Name: Un modello murino Syngeneic Orthotopic bioluminescenti e fluorescente di carcinoma della prostata androgeno-dipendente e castrazione-resistente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Scopri come creare un modello murino ortotopico sinigeneico di carcinoma prostatico androgeno-dipendente e resistente alla castrazione mediante iniezione intra-prostatica. Questa tecnica consente di studiare lo sviluppo tumorale e le risposte terapeutiche in un microambiente clinicamente rilevante.

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Questo lavoro è stato sostenuto dagli istituti nazionali di sovvenzioni salute Praveen Thumbikat (NIDDK R01 DK094898), Antonio Ugo (NCI R01 CA167966, NCI R01 CA123484, NCI P50 CA180995) e Jonathan Anker (NCI F30 CA203472).

Tutte le procedure degli animali descritte in questo protocollo devono essere eseguite nel rispetto delle norme etiche e l'approvazione dell'Università appropriato istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC).
1. preparazione dei materiali chirurgici e le cellule tumorali
<ol><li>Prima il giorno della chirurgia, autoclave le forbici micro-dissezione, Graefe pinze, pinze di Graefe, porta-aghi con frese di sutura e il numero appropriato di tende. Sterilizzare una siringa di 50 µ l e gli aghi di calibro 28 ossido di etilene (Figura 1).</li>
	<li>Prima il giorno dell'intervento, le cellule di Myc-CaP di cultura in piatti di 10cm in RPMI completato con 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% di penicillina/streptomicina (P/S) in un incubatore a 37 ° C 5% CO2 . Per il monitoraggio del tumore bioluminescente e/o fluorescente, transfect 293T cellule con i vettori appropriati e successivamente trasdurre cellule Myc-CaP con 0,45 µm filtrata lentivirus31. Ordinare le cellule per generare una linea cellulare stabile con positività di trasduzione di 100%. Nota: Eseguire tutta la cultura del tessuto in condizioni sterili e verificare che tutte le linee cellulari siano esenti da micoplasma. La linea cellulare di carcinoma della prostata murino utilizzata in questo studio, Myc-CaP32, viene trasformata per esprimere stabilmente sia luciferasi firefly e mCherry. L'iss di linea cellulare Myc-CaP isolata da un c-myc-overesprimenti Hi-myc mouse e queste cellule contengono un ricevitore amplificato androgeno (AR), che sono androgeno-dipendenti32 e formano i tumori CRPC dopo castrazione murino33. Tutti i topi in questo studio sono topi FVB/NJ maschi 6-8 settimana di vita. Linee cellulari murine alternative del cancro della prostata possono essere utilizzati con i topi di appropriato background genetico, così come linee cellulari umane del cancro della prostata o cellule tumorali della prostata derivate dal paziente primario con topi immunodeficienti. Il numero di cellule per iniezione ottimale dovrebbe essere determinato empiricamente per linee cellulari alternativi. Inoltre, alternativa modalità di formazione immagine possa essere utilizzata per visualizzare i tumori, tra cui la formazione immagine a risonanza magnetica (MRI), tomografia a emissione di positroni (PET) o la tomografia computata (CT), così come GFP come alternativa a mCherry.</li>
	<li>La notte prima dell'intervento chirurgico, posto matrice della membrana basale di matrigel e privo di rosso fenolo in ghiaccio a 4 ° C per lo scongelamento.</li>
	<li>Il giorno dell'intervento, è necessario raccogliere le cellule mediante lavaggio con tamponato fosfato salino (PBS) e la disconnessione con 0,25% tripsina-EDTA. Neutralizzare la tripsina con RPMI con 10% FBS e 1% P/S.</li>
	<li>Centrifugare le cellule a 400 x g per 5 min.</li>
	<li>Lavare le cellule con 10 mL di RPMI senza FBS o P/S.</li>
	<li>Contare le celle e risospendere le cellule in PBS ad una concentrazione di 6.67x107 cellule/mL (1 × 106 15 cellule / µ l).</li>
	<li>Aggiungere un volume equivalente di matrigel per creare una sospensione di cellule di PBS/matrigel 1:1 ad una concentrazione finale di 1 × 106 cellule/30 µ l e mantenere le cellule su ghiaccio fino ad iniezione per evitare la solidificazione. Nota: Eseguire iniezioni intra-prostatico all'interno di 3 h di preparare matrigel sospensioni cellulari. Se eseguendo iniezioni intra-prostatico su più di 5 topi, ripetere i passaggi precedenti per preparare una sospensione di cellule fresche matrigel.</li>
</ol>2. preparazione del mouse pre-operatoria
Nota: Casa topi nella Università animale struttura per almeno una settimana prima dell'intervento chirurgico per consentire adeguato adattamento e per ridurre al minimo lo stress degli animali. Passi 2.1-2.6 sono eseguite dall'assistente chirurgo. Tutte le successive fasi chirurgiche vengono eseguite dal chirurgo utilizzando guanti sterili e strumenti chirurgici con tecnica sterile.
