utilizza AuNPs, AgNPs, IONPs o SiNPs come agenti di rilevamento. Ulteriore lavoro è svolto per studiare l'applicazione del metodo in sensori costituiti da altri materiali.

L'utilizzo di nanomateriali quali nanoparticelle d'oro (AuNPs) o nanoparticelle di ossido di ferro (IONPs) ha permesso le applicazioni in biosensori con versatilità e sensibilità migliorata. 1 la pletora dei metodi sviluppati per la decorazione della superficie delle nanoparticelle con vari ligandi, quanto a sfruttare la loro alta superficie in rapporto al volume, hanno permesso la progettazione di sensori con sensibilità migliore. 2 nondimeno, uno strumento di biosensori è dipenda dal numero di nanosonde necessaria per ottenere un segnale rilevabile. Ad esempio, nel caso di 40 nm AuNPs, di acquisire un segnale attraverso spettroscopia UV-vis, circa 90 × 106 nanosonde è necessaria al fine di rilevare in modo efficace il target di interesse. 3 questa limitazione di densità Nanosonda può essere aggirata attraverso l'uso di amplificazione del segnale. Tali strategie4 può essere basato su aggregazione interparticella o agglomerato, dove la densità di nanosonde iniziale è aumentata accumulando un secondo set di nanosonde sul primo. 5 aumentando il numero delle nanoparticelle in una determinata posizione su una superficie di sensore consente visual o acquisizione del segnale UV-vis. Tuttavia, la sensibilità del test sarà intrinsecamente collegata alla capacità di targeting del secondo set di nanoparticelle verso il set iniziale di nanosonde. Altre strategie si basano sulla macchiatura di nanosonde sia oro e argento. 6 , 7 la colorazione è ottenuta attraverso la riduzione degli ioni d'argento sulla superficie delle nanoparticelle, consentendo un visual o rilevazione UV-vis. 8 questi metodi che permettono di migliorare il segnale di esistenti d'oro o d'argento nanosonde rafforzando il plasmone di superficie risonanza del segnale, non a seconda di eventi secondari targeting come nei metodi di agglomerazione interparticella. Tuttavia, i metodi di colorazione argento sono stati segnalati solo con uso di nanosonde di oro o argento. 8 , 9
Nel 2005, Zayats et al. 10 segnalato la riduzione degli ioni Au sulla superficie dell'oro nanosonde per aumentare il segnale di risonanza plasmonica di superficie. In questo lavoro di enzima-dipendente, perossido di idrogeno è stato generato da catalisi di glucosio ossidasi e insieme cetiltrimetilammonio cloruro ha permesso la riduzione di acido cloroaurico.
Più recentemente Wang et al. ha riferito un metodo di valorizzazione dove si produce uno strato d'oro sulla superficie delle nanosonde esistente. 11 queste nanosonde allargate visualizzato perossidasi-come attività catalitica contro il substrato 3 ′, 5, 5 '-tetrametilbenzidina (TMB) che consente la visualizzazione di un colore blu brillante ad occhio nudo.
Stevens et al. ha segnalato lo sviluppo di un test ELISA plasmonico. 12 dopo il rilevamento di un antigene prostatico specifico (PSA) attraverso una tradizionale strategia di ELISA, un anticorpo secondario marcato con catalasi è stato incubato con il sensore dopo che il sensore è stato immerso in una soluzione contenente perossido di idrogeno e acido cloroaurico. La presenza di anticorpo secondario di catalasi-modificato (risultato positivo) sarebbe promuovere il consumo di acqua ossigenata, rallentando la riduzione di acido cloroaurico e producendo quasi sferico monodispersed AuNPs con un colore rosso. L'assenza dell'anticorpo catalasi-modificato (risultato negativo) ha permesso la concentrazione di perossido di idrogeno a rimanere intatto, favorendo così la riduzione rapida cloroaurico e producendo AuNPs con mal definite morfologie responsabile di un colore blu/viola . La concentrazione di perossido di idrogeno, determinato dall'attività della catalasi, è stata indicata per essere correlato alla concentrazione dell'analita di interesse. La necessità di un anticorpo secondario catalasi-modificato e il controllo delle condizioni dell'attività catalitica sono due fattori che ostacolano l'universalità di questo metodo. Inoltre, la formazione di raggruppamenti oro, indipendente di AuNPs esistente, può introdurre problemi di rumore di sfondo per la strategia di amplificazione.
Le tecniche sopra menzionate, come anche molti altri13,14,15, hanno reso possibile per biosensori basati su Nanosonda raggiungere limiti di rilevazione alla pari con tecniche tradizionali.
Qui, è dimostrato un metodo novello aumento dell'oro, dove il segnale di un Nanosonda esistente è amplificato dalla potenzianti o l'introduzione di un segnale di risonanza plasmonica di superficie. Dopo la rilevazione è effettuata con l'uso di oro, argento, quarzo o nanoparticelle di ossido di ferro, il sensore è lasciato incubare con una soluzione di una miscela di perossido di idrogeno e acido cloroaurico in 2-(N-morfolino) ethanesulfonic acido tampone a pH 6 (MES). Le concentrazioni dei componenti della soluzione di valorizzazione sono state ottimizzate per favorire la deposizione di Au0 sulla superficie delle nanosonde esistente. Tutti studiato Nanosonda tipi, vale a dire. AuNPs, nanoparticelle d'argento (AgNPs), nanoparticelle di silice (SiNPs) e IONPs, la formazione di uno strato mal definito ceduto o aumentata la dispersione della luce che ha provocato un segnale rilevabile o aumento visibile. Un aumento di segnale con un fattore di amplificazione 100 volte è stato raggiunto per nanosonde in carta e base di vetro microarrays e il processo richiede meno di 5 minuti per acquisire un segnale. L'acquisizione del segnale potrebbe essere fatto da occhio nudo, spettroscopia UV-vis o strumenti di fascia bassa come una fotocamera digitale o uno scanner da tavolo di imaging. Inoltre, è stato dimostrato che questo protocollo valorizzazione può essere applicato facilmente in un test diagnostico di allergia commercialmente disponibili senza la necessità di ottimizzazione specifica.

