Metodo per il pregiudizio elasticizzato ad alta velocità dell'essere umano ha indotto i neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti in un formato a 96 pozzetti

L'obiettivo generale di questo modello è quello di creare un fenotipo di neurotrauma clinicamente rilevante in un formato a 96 pozzetti per facilitare il confronto efficiente e simultaneo delle lesioni subite in più condizioni sperimentali. Lo scopo principale di questo modello è quello di consentire screening fenotipici ad alto contenuto per la scoperta di farmaci nei neurotraumi, con neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo. Le piastre utilizzate in questo modello mantengono la geometria standard del settore a 96 pozzetti, mantenendo la loro compatibilità con i macchinari di screening ad alto contenuto esistenti, come i bracci robotici e i microscopi automatizzati.

Per iniziare, posiziona una piastra a 96 pozzetti senza fondo con il lato inferiore rivolto verso l'alto all'interno di un pulitore al plasma da 200 watt per 60 secondi ad alta potenza. Quindi, immergere la piastra in 200 millilitri di APTES all'1,5% appena preparato in acqua deionizzata, con il lato inferiore rivolto verso il basso, per 20 minuti in una cappa aspirante. Dopo 10 minuti dall'inizio dell'incubazione, utilizzare una pinza per posizionare una membrana in silicone trattato al plasma sopra un rettangolo di carta pergamena di 7,5 x 11 centimetri e allineare una lastra di alluminio di 7,5 x 11,05 centimetri sulla parte inferiore del morsetto di fabbricazione della piastra.

Quindi utilizzare una pinza per allineare la membrana in silicone e la carta da forno sulla lastra di alluminio. Al termine del periodo di rivestimento, rimuovere la piastra senza fondo dal bagno APTES e scrollarsi di dosso la soluzione in eccesso. Immergi il piatto senza fondo in due bagni d'acqua deionizzata consecutivi da 200 millilitri per cinque secondi ogni immersione e scrollati di dosso l'acqua in eccesso.

Dopo la completa asciugatura con aria compressa, posizionare la piastra senza fondo nella parte superiore del morsetto di fabbricazione della piastra e chiudere delicatamente il morsetto per premere insieme la piastra senza fondo e il silicone. Per allineare il blocco del penetratore, utilizzare i morsetti del tavolino per fissare la piastra sul tavolino del dispositivo di allungamento sotto una telecamera con un feed live e posizionare una luce a cupola sopra il dispositivo. Avvia il software di controllo dello strumento sul computer collegato al dispositivo per lesioni e fai clic sulla finestra di avvio per eseguire il progetto di neurotrauma in vitro.

Dalla finestra del progetto, fare doppio clic sugli strumenti virtuali Motion Control e position tracker. Chiudere la gabbia che circonda il dispositivo di lesione e fare clic sulla freccia nello strumento virtuale di controllo del movimento per far funzionare lo strumento. Fare clic vicino alla parte inferiore per abbassare il tavolino entro due millimetri dal contatto con i penetratori, quindi fare clic su stop per fermare lo strumento virtuale.

Nella finestra del progetto, fare clic con il pulsante destro del mouse su Axis One e fare clic su Interactive Test Panel. Immettere 500 unità nel campo Posizione target nella finestra visualizzata per impostare la dimensione del passo su 50 micrometri. Quindi fare clic su Vai ripetutamente, fino a quando la lastra non entra in contatto per la prima volta con eventuali penetratori, verificando la presenza di contatto sull'immagine dal vivo visualizzata dalla telecamera.

La posizione verticale del palco sarà riportata in alto a sinistra nella finestra del pannello interattivo di test. Abbassare ulteriormente la piastra fino a quando ogni pozzetto non è entrato in contatto con i penetratori, muovendo la telecamera e il tavolino secondo necessità per visualizzare l'intera lastra. Annotare la posizione verticale del palco quando tutti i montanti sono in contatto e chiudere il pannello di test interattivo.

Quindi, eseguire lo strumento virtuale di controllo del movimento e fare clic su Superiore per sollevare il tavolino, utilizzando il pulsante di arresto per arrestare lo strumento virtuale quando il tavolino è in posizione. Aprire lo sportello per disattivare il dispositivo, quindi allentare la vite di sicurezza sull'angolo che è entrato in contatto per primo per abbassare l'angolo e serrare la vite opposta per sollevare l'angolo che ha fatto contatto per ultimo. Ripetere l'abbassamento, l'osservazione e la regolazione del blocco fino a quando la piastra non entra in contatto con tutti i penetratori contemporaneamente.