<ol><li>Anestetizzare i topi con isoflurano (2-5% per induzione tramite camera, 1-3% per la manutenzione tramite cono di naso). Verificare induzione completa dalla perdita del riflesso di pizzico di punta.</li>
	<li>Pesare i topi e amministrare almeno 0,05 mg/kg della buprenorfina analgesica s.c. Nota: Mouse peso ≥ 20 g è ideale per successo iniezioni intra-prostatico.</li>
	<li>Applicare lubrificazione unguento oftalmico a entrambi gli occhi per prevenire la secchezza della cornea.</li>
	<li>Radere tutto il pelo dall'addome.</li>
	<li>Sterilizzare l'addome da tre turni di circolare applicazione di scrub chirurgico utilizzando sterile pastiglie non aderenti, seguite da salviettine imbevute di alcool sterile. Consentire l'addome asciugare. Nota: Per il resto della procedura chirurgica, solo guanti sterili e strumenti chirurgici possono contattare l'addome del mouse sterilizzato.</li>
	<li>Trasferire il mouse Supino su una superficie pulita su un rilievo di riscaldamento direttamente sotto l'obiettivo di un microscopio operatorio pulito.</li>
	<li>Coprire il mouse con un telino sterile con un piccolo foro tagliato sopra l'addome.</li>
</ol>3. Intra-prostatico iniezione
Nota: Eseguire tutti i passaggi chirurgici in condizioni di sterilità. Regolazione del microscopio, il posizionamento del mouse o qualsiasi altri oggetti non sterili devono essere fatto dall'assistente chirurgo.
<ol><li>Eseguire un circa incisione di 1 cm della pelle esterna lungo la linea mediana dell'addome superiore al pene e le ghiandole prepuziali (Figura 1).</li>
	<li>Separare il tessuto connettivo tra la pelle esterna dell'addome e la muscolatura addominale interna aprendo la forbice tra gli strati.</li>
	<li>Eseguire un'incisione simile della muscolatura addominale interna durante l'utilizzo di pinze per aumentare la muscolatura per evitare la foratura del intestino o della vescica (Figura 1).</li>
	<li>Individuare una delle vescicole seminali bilaterale (Figura 1A, bianco) / lobi della prostata anteriori (Figura 1A, nero), che sono spesso posteriore, laterale e leggermente superiore alla vescica (Figura 1A, giallo), ma questo possono variare tra topi . I lobi della prostata anteriori sono collegati alla poca curvatura delle vescicole seminali bianchi e traslucido.</li>
	<li>Sollevare delicatamente la punta della vescichetta seminale utilizzando le pinze Graefe per creare tensione sul tessuto senza perforare la vescicola seminale (Figura 1E).</li>
	<li>Miscelare la soluzione di matrigel Myc-CaP pipettando gentile (eseguite dall'assistente chirurgo), come le cellule possono avere pellettati e aspirare lentamente 30 µ l (1 x 106 cellule) nell'ago per evitare bolle d'aria.</li>
	<li>Inserire con cautela la smussatura del parallelo all'asse longitudinale del lobo anteriore della prostata dell'ago. Iniettare lentamente 30 µ l nel lobo e ritirare lentamente l'ago per evitare perdite (Figura 1F). Verificare un'adeguata iniezione di ingorgo del lobo anteriore della prostata (Figura 1).</li>
	<li>Tenere attentamente la vescichetta seminale e lobo della prostata iniettato fuori il mouse per circa 30 s per consentire matrigel parzialmente solidificare all'interno del lobo. Durante questo tempo, raccogliere eventuali perdite di soluzione delle cellule nell'addome utilizzando una punta applicatore sterile in poliestere per prevenire lo sviluppo del tumore non-ortotopico, senza premere sul lobo della prostata iniettato.</li>
	<li>Tornare attentamente la vescichetta seminale e lobo della prostata iniettato nell'addome senza esercitare pressioni sul lobo. Sostituire eventuali tessuti esternalizzati.</li>
	<li>Eseguire suture continue per chiudere la muscolatura addominale interna con punti di sutura di 5-0 vicryl riassorbibile taglio inverso dell'ago.</li>
	<li>Eseguire suture interrotte per chiudere la pelle addominale esterna con suture 4-0 in nylon monofilamento non assorbibile taglio inverso dell'ago. Nota: Staples sterilizzata 9 mm utilizzabile anche per chiudere la pelle addominale esterna. Tuttavia, in contrasto con suture, interferiscono con eventuali successivo tumore bioluminescente e fluorescente imaging segnale.</li>
	<li>Pulire tutti gli strumenti con salviettine di etanolo sterile (aperti dall'assistente chirurgo) e metterli in uno sterilizzatore del branello di vetro per 30 s. Consenti gli strumenti per asciugare prima dell'uso del mouse successiva.</li>
