Replica di ordinato, Nonredundant biblioteca del ceppo di Pseudomonas aeruginosa PA14 trasposone inserimento mutanti

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di generare copie di alta qualità della libreria di mutanti trasposoni ordinati e non ridondanti del ceppo PA14 di Pseudomonas aeruginosa, denominato set PA14NR. Questo protocollo preserva l'integrità del set PA14NR durante la replica, generando copie di alta qualità di questa libreria. Il vantaggio principale di questo protocollo è che fornisce una descrizione dettagliata di tutti i passaggi coinvolti nella replicazione della libreria, nel controllo di qualità e nella corretta conservazione dei singoli mutanti.

Sebbene questo protocollo sia stato progettato per replicare il set P14NR, può essere adattato per replicare altre librerie batteriche. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà a causa del rischio di contaminazione durante il processo di replicazione. Pertanto, questo protocollo fornisce istruzioni dettagliate per ridurre tale rischio.

Il nostro laboratorio distribuisce il set PA14NR alla comunità scientifica globale. E si consiglia che le librerie vengano replicate dall'utente finale. Per fornire indicazioni, offriamo un protocollo che descrive in dettaglio come generare copie di alta qualità della libreria.

La dimostrazione visiva di questo protocollo è fondamentale, in particolare i passaggi progettati per prevenire la contaminazione incrociata. Per l'autodifesa, così come per la protezione delle colture batteriche, è necessario indossare sempre un camice da laboratorio, guanti e una maschera quando si maneggia la libreria mutante di inserimento di trasposoni non ridondante del ceppo PA14 di P aeruginosa, designato set PA14NR. Preparare le piastre LB Agar versando circa 60 millilitri di agar LB fuso in piastre rettangolari.

Asciugare le piastre in una cappa sterile per circa un'ora prima dell'uso. Crea un campo sterile con un bruciatore bunsen su un banco di lavoro pulito con etanolo. E predisporre contenitori con soluzioni appropriate per la sterilizzazione dei perni del replicatore.

Rimuovi un masterplate PA14NR dal congelatore a meno 80 gradi Celsius e posizionalo su ghiaccio secco in una vaschetta del ghiaccio da 4 litri. Prelevare dal ghiaccio secco la piastra master a 96 pozzetti da replicare e posizionarla sul banco per consentire un breve scongelamento. Allineare la piastra master e la piastra di agar con la coordinata A1 di entrambe le piastre nell'angolo in alto a sinistra.

Segnare la posizione della coordinata A1 sulla piastra di agar rettangolare. Per sterilizzare i perni del replicatore, immergere i perni in 250 millilitri di ipoclorito di sodio allo 0,3-0,5% per 30 secondi. Battere leggermente il replicatore per rimuovere il liquido in eccesso e immergere gli spilli in 250 millilitri di acqua ultrapura sterile per 10 secondi, seguiti da 250 millilitri di etanolo al 70% per 30 secondi e 250 millilitri di etanolo al 95% per due minuti.

Fiamma Sterilizzare i perni del replicatore tenendo il replicatore perpendicolarmente alla fiamma del bruciatore bunsen, avvicinandosi lentamente alla fiamma fino a quando l'etanolo non si accende e poi ritirandolo immediatamente dalla fiamma. La fiamma si spegnerà una volta che tutto l'etanolo si sarà esaurito. Raffreddare i perni fissandoli su una piastra rettangolare inutilizzata contenente agar LB sterile per 30 secondi.

Mentre i perni del replicatore si stanno raffreddando, scaldare brevemente con la mano la guarnizione in alluminio della piastra master del set PA14NR, quindi staccarla con cura, assicurandosi che la guarnizione non tocchi la piastra. Usa una pinzetta per staccare eventuali resti del sigillo di alluminio. Inserire i perni del replicatore nella piastra master, spingendo e facendo oscillare delicatamente il replicatore in tutte e quattro le direzioni per assicurarsi che i perni entrino in contatto con le colture batteriche congelate in ciascuno dei 96 pozzetti.

Prestare particolare attenzione ai pozzetti situati nel bordo esterno della piastra spingendo i perni del replicatore contro le colture congelate nei pozzetti situati sul bordo della piastra. Posizionare delicatamente i perni del replicatore sulla superficie delle piastre di agar. Muovi il replicatore con un leggero movimento circolare per formare molti prati di circa quattro o cinque millimetri per ogni ceppo mutante.

Sigillare la piastra master PA14NR con un nuovo sigillo sterile in alluminio. Utilizzare un rullo per piastre per assicurarsi che ogni pozzetto e i bordi della piastra siano completamente sigillati. Rimettere la piastra principale a 96 pozzetti nel ghiaccio secco.

Dopo aver maneggiato il set PA14NR, pulire tutte le superfici di lavoro con etanolo al 70%. Trasferire la piastra di agar replicata in un'incubatrice a 37 gradi Celsius e incubare durante la notte. Prima di iniziare questa procedura, assicurarsi che la cappa a flusso laminare sia libera da apparecchiature non necessarie e accendere il ventilatore della cappa per un minimo di 10 minuti.

Pulire le superfici della cappa e tutti gli oggetti inseriti nella cappa utilizzando etanolo al 70%. Utilizzando una pipetta elettronica a 12 canali da 50 a 1200 microlitri, riempire ogni pozzetto di un blocco di pozzetti profondo 12 millilitri con 525 microlitri di brodo liquido LB contenente antibiotici appropriati. Quindi sigillare il blocco del pozzetto profondo prima di rimuoverlo dalla cappa a flusso laminare.