<table><tbody><tr><td>Acido cloroaurico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>254169 ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Citrato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4641 SIGMA-ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilaminoborano&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>476668 ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Poli (acido acrilico, sale sodico)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>416037 ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Nitrato d'argento</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>204390 ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>100 nm nanoparticelle magnetiche</td><td>Ademtech</td><td>021111</td><td></td></tr><tr><td>50 nm nanoparticelle di silice</td><td>Corposcular</td><td>140510-10</td><td></td></tr><tr><td>COOH-PEG-SH&nbsp;</td><td>Polimero RAPP</td><td>135000-4-32</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.06462&nbsp; EMD MILLIPORE</td><td></td></tr><tr><td>N-(3-Dimetilamminopropil)-N'-etilcarbodiimmide cloridrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03449&nbsp; SIGMA</td><td></td></tr><tr><td>N-idrossisulfosuccinimide sale sodico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56485&nbsp; ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di perossido di idrogeno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95313 SIGMA-ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-Morpholino)acido etansolfonico idrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250 SIGMA</td><td></td></tr><tr><td>IgG Anticorpo</td><td>Abcam</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodio fosfato&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342483&nbsp; ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653&nbsp; SIGMA-ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>VWR&nbsp;</td><td>422351S</td><td></td></tr><tr><td>Protein G</td><td>Thermo Scientific</td><td>21193</td><td></td></tr><tr><td>Membrana in carta nitrocellulosica</td><td>Whatman</td><td>10402096</td><td></td></tr><tr><td>Nanoplotter 2.1 stampante robotica</td><td>GeSIM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Portafiltro</td><td>Merck</td><td>XX3001200</td><td></td></tr><tr><td>PhD2000 Pompa ad ultrasuoni</td><td>Harvard</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scanner piano CannonScan 9000F Mark II</td><td>Cannon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-umano Anticorpi IgE modificati AuNPs&nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scansione laser LuxScan 10/K</td><td>Capital Bio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scanner da tavolo Scanner di immagini Epson Expression 1600 pro</td><td>Epson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vetrino ImmunoCAP ISAC sIgE 112</td><td>Thermofisher</td><td>81-1011-01</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo IgE umano coniugato fluorescente&nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>81-1011-01</td><td></td></tr><tr><td>Analizzatore di immagini Phadia Microarray MIA 1.2.4&nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