	<li>Lavare la siringa e l'ago in soluzione fisiologica sterile (aperto dall'assistente chirurgo) per evitare intasamenti di residuo matrigel. Nota: Un assistente chirurgo deve essere presente per tutte le operazioni, in esecuzione di preparazione pre-operatoria del mouse tutti i non-sterili e cura post-operatoria del mouse, anche per miscelare la soluzione di matrigel Myc-CaP prima iniezioni. Per minimizzare il tempo, come ogni procedura intra-prostatico mouse richiederà 20-30 min, l'assistente chirurgo può iniziare preparando il prossima mouse come il chirurgo è suturare il mouse corrente.</li>
</ol>4. cura del Mouse post-operatorio
<ol><li>Somministrare 1 mg/kg di meloxicam analgesico s.c. immediatamente, h 24 e 48 h dopo la chirurgia.</li>
	<li>Consentire topi recuperare in una gabbia con alcuna biancheria da letto posizionato a metà strada su un rilievo di riscaldamento. Monitorare topi per almeno 30 min dopo l'intervento fino a quando non riacquistano mobilità normale e l'attività, dopo che metterli in una gabbia pulita con cibo sul pavimento della gabbia.</li>
	<li>Controllare topi al giorno per corretta cicatrizzazione, peso corporeo, toelettatura e deambulazione dopo la chirurgia. Topi separati in gabbie individuali al momento alcuna prova di combattimento.</li>
	<li>Rimuovere eventuali suture rimanenti entro 14 giorni dopo l'intervento chirurgico.</li>
</ol>5. bioluminescenti tumore Imaging
<ol><li>Preparare sterile filtrata Na+ o K+ D-luciferina, come spiegato dal produttore e protetto dalla luce.</li>
	<li>Iniettare topi intra-peritoneally con 10 µ l/g del peso corporeo di luciferina.</li>
	<li>Almeno 10 minuti più tardi, topi di immagine con un sistema di Imaging spettro di IVIS, come precedentemente descritto34,35.</li>
	<li>Analizzare le immagini utilizzando Living Image Software, come descritto in precedenza34,35. Nota: IVIS analisi di imaging è utile per determinare il successo iniezioni intra-prostatico e lo sviluppo iniziale del tumore per normalizzare il carico del tumore fra gruppi sperimentali. Tuttavia, a seconda dell'intensità del segnale fluorescente o bioluminescente, saturazione può causare un altopiano nella quantificazione immagine nonostante un aumento di dimensioni del tumore effettivo. Pertanto, nelle fasi successive di crescita del tumore, IVIS formazione immagine può essere più utile per determinare diminuisce nelle dimensioni del tumore, previo trattamento di successo piuttosto che aumenta di dimensioni dopo la saturazione immagine.</li>
</ol>6. tumore raccolta, l'analisi del tumore, sopravvivenza Endpoint
<ol><li>Se raccolta del tumore per l'analisi, umanamente eutanasia topi di CO2 esposizione e dislocazione cervicale secondaria, o con metodi alternativi di IACUC approvato e sezionare i tumori dall'addome. I tumori dovrebbero essere orthotopically situato presso la prostata. Nota: Tumori attaccato alla parete addominale anteriore o seminato durante l'addome indicano iniezione intra-prostatico povero o che perde e non devono essere considerati i tumori ortotopico.</li>
	<li>Pesare i tumori.</li>
	<li>Calcolare il volume del tumore come π/6 × L × W × H (L = lunghezza dell'asse più lungo del tumore, W = Larghezza perpendicolare, H = altezza perpendicolare).</li>
	<li>I tumori possono essere analizzati dall'istologia (correzione in formalina neutra tamponata 10%), citometria a flusso (creare sospensioni singola cella), proteine (preparare il tessuto lisato nel buffer di RIPA), o RNA (immediatamente posto tessuto in RNAlater).</li>
	<li>Per analisi immunologica, anche raccogliere della prostata tumore-drenante para-aortica i linfonodi (Figura 1B, arancione) e la milza. Nota: Se in seguito topi per la sopravvivenza, l'endpoint di questo modello è definito come la comparsa di ascite addominale emorragica36 e/o diminuito deambulazione, governare e/o piloerezione37. Topi per analisi di sopravvivenza ricevano pre- e post-operatoria analgesia (passaggi di protocollo 2.2, 4.1) e devono essere monitorati regolarmente. Topi dovrebbero essere separati in gabbie individuali se qualsiasi combattimento si verifica e dovrebbe essere euthanized umanamente all'apparizione di una qualsiasi delle letture di endpoint sopra.</li>
</ol>7. chirurgica castrazione per modellare CRPC
<ol><li>Per modellare CRPC, eseguire quanto sopra protocollo iniezione intra-prostatica (passaggi 1-5 del protocollo).</li>
	<li>Almeno una settimana più tardi, dopo lo sviluppo del tumore, eseguire castrazione chirurgica tramite cauterizzazione, come descritto in precedenza38.</li>
	<li>Monitorare la regressione del tumore e ricorrenza da formazione immagine bioluminescente. Dopo la castrazione, la regressione del tumore si verificherà entro 3 giorni e la ricorrenza del tumore si verificherà entro circa 30 giorni, che rappresentano CRPC.</li>
</ol>