Un attento allineamento del blocco del penetratore è importante per ottenere una lesione uniforme su tutti i pozzetti della piastra. Aprire lo sportello per disattivare nuovamente il dispositivo e inserire le viti di fissaggio nei rispettivi fori sul blocco penetratore. Quindi serrare le viti in posizione e annotare la posizione del tavolino riportata dal pannello di prova interattivo quando la piastra entra in contatto.

Per allungare la piastra, modificare il nome del file nel campo Percorso file nello strumento virtuale di controllo della posizione con un nome file univoco e fare clic sulla freccia Esegui. Impostare la profondità e la durata dell'indentazione e i campi Infortunio e Durata infortunio nello strumento virtuale del pannello di controllo del movimento. Con la piastra in posizione zero, eseguire lo strumento virtuale del pannello di controllo del movimento e fare clic su Lesione per far rientrare la piastra.

Fare clic su Superiore per spostare il tavolino verso l'alto, fare clic su stop quando la piastra è nella posizione superiore e aprire la porta per disattivare il dispositivo di lesione. Quindi ispezionare la cronologia degli spostamenti dello stadio presentata nello strumento virtuale di tracciamento della posizione per confermare che è stato applicato lo spostamento massimo specificato ed esportare i dati in un programma di fogli di calcolo appropriato. Per valutare l'allungamento della membrana siliconica, dopo il trattamento al plasma, posizionare la lastra su una superficie morbida e adescare la piccola sporgenza su un timbro con inchiostro da un pennarello indelebile.

Inserire il timbro nel primo pozzetto da testare e picchiettare per garantire un buon trasferimento dell'inchiostro. Quando tutti i pozzetti sono stati timbrati, posizionare la telecamera ad alta velocità su un supporto a braccio sopra il dispositivo di lesione con l'obiettivo impostato sul più piccolo F-stop numerato in modo che il campo visivo contenga 12 penetratori in una griglia tre per quattro. Con il punto di posizione zero, fare clic sul pulsante di registrazione sul software della fotocamera in modo che legga il trigger e attivare la luce assiale diffusa e brillante.

Quindi indentare la piastra come appena dimostrato e spegnere la luce assiale. Per danneggiare una coltura cellulare, aggiungere 100 microlitri di neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo trattati con laminina a ciascun pozzetto della piastra trattata con plasma e lasciare che le cellule si attacchino al fondo della piastra per 15 minuti a temperatura ambiente prima di posizionare la piastra nell'incubatore per colture cellulari. Dopo due o tre giorni di coltura, bloccare la piastra sul tavolino del dispositivo per lesioni e regolare la posizione del coperchio per fissare la piastra senza esporre le colture all'aria ambiente.

Quindi, con la piastra nella posizione del punto zero, indentare la piastra come appena dimostrato. Una coltura ottimale illesa avrà pochi o nessun grumo di più di cinque cellule e i neuriti saranno individuali, lunghi, sottili e curvi, con poche o nessuna perlatura. In condizioni ideali, la vitalità delle colture dovrebbe avvicinarsi molto a quella specificata nella scheda tecnica del produttore e le colture su silicone dovrebbero assomigliare a quelle mantenute su substrati di coltura rigidi convenzionali.

L'aumento della densità cellulare aumenta il numero e le dimensioni dei grumi che si formano in coltura, mentre l'aumento della concentrazione di laminina in genere contrasta questo effetto. Nelle colture danneggiate con un ceppo di picco del 57%, quattro ore dopo la lesione, i neuriti sono accorciati o mancanti e alcuni hanno perle con agglomerazione dimostrata dalle cellule vitali rimanenti. In particolare, i trattamenti con laminina a dosi più elevate riducono la gravità del danno alle colture cellulari in modo dipendente dalla concentrazione, come evidenziato dall'aumento della lunghezza dei neuriti e della vitalità cellulare nelle colture trattate con laminina a dosi più elevate.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante considerare i tempi di consegna. Ad esempio, la disintossicazione delle membrane richiede tre giorni e le piastre prodotte devono polimerizzare durante la notte prima dell'uso. Non dimenticare che il dispositivo per lesioni contiene una potente bobina mobile per guidarne il movimento, e si dovrebbe sempre tenersi lontani dal dispositivo quando è attivo e spegnere il dispositivo solo quando il tavolino è al massimo della sua corsa.