segnale nanosonda rapido aumento di sintesi di nanoparticelle di oro in situ

Rapid Nanoprobe Signal Enhancement by In Situ Gold Nanoparticle Synthesis

L'uso di nanosonde come oro, argento, silice o nanoparticelle di ossido di ferro come reagenti di rilevamento nei saggi bioanalitici può consentire ad alta sensibilità e comoda lettura colorimetrica. Tuttavia, alte densità di nanoparticelle sono in genere necessari per il rilevamento. I protocolli di potenziamento basato su sintesi disponibili sono entrambi limitati a oro e argento nanoparticelle o si basano su ottimizzazione e preciso controllo enzimatico. Qui, presentiamo un protocollo per migliorare la lettura colorimetrica di oro, argento, silice e ossido di ferro nanosonde. È stato osservato che il segnale colorimetrico può essere migliorato fino ad un 10000-fold fattore. La base per tali strategie di potenziamento del segnale è la riduzione chimica del Au3 + Au0. Ci sono parecchie reazioni chimiche che permettono la riduzione del Au3 + Au0. Nel protocollo, di buon buffer e H2O2 sono utilizzati ed è possibile favorire la deposizione di Au0 sulla superficie di nanosonde esistenti, a scapito della formazione di nuove nanoparticelle d'oro. Il protocollo comprende l'incubazione del microarray con una composto di acido cloroaurico e H2O2 in 2-(N-morfolino) di soluzione tampone a pH acido 6 etansolfonico seguendo il dosaggio di rilevamento basati su Nanosonda. La soluzione di valorizzazione può essere applicata alla carta e sensori basati su vetro. Inoltre, può essere utilizzato nei immunoassays commercialmente disponibili come dimostrato dall'applicazione del metodo ad un microarray di allergene commerciale. Lo sviluppo di segnale richiede meno di 5 minuti di incubazione con la soluzione di valorizzazione e la lettura può essere valutata dall'occhio nudo o periferiche di acquisizione immagini low-end come un tavolo scanner o una fotocamera digitale.

Dopo un test viene eseguito, utilizzando nanosonde come agenti di rilevamento, l'area di rilevamento del sensore può essere popolato con nanosonde (Figura 1a). Qualora il numero di nanosonde è inferiore al limite per un riconoscimento visivo, la rilevazione dell'analita, inizialmente, sarà negativa. Utilizzando il protocollo presentato qui (Figura 1b), il segnale delle nanosonde è rafforzato introducendo un mal definito livello di Au (Figura 1c).
Un immunodosaggio cartaceo per la rilevazione di proteine G è stato effettuato per mostrare l'efficacia del protocollo valorizzazione (Figura 2). AuNPs, AgNPs, SiNPs e IONPs sono stati modificati con gli anticorpi di IgG e utilizzati agenti di rilevamento. Carta microarrays sono stati preparati per quanto riguarda avere una sfumatura di un certo numero di molecole di proteina G per ogni posto.
Dopo l'analisi è stata effettuata, è stato osservato che IgG AuNPs modificate (IgG-AuNPs) erano in grado di rilevare più basso come 2 molecole di5 × 10 per il posto (Figura 2a), IgG modificate AgNPs (IgG-AgNPs) sono stati in grado di rilevare più basso come 2 × 104 molecole al posto (Figura 2c), IgG per volta IONPs (IgG-IONPs) sono stati in grado di rilevare in basso come 2 × 107 molecole per spot (Figura 2e) e IgG per volta SiNPs (IgG-SiNPs) non erano in grado di fornire un segnale visivo ( Figura 2g).
Incubando i microarray con la soluzione di potenziamento, è stato possibile aumentare il segnale di 100 volte in tutti i tipi di nanoparticelle utilizzate. Nel caso di SiNPs, la soluzione di valorizzazione ha permesso di osservare un segnale a cui è stato osservato nessun segnale visivo senza la soluzione di potenziamento (Figura 2b, 2d, 2f e 2h).