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

In questo manoscritto, delineiamo il protocollo per eseguire iniezioni di cellule di cancro chirurgica intra-prostatico. Abbiamo utilizzato l'androgeno-dipendente e MYC -overexpressing (MYC sovraespressione è visto fino a 80-90% di carcinoma della prostata umane39) linea di cellulare murina del carcinoma della prostata, Myc-CaP, originariamente isolata dal mouse Hi-Myc32 ,33. Questa linea cellulare stabile era transduced per esprimere sia luciferasi e mCherry, per non invasiva in vivo imaging tumorale bioluminescenti e fluorescenti, rispettivamente. Castrazione chirurgica, ulteriore è stata eseguita anche dopo lo sviluppo del tumore androgeno-dipendente, che conduce a regressione del tumore e la ricorrenza successiva. Pertanto, le forniamo dettagli per modellare CRPC sia di carcinoma della prostata androgeno-dipendente di orthotopic in un ospite immunocompetent.
Le cellule Myc-CaP iniettate nel lobo anteriore della prostata dei topi. La prostata del topo è costituito dai lobi della prostata anteriori, ventrali e dorsolateral e prostata umana è costituito da una zona periferica, zona di transizione e zona centrale all'interno di un singolo lobo40. Mentre studi precedenti hanno paragonato il lobo dorsolateral del mouse per il periferico umano anatomicamente ed istologicamente di zona, il sito della maggior parte dei cancri della prostata41ed il lobo anteriore del mouse alla zona centrale umano42, 43, più recente e completa analisi ha dimostrato che il lobo anteriore e lobo dorsolateral visualizzare pattern di espressione genica strettamente correlati, rispetto il lobo ventrale. 44 inoltre, lo sviluppo del cancro della prostata è stato osservato nel lobo anteriore di gemme40, e, per la procedura intra-prostatico, lobo anteriore permette l'iniezione del volume necessario di soluzione di cellule di cancro con perdita minima e variabilità.
Utilizzando s.c. e transgenici GEM cancro modelli hanno più difetti e limitazioni. S.c. tumori coltivati in un artificiale TME hanno risposte differenziali a chemioterapie, in contrasto con entrambi i tumori orthotopic dalle stesse linee cellulari di malattia umana20,21,22. Questo può essere dovuto il sistema vascolare alterato dei tumori s.c., come esemplificato dalla loro risposta differenziale a terapia anti-angiogenica18,19. Al contrario, i tumori orthotopic sviluppano con un'adeguata TME, linfonodi drenanti e sistema vascolare e possono essere eseguiti con linee murine, consentendo quindi anche per l'analisi dell'immunologia dei tumori e risposta immunoterapie.
Transgenici gemme sviluppano i tumori con un'adeguata TME in un ospite immunocompetent, eppure questi modelli in genere semplificare eccessivamente tumorali umane attraverso lo sviluppo di tumori con singola o poche alterazioni genetiche29. Un'analisi di Myc-CaP e altre linee cellulari di carcinoma della prostata ha rivelato che contenevano molto maggiore somatico copia numeri modifiche e alterazioni cromosomiche che i tumori dai topi Hi-Myc ed altre gemme da cui erano derivate29. Ulteriormente, gemme sono limitati dall'aumento dei costi e tempi necessari per topi allevamento per eseguire esperimenti di potenza sufficiente. Modellazione di orthotopic del tumore può superare questi limiti. Linee cellulari di carcinoma della prostata umane e murine contengono molte alterazioni genetiche pertinenti alla malattia umana29e, come il cancro umano, mostrano anche la grande eterogeneità tra le singole celle30. Orthotopic murino syngeneic tumori per analisi immunologiche, mentre orthotopic tumori umani xenogenici consentono per le analisi di terapeutica sulle cellule umane. Infine, a differenza con gemme, cella linee possono essere modificati prima di iniezione, che permette per l'espressione di bioluminescenti o imaging molecole fluorescenti per monitorare la crescita del tumore, normalizza il carico del tumore fra gruppi sperimentali, monitorare la risposta al trattamento e alla seguire la regressione del tumore e la ricorrenza di CRPC dopo castrazione chirurgica.
Punti critici in questo protocollo sono individuazione e trasportarli vescichetta seminale e annesso lobo anteriore della prostata senza danneggiare altri tessuti o perforare la vescichetta seminale, eseguendo un'iniezione intra-prostatico successo il 30 µ l di cella sospensione senza perdite e raccogliendo correttamente eventuali perdite per prevenire lo sviluppo di tumore non-orthotopic in tutto l'addome. La limitazione principale di iniezioni intra-prostatico è raggiungere l'abilità tecnica necessaria per ridurre al minimo la variabilità di tumore tra i topi. Ciò è particolarmente importante per la modellazione CRPC, che ha aggiunto la variabile della castrazione chirurgica. Topi intra-prostatically iniettati e castrati devono anche essere seguiti attentamente per il recupero e gli eventi avversi, come hanno subito due interventi chirurgici principali sopravvivenza. Un'altra limitazione è la volta di ogni iniezione intra-prostatico. Questo può essere ridotto al minimo di 20 min, e il chirurgo assistente può preparare il prossima mouse come il mouse corrente è essere suturato. Infine, i tumori orthotopic Myc-CaP sono aggressivi, massa velocemente crescente tumori che raggiungono l'endpoint di sopravvivenza in circa 46 giorni (e più presto 35 giorni) dovuto il tumore primario. Gli studi che richiedono trattamenti a lungo termine o rallentare lo sviluppo del tumore dovrebbero essere ottimizzati empiricamente per il regime di conteggio e trattamento delle cellule di iniezione iniziale. In contrasto con le limitazioni dei tumori s.c. e gemme, tutte le limitazioni di cui sopra del modello ortotopico del tumore possono essere superate, e ulteriori modifiche del protocollo possono essere fatta base sulle esigenze individuali, sperimentale.
Come il trapianto orthotopic del modello del tumore prevede l'utilizzo di in vitro-gestite, queste cellule possono essere modificate a seconda delle esigenze dello studio. Qui, abbiamo modificato queste cellule per esprimere stabilmente la luciferasi e mCherry per il monitoraggio di tumore in vivo . Abbiamo anche eseguito un ko CRISPR-Cas9 del soppressore del tumore PTEN, per generare una linea cellulare più aggressivo, clinicamente rilevanti che cresce più velocemente come tumori orthotopic (manoscritto nella recensione). Con i vantaggi del modello ortotopico del tumore, la capacità di studiare sia carcinoma della prostata androgeno-dipendente e CRPC ed il potenziale per esprimere modalità di imaging o atterramento o iperesprimere geni select, questo protocollo serve come una risorsa preziosa per tutti ricerca sul cancro della prostata.