Quindi, trasferire il blocco di pozzetti profondi riempito di terreno su un banco di lavoro pulito con etanolo. Crea un campo sterile con un bruciatore bunsen sul banco di lavoro e allestisci contenitori con soluzioni appropriate per la sterilizzazione dei pin replicatori. Immergere i pin del replicatore in ciascuna soluzione come dimostrato in precedenza.

Sterilizzare a fiamma i pin del replicatore. Quindi raffreddare gli spilli fissandoli in una piastra rettangolare inutilizzata contenente agar LB per 30 secondi. Posizionare delicatamente i perni del replicatore sulla piastra di agar contenente ceppi mutanti cresciuti e controllare che i perni siano a contatto con tutti i 96 mutanti sulla piastra di agar.

Quindi immergere i perni nei pozzetti profondi contenenti brodo liquido LB per cinque-10 secondi. Evitare di toccare i lati dei pozzetti con i perni. Sigillare il blocco del pozzetto profondo con una membrana sigillante sterile e traspirante.

Utilizzare un rullo a piastre per assicurarsi che ogni singolo pozzetto sia sigillato correttamente. Pulire tutte le superfici di lavoro con etanolo al 70% dopo aver maneggiato il set PA14NR. Coltiva le colture liquide inoculate in un agitatore ad alta velocità a 37 gradi Celsius e 950 giri/min per 15-16 ore.

Iniziare svuotando la cappa a flusso laminare e accendendo il soffiatore della cappa per un minimo di 10 minuti. Pulisci tutte le superfici della cappa e tutti gli oggetti inseriti nella cappa con etanolo al 70%. Rimuovere le piastre a 96 pozzetti dall'involucro di plastica.

Staccare l'etichetta della piastra per ogni piastra e posizionarla lungo il bordo della piastra più vicino ai pozzetti da A1 a H1 della piastra di destinazione. Sollevare leggermente il coperchio della targhetta di destinazione e posizionare l'etichetta sul bordo inferiore per visualizzare l'etichetta quando la targhetta è coperta da un coperchio. Rimuovere il blocco del pozzetto profondo dall'agitatore ad alta velocità e trasferire il blocco nella cappa a flusso laminare sterile.

Rimuovere con cautela la membrana di tenuta traspirante e sostituirla con una guarnizione in alluminio. Centrifugare il blocco del pozzo profondo a velocità molto bassa per raccogliere la condensa. Poiché il trasferimento delle colture alle piastre di destinazione presenta il rischio maggiore di potenziale contaminazione tra i pozzetti, è fondamentale seguire attentamente tutte le procedure per mantenere la sterilità.

Riposizionare il blocco del pozzetto profondo nella cappa sterile. Utilizzando una pipetta elettronica a 12 canali da 50 a 1200 microlitri e puntali filtrati sterili, aggiungere 525 microlitri di miscela di brodo liquido glicerolo LB in ciascun pozzetto. Miscelare pipettando delicatamente 300 microlitri su e giù tre volte con una pipetta elettronica.

Toccare le punte sul lato dei pozzetti, prima di iniettare le punte per evitare che gocciolino. Ricaricare la pipetta con i nuovi puntali filtrati sterili e riempire la fila successiva di pozzetti con la miscela di brodo liquido glicerolo LB. Dopo che tutti i pozzetti sono stati riempiti con la miscela di brodo liquido glicerolo LB, utilizzare la pipetta elettronica a 12 canali e i puntali filtrati per estrarre 900 microlitri di miscela di coltura mutante di glicerolo da ciascuna fila del blocco di pozzetti profondi ed erogare 150 microlitri nei pozzetti della fila corrispondente nelle piastre di destinazione per generare sei copie della piastra della libreria.

Utilizzare il sigillo sterile in alluminio per coprire ciascuna piastra di destinazione a 96 pozzetti e utilizzare un rullo per piastre per sigillare completamente i bordi della piastra e tutti i pozzetti. Assicurarsi di non coprire l'identificatore dell'etichetta con il sigillo di alluminio. Rimuovere le piastre sigillate dalla cappa e posizionarle su una superficie piana e uniforme in un congelatore a meno 80 gradi Celsius.

Pulire tutte le superfici di lavoro con etanolo al 70% dopo aver maneggiato la libreria. Utilizzando il protocollo dimostrato in questo video, sono state replicate 12 copie del set PA14NR, comprese le piastre di controllo, che consistono in pozzetti inoculati e non inoculati in PA14 del tipo a pozzetto intercalati in un modello preimpostato. Le piastre di controllo sono state ispezionate visivamente dopo la replicazione su piastre di agar LB per garantire la presenza dei modelli di crescita previsti.

38 ceppi mutanti sono stati selezionati casualmente da una delle copie appena generate del set PA14NR ed è stata eseguita un'amplificazione PCR utilizzando primer arbitrari per confermare l'identità dei mutanti del trasposone. Il successivo sequenziamento dei frammenti di DNA ha confermato l'identità mutante di 35 dei 38 mutanti testati. Una volta masterizzata, la replica dell'intera libreria richiede circa 80 ore.

Durante l'utilizzo di questo protocollo, è importante prestare attenzione alla sterilità dell'area di lavoro in ogni momento. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare copie di alta qualità del set P14NR o di altre librerie batteriche. Non dimenticare che lavorare con Pseudomonas può essere pericoloso e che i dispositivi di protezione individuale devono essere sempre indossati durante l'esecuzione di questo protocollo.

Questo protocollo preserva la libreria di mutanti non ridondanti PA14 di Pseudomonas aeruginosa che continua ad essere una risorsa importante, non solo per lo screening ad alto rendimento, ma anche come fonte di mutazioni individuali nella maggior parte dei geni di Pseudomonas aeruginosa.