È stata valutata la possibilità di applicazione del metodo per un immunoassay commerciale esistente. Il miglioramento è stato effettuato su un immunoassay di microarray del componente base di vetro allergene. Un set di 4 convalidato e caratterizzato siero campioni da pazienti allergici sono stati valutati con il microarray (i campioni sono stati indicati come a, b, c e d). La rilevazione fluorometrica standard di questo test è stata confrontata alla macchiatura con anti-IgE etichettato AuNPs seguita dall'aumento del segnale (Figura 3). Prima del miglioramento, senza macchie sono state rilevate su microarray dove il rilevamento è stato effettuato con anti-IgE etichettato AuNPs. Dopo il miglioramento, diverse macchie erano visibili ad occhio nudo e la loro intensità è stata registrata dalla digitalizzazione immagine (Figura 3). Con la rilevazione della fluorescenza, una varietà di punti sono stati rilevati (Figura 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57297/57297fig1.jpg"> Figura 1 . Illustrazione dei passaggi un microspot subisce dal rilevamento di analita migliorata del segnale. (un) due per volta anticorpo nanosonde dopo il rilevamento di un analita immobilizzato su un microspot, (b) incubazione del microarray con il protocollo di potenziamento e seme-crescita successiva delle nanosonde anticorpo-modificato e ( c) microspot dove la dimensione delle nanosonde aumentata dopo incubazione di 5 min con la soluzione di valorizzazione. Questa figura è stata Rolli da Dias et al. 20 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57297/57297fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57297/57297fig2.jpg"> Figura 2 . Immagine digitalizzata di microarrays per la rivelazione della proteina G. A sinistra di ogni microarray sono il microspot osservati prima del miglioramento del rilevamento effettuato con (un) IgG-AuNPs, (c) IgG-AgNPs, (e) IgG-IONPs e (g), IgG-SiNPs. Sulla destra di ogni microarray sono il microspot dopo il miglioramento di (b) IgG-AuNPs, (d) IgG-AgNPS, (f) IgG-IONPs e (h) IgG-SiNPs. Ogni concentrazione di proteina G è stata depositata il microarray in triplice copia. Un calcolo del numero di proteine che g è stato fatto sulla base della concentrazione della proteina stampato in ogni microspot. Questa figura è stata adattata da Dias et al. 20 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57297/57297fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57297/57297fig3.jpg"> Figura 3 . Correlazione tra intensità di fluorescenza e colorimetrico intensità ottenuti per le analisi effettuate con il test diagnostico di allergia commerciali. Significa che l'intensità di fluorescenza (MFI) e significa intensità colorimetrica (MCI) misurato per la rilevazione di allergeni nei campioni a, b, c e d. inserti sono i dati di registro 10 trasformato negli intervalli dove è stata osservata una correlazione lineare tra entrambi i metodi. L'intensità di microspots osservato per il rilevamento basato sull'anticorpo fluorophore-modificato (fluoroforo-Ab) è l'emissione di fluorescenza. La luminosità di microspots osservato per il rilevamento basato su test Ab-AuNPs è stata ottenuta dopo la digitalizzazione del microarray e invertire l'immagine con software di imaging. I microarrays sono progettati da avere triplici copie verticale con controlli positivi per la rilevazione della fluorescenza in basso a destra. Gli altri tre angoli sono utilizzati per la valutazione del software. Immagini sono stati analizzati in 16-bit scala di grigi. Questa figura è stata adattata da Dias et al. 20 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57297/57297fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Valorizzazione preventiva di R2</td>
			<td>R2 dopo il miglioramento</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG-AuNPs</td>
			<td>8.70E-01</td>
			<td>7.80 E-01</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG-AgNPs</td>
			<td>9.10E-01</td>
			<td>9.60E-01</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG-IONPs</td>
			<td>9.17E-01</td>
			<td>9.30E-01</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG-SiNPs</td>
			<td>-</td>
			<td>8.50E-01</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1. R2 valori per il rilevamento della proteina G, prima e dopo il miglioramento, utilizzando diversi set di nanoparticelle. I valori di R2 sono stati ottenuti dopo che correla l'intensità delle macchie con la concentrazione di analita misurato.