Carcinoma della prostata è stimato a hanno la più alta incidenza (161.360 uomini) e causare la morte di cancro maschile terzo-più (84.590 uomini) nel 20171. Dopo una diagnosi, i tumori della prostata sono androgeno-dipendente e sono trattati da prostatectomia chirurgica, la radioterapia e/o terapia di deprivazione androgenica (ADT), eppure ogni trattamento è associato con le morbosità e le complicazioni principali più2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. nonostante la regressione del tumore dopo ADT, quasi tutti i tumori si ripetono come il cancro della prostata resistente alla castrazione (CRPC). In questa fase, terapie approvate includono docetaxel, immunoterapia di Sipuleucel-T e le piccole molecole anti-androgeni enzalutamide e abiraterone, ancora nessuna terapia individuale conferisce un beneficio di sopravvivenza di più di 5,2 mesi11, 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17. Pertanto, gli uomini in tutte le fasi di carcinoma della prostata hanno bisogno gestione di morbidità, per quale malattia pre-clinico ottima modellazione è cruciale e opzioni di trattamento migliore.
Con procedura corretta, linee cellulari di carcinoma della prostata possono essere chirurgicamente instillati nella prostata murina, portando allo sviluppo di entrambi i tumori syngeneic o xenogeniche ortotopico. Modellazione di orthotopic del tumore è ideale per tutti i tumore biologia e droga sviluppo ricerca, permettendo per lo sviluppo del tumore con un microambiente tumorale clinicamente rappresentative (TME). Studi precedenti hanno dimostrato che i tumori sottocutanei (s.c.) hanno un sistema vascolare alterata del tumore, che conduce al differenziale e meno risposte clinicamente accurate a terapie anti-angiogeniche18,19. Inoltre, gli studi multipli hanno osservato l'efficacia aumentata o diminuita di più chemioterapici nel trattamento della stessa linea cellulare, a seconda se fosse somministrato s.c. o orthotopically, l'ultimo dei quali rappresentato al meglio ciò che si vede nell'uomo cancro20,21,22. Inoltre, solo in un modello ortotopico di cancro del colon, ma non nel modello s.c., ha fatto i tumori producono il corretti enzimi degradativi necessari per indurre metastasi23. Infine, come immunoterapie continuano ad emergere all'avanguardia nella terapia del cancro, e soprattutto come essi devono ancora fornire benefici significativi per carcinoma della prostata24,25, syngeneic modelli pre-clinici con TME accurata e linfonodi drenanti in ospiti immunocompetent sono critici.
Ci sono molti fattori responsabili per questi risultati contradditori basati su sito del tumore. Con una diversa TME, le cellule tumorali sono esposti a diverso tessuto-specifici dell'endotelio e alterata angiogenesi, interessando così tumore sviluppo26,27. Orthotopic tumori con la TME corretto consentono per consegna farmaco clinicamente rilevanti, condizioni di ipossia e la valutazione di terapie anti-angiogeniche28. Mentre modelli geneticamente (gemme) contengono un'accurata TME, richiedono lunghi tempi per allevamento, costo elevato e sono spesso basato sulle manipolazioni dei geni singoli o pochi eliminato o iperespresso oltre i livelli clinicamente rilevanti. Al contrario, le linee cellulari di carcinoma della prostata umana o murina utilizzate nei tumori di orthotopic, come tumori umani, sono geneticamente molto più complesse, sia all'interno delle singole cellule e nella visualizzazione delle eterogeneità tra cellule29,30. Inoltre a differenza di gemme, linee cellulari di orthotopic del cancro possono essere ingegnerizzate ad per esprimere modalità di imaging o aumentati o diminuzione dei livelli di altre molecole di interesse e in vitro e in vivo risultati sperimentali possono essere confrontati direttamente. Orthotopic tumori possono anche essere formati da cellule primarie derivate dal paziente. Qui, segnaliamo la metodologia per l'esecuzione di iniezioni intra-prostatica delle cellule di carcinoma della prostata che formano i tumori androgeno-dipendente di orthotopic e, dopo la castrazione, ricorrono come orthotopic del CRPC.

<table><tbody><tr><td>Linea cellulare Myc-CaP</td><td>ATCC</td><td>CRL-3255</td><td>Verificare che sia privo di micoplasma prima dell'uso</td></tr><tr><td>Forbici per micro-dissezione</td><td>Roboz</td><td>RS-5910</td><td></td></tr><tr><td>Pinza Graege</td><td>Roboz</td><td>RS-5135</td><td></td></tr><tr><td>Pinza per tessuti Graefe</td><td>Roboz</td><td>RS-5150</td><td></td></tr><tr><td>Portaago Olsen-Hegar con taglierine</td><td>FST</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>50 &micro; L Siringa 705 RN SYR</td><td>Hamilton</td><td>7637-01</td><td>Sterilizzare con gas di ossido di etilene</td></tr><tr><td>Aghi calibro 28 Piccolo mozzo RN</td><td>Hamilton</td><td>7803-02</td><td>Punto stile 4, Angolo 45 gradi, Lunghezza 0,75 pollici. Sterilizzato con gas di ossido di etilene</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>18875-093</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Pencillin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>0,25% tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Matrice a membrana basale Matrigel, senza rosso fenolo, senza LDEV</td><td>Corning</td><td>356237</td><td>scongelare sul ghiaccio in 4 gradi C durante la notte prima dell'uso</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Henry Schein</td><td>11695-0500-2</td><td>Acquisito dal Northwestern University Center for Comparative Medicine (CCM)</td></tr><tr><td>26 Siringa calibro 5/8</td><td>BD</td><td>309597</td><td>Per iniezioni di meloxicam e buprenorfina Buprenorfina</td></tr><tr><td>irocloruro 0,3 mg/mL</td><td></td><td>12496-0757-5</td><td>Sostanza controllata, acquisita dalla Northwestern University CCM</td></tr><tr><td>Ophthalmic unguento lubrificante</td><td>Akron</td><td>17478-162-35</td><td></td></tr><tr><td>Scrub chirurgico Betadine (povidone-iodio, 7,5%)</td><td>Purdue Products</td><td>67618-151-16</td><td></td></tr><tr><td>Tamponi sterili non aderenti</td><td>Moore Medical</td><td>10775</td><td></td></tr><tr><td>Salviette sterili imbevute di alcol</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-750</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio operatorio Stemi DV4</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Applicatori sterili con punta in poliestere</td><td>Puritan</td><td>25-806 1PD</td><td></td></tr><tr><td>5-0 vicryl assorbente ad ago da taglio inverso suture</td><td>eSuture</td><td>J493G</td><td></td></tr><tr><td>4-0 nylon monfilament non assorbibile ad ago da taglio inverso suture</td><td>eSuture</td><td>699H</td><td></td></tr><tr><td>Sterilizzatore a perle di vetro</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina sterile 0,9% cloruro di sodio</td><td>Hospira</td><td>0409-4888-02</td><td></td></tr><tr><td>Meloxicam (Eloxiject) 5 mg/mL</td><td>Henry Schein</td><td>11695-6925-1</td><td>Acquisito dalla Northwestern University CCM</td></tr><tr><td>D-luciferina Firefly, sale di sodio monoidrato</td><td>Goldbio</td><td>LUCNA</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Spectrum Imaging System</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cauery penna chirurgica</td><td>Bovie Medical Corporation</td><td>AA01</td><td></td></tr><tr><td>CD3&epsilon; anticorpo (clone 2GV6)</td><td>Ventana</td><td>790-4341</td><td></td></tr><tr><td>Caliper</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-648-17</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo del recettore degli androgeni</td><td>Thermo Scientific</td><td>RB-9030-P1</td><td>Diluizione della colorazione 1:500 Anticorpo</td></tr><tr><td>sinaptofisina (clone Z66)</td><td>Life Technologies</td><td>18-0130</td><td>Diluizione della colorazione 1:200</td></tr></tbody></table>

