Un modello murino Syngeneic Orthotopic bioluminescenti e fluorescente di carcinoma della prostata androgeno-dipendente e castrazione-resistente

L'obiettivo del presente protocollo è quello di dimostrare l'iniezione intra-prostatica delle cellule di carcinoma della prostata, con conseguente castrazione. Orthotopic modelli pre-clinici di carcinoma della prostata androgeno-dipendente e castrazione-resistente sono fondamentali per studiare la malattia nel contesto di un microambiente tumorale clinicamente rilevanti e un ospite immunocompetente.

L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire un'iniezione intra-prostatica di cellule tumorali murine per indurre la formazione di tumori ortotopici singenici in grado di modellare sia il carcinoma prostatico androgeno-dipendente che quello resistente alla castrazione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del cancro alla prostata, come ad esempio cosa guida lo sviluppo del cancro alla prostata e quali trattamenti funzionano meglio nell'eliminazione di questi tumori. I principali vantaggi di questa tecnica sono che i tumori ortotopici sono geneticamente più complessi, si sviluppano in un microambiente tumorale clinicamente rappresentativo e possono essere geneticamente modificati prima dell'iniezione.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia del cancro alla prostata umano poiché i tumori ortotopici rispondono alle terapie in modo simile a quello osservato nei pazienti umani. Dopo aver confermato la mancanza di risposta al pizzicamento delle dita, applicare un unguento sugli occhi del topo e radere tutto il pelo dall'addome dell'animale. Sterilizzare la pelle esposta con tre cicli di scrub chirurgico utilizzando tamponi sterili non aderenti seguiti da salviettine imbevute di alcol sterili.

Quando la pelle è asciutta, posizionare il mouse in posizione supina su una superficie pulita sopra un termoforo direttamente sotto l'obiettivo di un microscopio operatorio pulito. E copri l'animale con un telo sterile con un piccolo foro ritagliato sull'addome. Praticare un'incisione di un centimetro nella pelle esterna e nella muscolatura addominale interna lungo la linea mediana dell'addome superiore al pene e alle ghiandole prepuziali.

Individuare una delle vescicole seminali bilaterali e i lobi prostatici anteriori attaccati che sono tipicamente posteriori, laterali e leggermente superiori alla vescica Chiedere a un assistente di mescolare la soluzione di cellule tumorali MIC-CAP Matrigel con un pipettaggio delicato e di aspirare lentamente 30 microlitri di cellule in un ago calibro 28 collegato a una siringa da 50 microlitri. Quindi, utilizzando la pinza per tessuti Graefe, sollevare delicatamente la punta di una vescicola seminale per creare tensione sul tessuto senza perforare la vescicola e inserire con cura lo smusso dell'ago parallelamente all'asse lungo del lobo prostatico anteriore. Iniettare lentamente l'intero volume di cellule nel lobo seguito da una lenta retrazione dell'ago per evitare perdite.

Una buona iniezione sarà evidente da un ingorgo del lobo prostatico anteriore. Mantenere con attenzione e costanza la vescicola seminale e il lobo prostatico iniettato all'esterno del topo per circa 30 secondi per consentire al Matrigel di solidificarsi parzialmente all'interno del lobo. Utilizzare un applicatore sterile con punta in poliestere per raccogliere eventuali perdite di soluzione cellulare nell'addome per prevenire lo sviluppo di tumori non ortotopici.

Un'accurata iniezione intraprotesica è fondamentale per lo sviluppo di tumori non ortotopici. Prestare particolare attenzione per evitare di perforare la vescicola seminale, iniettare lentamente la sospensione delle cellule tumorali e raccogliere eventuali perdite di cellule aumenterà il successo di questa procedura. Ora, rimetti delicatamente la vescicola seminale e il lobo iniettato nell'addome senza esercitare pressione sul lobo e sostituisci eventuali tessuti esternalizzati.

Utilizzando suture con ago da taglio inverso assorbibili 5-0 vicryl, chiudere la muscolatura addominale interna con punti continui seguiti dalla chiusura della pelle addominale esterna con punti interrotti utilizzando suture con ago da taglio inverso riassorbibili in monofilamento di nylon 4-0. Quindi, somministrare l'analgesia post-operatoria e posizionare il topo in una gabbia senza lettiera a metà su un termoforo con monitoraggio fino al completo recupero. La trasfezione stabile delle cellule Myc-CaP per la luciferasi della lucciola e l'espressione di mCherry consente ai tumori della prostata di essere seguiti da bioluminescenza e fluorescenza non invasiva in vivo.

Qui vengono mostrati i tumori rappresentativi sezionati dall'addome il giorno 30 dopo l'iniezione intraprostatica. Con una tecnica appropriata, il volume e il peso del tumore possono essere registrati con un errore standard relativamente piccolo, sebbene sia prevista una certa variabilità tra masse tumorali piccole e grandi. Le cellule tumorali murine iniettate per via intra-prostatica possono anche essere analizzate mediante immunoistochimica per la presenza di cellule T CD3-positive infiltranti il tumore o di altre cellule immunitarie di interesse.

Inoltre, questo modello fornisce un endpoint di sopravvivenza oggettivo poiché la grande massa tumorale primaria causa ascite addominale emorragica e/o diminuzione della deambulazione e/o piloerezione. La castrazione tre giorni dopo l'iniezione intra-prostatica provoca una robusta regressione del tumore seguita da un'eventuale recidiva del tumore dopo circa 30 giorni rappresentativa del carcinoma prostatico resistente alla castrazione. La dissezione e l'analisi istologica dei tumori del cancro alla prostata resistenti alla castrazione non rivelano alcuna differenziazione neuroendocrina poiché i tumori mantengono alti livelli di recettori degli androgeni e sono negativi per il marcatore neuroendocrino sinaptofisina.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in 20-30 minuti se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di somministrare analgesici pre e postoperatori e di eseguire tutti gli interventi chirurgici con tecnica sterile e con l'aiuto di un assistente chirurgico. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'immunoistochimica, la citometria a flusso e la valutazione del volume e del peso del tumore e della sopravvivenza degli animali per rispondere a ulteriori domande sulle risposte alle immunoterapie e ad altre terapie sperimentali.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come iniettare cellule tumorali della prostata nel lobo prostatico anteriore dei topi per un'eventuale castrazione chirurgica e analisi della regressione e della recidiva del tumore. Non dimenticare che lavorare con le cellule tumorali può essere estremamente pericoloso e ci sono precauzioni come indossare i dispositivi di protezione individuale corretti che dovrebbero essere sempre presi durante l'esecuzione di questa procedura.