In questo lavoro, un protocollo per il potenziamento del segnale di biosensori basati su Nanosonda è presentato. Il protocollo si basa sulla riduzione di acido cloroaurico sulla superficie di nanosonde esistenti costituiti da oro, argento, quarzo o nanoparticelle di ossido di ferro.

Segnale Nanosonda rapido aumento di sintesi di nanoparticelle di oro In Situ

The use of nanoprobes such as gold, silver, silica or iron-oxide nanoparticles as detection reagents in bioanalytical assays can enable high sensitivity ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di amplificare i segnali di sonde basate su nanoparticelle in saggi effettuati su supporti di carta o vetro. Utilizzando questo metodo, è possibile acquisire un segnale colorimetrico per punti che contengono solo 10 nanoparticelle. Il vantaggio principale di questa tecnica è la sua versatilità.Può essere applicato senza grandi modifiche a diverse nanoparticelle su carta, vetro e potenzialmente altri supporti. Per iniziare la procedura, preparare almeno 10 millilitri di una soluzione MES da 10 millimolari in acqua deionizzata. Regolare il pH della soluzione a sei con una soluzione di idrossido di sodio a quattro molari.Quindi, combinare un millilitro di una sospensione di 1,2 volte 10 al meno nono molare di nanoparticelle d'oro di 40 nanometri con un milligrammo di alfa mercapto omega carbossi PEG e vorticare la miscela. Regolare il pH della miscela a 12 con una soluzione di idrossido di sodio a quattro molari. Mescolare delicatamente il composto a temperatura ambiente per una notte.Quindi, centrifugare la miscela a 3, 800 volte G per 15 minuti e scartare il surnatante. Risospendere il pellet di nanoparticelle d'oro modificate con PEG in 500 microlitri di acqua deionizzata mediante pipettaggio delicato. Quindi, sciogliere cinque micromoli di EDC in 250 microlitri del tampone MES a pH sei da 10 millimolari.Sciogliere 7,5 micromoli di sulfo-NHS in altri 250 microlitri del tampone MES. Combina queste soluzioni con le nanoparticelle d'oro modificate con PEG e incuba a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Centrifugare la miscela per cinque minuti ed eliminare il surnatante.Risospendere il pellet in 500 microlitri di tampone MES. Aggiungere alla sospensione una quantità sufficiente di anticorpi IgG per una concentrazione di anticorpi di 100 picogrammi per millilitro. Incubare la miscela a 37 gradi Celsius per due ore.Centrifugare il composto per 10 minuti e rimuovere il surnatante. Risospendere il pellet in 500 microlitri di tampone MES e ripetere la centrifugazione. Quindi, risospendere il pellet in 500 microlitri di un tampone pH 7,5 di 10 millimolare di fosfato di sodio e 0,3 molari di cloruro di sodio in acqua deionizzata.Incubare la miscela a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Centrifugare la miscela per 10 minuti due volte, come descritto in precedenza. Risospendere il pellet in 500 microlitri di BSA all'1% in tampone MES a pH 10 millimolare, sei e incubare la miscela a quattro gradi Celsius per una notte.Centrifugare il composto per 10 minuti due volte. Infine, risospendere il pellet in 500 microlitri di tampone MES per ottenere le nanoparticelle d'oro modificate IgG. Utilizzare una stampante robotica per depositare microarray di un gradiente di concentrazione di proteina G su membrane di nitrocellulosa.Quindi, caricare un microarray in un portafiltro in acciaio inossidabile di dimensioni adeguate. Collegare una siringa contenente una sospensione di otto picomolari di nanoparticelle d'oro modificate con IgG all'ingresso del portafiltro. Montare la siringa su una pompa a siringa.Installare un tubo da 50 millilitri per raccogliere il flusso in uscita dal portafiltro. Quindi, far scorrere la sospensione attraverso il portafiltro a una millilitro al minuto. Successivamente, lasciare asciugare il microarray per 30 minuti a temperatura ambiente.Pulire e asciugare il portafiltro con acqua e carta da filtro. Scansiona il microarray secco in uno scanner piano a 4.800 DPI e salva l'immagine come file TIFF a colori a 24 bit. Successivamente, preparare sia una soluzione di acido cloroaurico da cinque millimolari che una soluzione di perossido di idrogeno da 1,027 molari in tampone MES a pH 10 millimolari.Per premiscelare la soluzione di potenziamento, porre valori uguali delle soluzioni di acido cloroaurico e perossido di idrogeno in una provetta da microcentrifuga e mescolare accuratamente le soluzioni. Applicare la soluzione di miglioramento premiscelata sulla superficie del sensore di microarray. In alternativa, applicare volumi uguali di acido cloroaurico e perossido di idrogeno sulla superficie del sensore e mescolarli accuratamente direttamente sul sensore.Incubare il sensore con la soluzione di potenziamento per un massimo di cinque minuti, quindi immergere il microarray in acqua deionizzata per cinque secondi per sciacquare via la soluzione di potenziamento. Lasciare asciugare il microarray all'aria a temperatura ambiente. Ripetere questo processo per ogni microarray da migliorare.Scansiona i microarray migliorati e salva le immagini. In un test immunologico standard basato su carta, le nanoparticelle di oro, argento e ossido di ferro modificate con IgG hanno rilevato concentrazioni di proteina G rispettivamente a due volte 10 al quinto, due volte 10 al quarto e due volte 10 al settimo per punto. Non è stato osservato alcun segnale visivo dalle nanoparticelle di silicio modificate con IgG.L'incubazione dei microarray in una soluzione di potenziamento ha portato a un aumento del segnale di 100 volte attraverso le nanoparticelle di oro, argento e ossido di ferro. Nel caso delle nanoparticelle di silicio, questo miglioramento ha permesso di osservare un segnale visivo. Questo miglioramento è stato applicato a un test immunologico commerciale su microarray di componenti allergeniche a base di vetro di quattro campioni di siero umano.La colorazione con nanoparticelle d'oro marcate con anti-IgE e il miglioramento del segnale hanno avuto risultati paragonabili al test fluorimetrico standard. La correlazione lineare media tra l'intensità media della fluorescenza e l'intensità colorimetrica media è stata di 0,79. Una volta appresa, questa tecnica può essere eseguita in meno di 10 minuti se eseguita correttamente.

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