un modello murino syngeneic orthotopic bioluminescenti e fluorescente di carcinoma della prostata androgeno-dipendente e castrazione-resistente

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

Modellazione di orthotopic del tumore è uno strumento prezioso per la ricerca pre-clinica del carcinoma della prostata, come ha più vantaggi rispetto entrambi sottocutaneo e transgenici modelli murini geneticamente. A differenza dei tumori sottocutanei, orthotopic tumori contengono sistema vascolare clinicamente più accurata, microambiente tumorale e risposte alle terapie multiple. In contrasto ai modelli murini geneticamente ingegnerizzati, orthotopic modelli possono essere eseguite con costi inferiori e in meno tempo, implicano l'uso di mouse altamente complesso ed eterogeneo o linee cellulari tumorali umane, piuttosto che singole alterazioni genetiche e queste cellule linee può essere geneticamente modificato, tale da esprimere agenti imaging. Qui, presentiamo un protocollo per iniettare chirurgicamente una linea cellulare di carcinoma della prostata murino luciferasi - e mCherry-esprimendo il lobo anteriore della prostata dei topi. Questi topi hanno sviluppato i tumori di orthotopic che sono stati monitorati in modo non invasivo in vivo e ulteriormente analizzati per volume del tumore, il peso, sopravvivenza del mouse e infiltrazione immune. Inoltre, topi del tumore-cuscinetto ortotopico sono stati castrati chirurgicamente, che conduce alla regressione del tumore immediato e ricorrenza successiva, che rappresenta il cancro della prostata resistente alla castrazione. Anche se per eseguire questa procedura è necessaria abilità tecnica, questo modello syngeneic ortotopico di cancro alla prostata resistente alla castrazione sia androgeno-dipendente è di grande utilità per tutti i ricercatori nel campo.

In questo manoscritto, abbiamo iniettato chirurgicamente la linea cellulare di carcinoma della prostata murino, Myc-CaP, nel lobo anteriore della prostata (Figura 1A), che conduce allo sviluppo dei tumori della prostata orthotopic con una TME clinicamente rilevante e la corretta prostata-drenante nei linfonodi (Figura 1B). Questa è stata eseguita utilizzando micro-dissezione Forbici, pinze Graefe, tessuto forcipe Graefe, un porta-aghi con frese di sutura e una siringa di 50 µ l con un ago di calibro 28 (Figura 1). Dopo eseguire un'incisione addominale di linea mediana di circa 1 cm sopra le ghiandole prepuziali (Figura 1), uno della vescichetta seminale e annesso lobo anteriore della prostata sono stati situati ed esternalizzato (Figura 1E) e 30 µ l (1 x 106 cellule) di un 1:1 PBS/matrigel sospensione cellulare è stato iniettato nella prostata (Figura 1F), come inizialmente verificata il engorgement del lobo e la mancanza di perdite (Figura 1).
Per monitorare la crescita del tumore di orthotopic, abbiamo transfected stabile cellule Myc-CaP per esprimere sia luciferasi firefly e mCherry, consentendo per i tumori a cui seguirà non invasiva in vivo bioluminescenza (Figura 2A) e fluorescenza (Figura 2B), rispettivamente. Una limitazione di questo imaging è che, a seconda della forza del segnale, quantificazione di imaging possono saturare mentre il tumore continua ad aumentare di dimensioni. Pertanto, con alte intensità del segnale, questo imaging in vivo è più utile per la normalizzazione della massa tumorale inizialmente attraverso gruppi sperimentali e per la determinazione più tardi diminuisce nelle dimensioni del tumore dopo trattamenti sperimentali. Ulteriori modalità di formazione immagine può anche essere utilizzata, ad esempio piccolo animale MRI, PET o CT.
Orthotopic tumori sono stati sezionati dall'addome il giorno 30 dopo l'iniezione intra-prostatica (Figura 3A). I tumori orthotopic dovrebbero trovarsi presso il sito del lobo anteriore della prostata. Tumore masse in tutto l'addome o attaccato alla parete addominale anteriore indicano improprio iniezione intra-prostatico e perdite. Con la tecnica corretta, volume del tumore (Figura 3B) e peso (Figura 3) possono essere registrati con relativamente piccolo errore standard. Tuttavia, come osservato, ci sarà qualche variabilità con masse tumorali di piccole e grandi. Pertanto, l'uso iniziale di quantificazione imaging pre-trattamento per equilibrare il carico del tumore tra armi sperimentali è fondamentale per tutti gli esperimenti. Ulteriormente, come queste cellule tumorali murini sono state iniettate in topi immunocompetenti FVB/NJ, la TME può essere analizzata da immunohistochemistry (IHC) (o citometria a flusso o altre tecniche) per le cellule T CD3 (Figura 3D) (o altri tipi di cellule immunitarie). Infine, questo modello fornisce un endpoint di sopravvivenza oggettivi, come il grande tumore primario cause massa emorragica ascite addominale36 (Figura 3E) e/o ridotta di deambulazione, governare e/o piloerezione37. In alcuni casi, morte può essere causata anche dalla crescita del tumore bloccando l'uscita dell'urina.
Infine, questo modello può essere utilizzato per studiare sia il carcinoma della prostata androgeno-dipendente che CRPC, il secondo dei quali conferisce prognosi difficile e ha bisogno di opzioni di trattamento novello. Dopo lo sviluppo del tumore di orthotopic, topi sono stati castrati chirurgicamente, come descritto in precedenza38. Poiché questo è il secondo intervento chirurgico maggiore sopravvivenza, cura supplementare occorre monitorare per recupero ed eventuali eventi avversi o complicanze. Entro 3 giorni dopo la castrazione, è stata osservata la regressione del tumore forte, seguito dalla ricorrenza del tumore successive dopo circa 30 giorni, che rappresentano CRPC (Figura 4A). CRPC tumori possono essere dissezione e analizzati istologicamente e non visualizzare alcuna differenziazione neuroendocrina, come mantenere elevati livelli di AR e sono negativi per l'indicatore neuroendocrino, lo synaptophysin (Figura 4B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57301/57301fig1.jpg"> Figura 1: lobo anteriore della prostata, linfonodi drenanti e tecnica rappresentativa per iniezioni intra-prostatico cell. Immagini del lobo della prostata anteriore di destra (A) (nero, *), associata a destra della vescichetta seminale (bianco), giusto testicolo e rilievo grasso (verde) e della vescica (giallo), (B) della prostata-drenante para-aortici linfonodi bilaterali (arancione), (C) Micro-dissezione Forbici, pinze Graefe, tessuto forcipe Graefe, un porta-aghi con frese di sutura e 50 µ l siringa con ago di calibro 28 (da sinistra a destra), (D) del midline incisioni, vescichetta seminale (E) e lobo anteriore della prostata esternalizzazione, (F), iniezione intra-prostatico e ingorgo mammario (G) del lobo anteriore della prostata. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57301/57301fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57301/57301fig2.jpg"> Figura 2: In vivo imaging tumorale fluorescente e bioluminescenti. (A) Luciferase - e (B) mCherry-esprimendo orthotopic Myc-CaP tumori erano imaged utilizzando un sistema di Imaging di IVIS Spectrum. Bioluminescenza è stata quantificata tramite flusso totale (fotoni/s). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57301/57301fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57301/57301fig3.jpg"> Figura 3: analisi del tumore Orthotopic dal volume del tumore, peso, istologia per infiltrazione immune e la sopravvivenza. Orthotopic tumori erano sezionati il giorno 30 dopo l'iniezione intra-prostatico e analizzati dal volume lordo (π/6 × L × W × H; del tumore di imaging, (B) di (A) L = lunghezza dell'asse più lungo del tumore, W = Larghezza perpendicolare, H = altezza perpendicolare), il peso del tumore (C) , (D) CD3 IHC (barra della scala = 100 µm) e la sopravvivenza (E) , con l'endpoint oggettivo come l'aspetto di emorragica addominale ascite. (A-B) Dati rappresentati come media ± errore standard della media. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57301/57301fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57301/57301fig4.jpg"> Figura 4: le iniezioni Intra-prostatica con conseguente castrazione chirurgica per modellare sia il carcinoma della prostata androgeno-dipendente e CRPC. (A) topi cuscinetto ortotopico luciferasi-esprimendo i tumori erano imaged di bioluminescenza pre- e post-castrazione (Cx), e (B) è ricorso CRPC tumori sono stati sezionati (nero = orthotopic del tumore della prostata; giallo = vescica) e analizzati da H &amp; E, AR IHC e lo synaptophysin IHC (con controllo positivo murino) (barra della scala = 50 µm). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57301/57301fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

L'obiettivo del presente protocollo è quello di dimostrare l'iniezione intra-prostatica delle cellule di carcinoma della prostata, con conseguente castrazione. Orthotopic modelli pre-clinici di carcinoma della prostata androgeno-dipendente e castrazione-resistente sono fondamentali per studiare la malattia nel contesto di un microambiente tumorale clinicamente rilevanti e un ospite immunocompetente.

Un modello murino Syngeneic Orthotopic bioluminescenti e fluorescente di carcinoma della prostata androgeno-dipendente e castrazione-resistente

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire un'iniezione intra-prostatica di cellule tumorali murine per indurre la formazione di tumori ortotopici singenici in grado di modellare sia il carcinoma prostatico androgeno-dipendente che quello resistente alla castrazione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del cancro alla prostata, come ad esempio cosa guida lo sviluppo del cancro alla prostata e quali trattamenti funzionano meglio nell'eliminazione di questi tumori. I principali vantaggi di questa tecnica sono che i tumori ortotopici sono geneticamente più complessi, si sviluppano in un microambiente tumorale clinicamente rappresentativo e possono essere geneticamente modificati prima dell'iniezione.Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia del cancro alla prostata umano poiché i tumori ortotopici rispondono alle terapie in modo simile a quello osservato nei pazienti umani. Dopo aver confermato la mancanza di risposta al pizzicamento delle dita, applicare un unguento sugli occhi del topo e radere tutto il pelo dall'addome dell'animale. Sterilizzare la pelle esposta con tre cicli di scrub chirurgico utilizzando tamponi sterili non aderenti seguiti da salviettine imbevute di alcol sterili.Quando la pelle è asciutta, posizionare il mouse in posizione supina su una superficie pulita sopra un termoforo direttamente sotto l'obiettivo di un microscopio operatorio pulito. E copri l'animale con un telo sterile con un piccolo foro ritagliato sull'addome. Praticare un'incisione di un centimetro nella pelle esterna e nella muscolatura addominale interna lungo la linea mediana dell'addome superiore al pene e alle ghiandole prepuziali.Individuare una delle vescicole seminali bilaterali e i lobi prostatici anteriori attaccati che sono tipicamente posteriori, laterali e leggermente superiori alla vescica Chiedere a un assistente di mescolare la soluzione di cellule tumorali MIC-CAP Matrigel con un pipettaggio delicato e di aspirare lentamente 30 microlitri di cellule in un ago calibro 28 collegato a una siringa da 50 microlitri. Quindi, utilizzando la pinza per tessuti Graefe, sollevare delicatamente la punta di una vescicola seminale per creare tensione sul tessuto senza perforare la vescicola e inserire con cura lo smusso dell'ago parallelamente all'asse lungo del lobo prostatico anteriore. Iniettare lentamente l'intero volume di cellule nel lobo seguito da una lenta retrazione dell'ago per evitare perdite.Una buona iniezione sarà evidente da un ingorgo del lobo prostatico anteriore. Mantenere con attenzione e costanza la vescicola seminale e il lobo prostatico iniettato all'esterno del topo per circa 30 secondi per consentire al Matrigel di solidificarsi parzialmente all'interno del lobo. Utilizzare un applicatore sterile con punta in poliestere per raccogliere eventuali perdite di soluzione cellulare nell'addome per prevenire lo sviluppo di tumori non ortotopici.Un'accurata iniezione intraprotesica è fondamentale per lo sviluppo di tumori non ortotopici. Prestare particolare attenzione per evitare di perforare la vescicola seminale, iniettare lentamente la sospensione delle cellule tumorali e raccogliere eventuali perdite di cellule aumenterà il successo di questa procedura. Ora, rimetti delicatamente la vescicola seminale e il lobo iniettato nell'addome senza esercitare pressione sul lobo e sostituisci eventuali tessuti esternalizzati.Utilizzando suture con ago da taglio inverso assorbibili 5-0 vicryl, chiudere la muscolatura addominale interna con punti continui seguiti dalla chiusura della pelle addominale esterna con punti interrotti utilizzando suture con ago da taglio inverso riassorbibili in monofilamento di nylon 4-0. Quindi, somministrare l'analgesia post-operatoria e posizionare il topo in una gabbia senza lettiera a metà su un termoforo con monitoraggio fino al completo recupero. La trasfezione stabile delle cellule Myc-CaP per la luciferasi della lucciola e l'espressione di mCherry consente ai tumori della prostata di essere seguiti da bioluminescenza e fluorescenza non invasiva in vivo.Qui vengono mostrati i tumori rappresentativi sezionati dall'addome il giorno 30 dopo l'iniezione intraprostatica. Con una tecnica appropriata, il volume e il peso del tumore possono essere registrati con un errore standard relativamente piccolo, sebbene sia prevista una certa variabilità tra masse tumorali piccole e grandi. Le cellule tumorali murine iniettate per via intra-prostatica possono anche essere analizzate mediante immunoistochimica per la presenza di cellule T CD3-positive infiltranti il tumore o di altre cellule immunitarie di interesse.Inoltre, questo modello fornisce un endpoint di sopravvivenza oggettivo poiché la grande massa tumorale primaria causa ascite addominale emorragica e/o diminuzione della deambulazione e/o piloerezione. La castrazione tre giorni dopo l'iniezione intra-prostatica provoca una robusta regressione del tumore seguita da un'eventuale recidiva del tumore dopo circa 30 giorni rappresentativa del carcinoma prostatico resistente alla castrazione. La dissezione e l'analisi istologica dei tumori del cancro alla prostata resistenti alla castrazione non rivelano alcuna differenziazione neuroendocrina poiché i tumori mantengono alti livelli di recettori degli androgeni e sono negativi per il marcatore neuroendocrino sinaptofisina.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in 20-30 minuti se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di somministrare analgesici pre e postoperatori e di eseguire tutti gli interventi chirurgici con tecnica sterile e con l'aiuto di un assistente chirurgico. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'immunoistochimica, la citometria a flusso e la valutazione del volume e del peso del tumore e della sopravvivenza degli animali per rispondere a ulteriori domande sulle risposte alle immunoterapie e ad altre terapie sperimentali.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come iniettare cellule tumorali della prostata nel lobo prostatico anteriore dei topi per un'eventuale castrazione chirurgica e analisi della regressione e della recidiva del tumore. Non dimenticare che lavorare con le cellule tumorali può essere estremamente pericoloso e ci sono precauzioni come indossare i dispositivi di protezione individuale corretti che dovrebbero essere sempre presi durante l'esecuzione di questa procedura.

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Un modello murino Syngeneic Orthotopic bioluminescenti e fluorescente di carcinoma della prostata androgeno-dipendente e castrazione-resistente (Video) | JoVE Journal

Un modello murino Syngeneic Orthotopic bioluminescenti e fluorescente di carcinoma della prostata androgeno-dipendente e castrazione-resistente

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