Name: Metodo per il pregiudizio elasticizzato ad alta velocità dellessere umano ha indotto i neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti in un formato a 96 pozzetti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Scopri un metodo per creare un modello in vitro di lesione da stiramento in formato 96 pozzetti utilizzando neuroni umani derivati da cellule staminali pluripotenti indotte. Questa piattaforma consente screening ad alto contenuto per la scoperta di farmaci nel campo del neurotrauma.

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Questo lavoro è sostenuto in parte da una sovvenzione del National Institutes of Health (R21NS098129). Vorremmo riconoscere eccellente assistenza tecnica da SueSan Chen, Jonathan Tan, Courtney Cavanaugh, Shi Kai Ng e Feng Yuan Bu, che progettò e costruì una struttura per sostenere le luci utilizzate durante gli esperimenti di imaging ad alta velocità descritti in questo manoscritto .

<ol><li>Faul, M., L, X. u, Wald, M. M., Coronado, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFaul%2C+M+%22Traumatic+brain+injury+in+the+United+States%3A+emergency+department+visits%2C+hospitalizations%2C+and+deaths%2C+2002-2006%22">Traumatic brain injury in the United States: emergency department visits, hospitalizations, and deaths, 2002-2006</a>. , (2010).</li>
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<li>Muffat, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+derivation+of+microglia-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Med. 22 (11), 1358-1367 (2016).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

La chiave per ottenere un coerente, biofidelic fenotipo in questo modello è l'applicazione di un insulto meccanico biofidelic coerente. Questo modello può generare impulsi durate più brevi 10-15 ms, che sono simili per le durate di impulso per impatti antropici testa secondo esperimenti cadaverico12,13. La consistenza di questo insulto dipende l'allineamento della piastra con il blocco del penetratore e lubrificazione costante dei penetratori. Quando il blocco di penetratore è ben allineato, non c'è nessuna tendenza nel ceppo applicato in righe o colonne (Figura 2). Un sottile strato di lubrificante in genere crea meno attrito di uno strato spesso e viscosi grassi non sono raccomandati perché fallo il silicone e ostruire il passaggio della luce durante la microscopia. L'ampiezza di spostamento di fase reale può inferiori sostanzialmente l'ampiezza di spostamento prescritto quando molti penetratori sono utilizzati, e l'ampiezza di spostamento di fase prescritto è grande (> 3 mm). Tuttavia, mentre lo spostamento reale è inferiore la cilindrata prescritta a grandi ampiezze, rimane ripetibile (Figura 2B). Di conseguenza, ampiezze di spostamenti di grandi, effettivo possono essere ottenute in modo affidabile immettendo un valore prescritto eccedente il valore desiderato. Ampiezza di spostamento è importante solo perché è un proxy facilmente registrato per il ceppo di membrana di picco, che misura direttamente l'insulto meccanico che induce la patologia. Pertanto, la procedura descritta per determinare la deformazione della membrana dallo spostamento di fase è fondamentale. Questo processo deve essere ripetuto se importanti vengono apportate modifiche al sistema che influenzano l'interazione tra la piastra e i penetratori, ad esempio se diversi penetratori di diametro, penetratore diversi materiali o rivestimenti o diversi tipi di silicone vengono utilizzati a fondo piatto. Il processo di riallineamento del blocco del penetratore e determinare la posizione di zero deve essere ripetuto all'inizio di ogni esperimento. Un disegno schematico del dispositivo d'allungamento è illustrato nella Figura 1. Modelli CAD necessari per riprodurre il dispositivo vengono forniti come materiali supplementari: ' lesione periferica - FULL ASSEMBLY - 3D generico. PASSO '; il conto associato di materiali forniti comesupplementare tabella 1: Custom costruito dispositivi - BOM.xlsx. Vedi anche complementare tabella 2 96 ben piastra _loader – Pinout cablaggio Diagram.xlsx, che descrive i collegamenti di cavi che collegano i vari componenti dei sistemi. 'Interconnector_circuit_board.dip' descrive un circuito che collega i cavi.
Se il dispositivo è disattivato con il palco vicino alla metà della sua corsa, il palco si muoverà dopo il potere è tagliato fuori, perché è a molla. Quando l'alimentazione viene ripristinata, il circuito di retroazione è in grado di rilevare una grande differenza tra l'ultima posizione nota prescritta e la posizione effettiva. Questo farà sì che la fase spostare improvvisamente la posizione che era in quando la periferica è stata disattivata. Questo movimento improvviso può causare errori nell'output dell'encoder, quindi cura deve essere presa per disattivare il dispositivo solo quando è nella sua non alimentato a riposo posizione nella parte superiore della sua corsa.
Il morsetto di montaggio è progettato per portare la parte inferiore del corpo e silicone piastra insieme in un modo che permette di incollaggio ottima. A tal fine, ci sono tre caratteristiche fondamentali nella progettazione presentata nel file supplemento ' Press Die - 3D generico. PASSO '. In primo luogo, il portatarga del corpo pinza è parallela al fondo del silicone. Se questo è costruito correttamente, non sarà necessario alcun aggiustamento dopo l'installazione iniziale. In secondo luogo, lo strato di gommapiuma nel morsetto fornisce una piccola quantità di conformità sotto la piastra, come un sistema completamente rigido teoricamente subirebbe un aumento improvviso da zero forza di serraggio a forza di serraggio infinito quando il morsetto è stato chiuso. La posizione della traversa e la vite del morsetto sono regolabili in modo che la distanza tra i due lati del morsetto può essere regolata.
Ogni sforzo dovrebbe essere fatto per fornire uno sfondo luminoso e bianco dietro il punto sul fondo ben durante gli esperimenti di caratterizzazione del ceppo. Meglio il contrasto in queste immagini, più facile sarà per automatizzare il processo di misurazione l'altezza e la larghezza del punto, che può diventare noioso per un operatore umano analizzando un grande esperimento. Alta velocità videografia di fondo di un pozzo in una piastra a 96 pozzetti presenta sfide perché le pareti del pozzo tendono a proiettare ombre. L'utilizzo di una cupola di luce o luce diffusa assiale che può illuminare lungo la linea di vista della telecamera senza oscurare l'immagine Elimina le ombre o riflessi speculari che sorgerebbero con una sorgente di luce convenzionale. La sorgente di luce più luminosa disponibile deve essere utilizzata perché illuminazione luminosa consente immagini essere acquisiti con un tempo di esposizione breve. Tempi di esposizione brevi ridurre al minimo la sfocatura di movimento. L'aggiornamento i diodi luminosi (LED) a luce diffusa assiale permette tempi di esposizione più brevi durante l'acquisizione di video ad alta velocità. I LED possono essere aggiornati aprendo la luce diffusa assiale, togliere il calcio LED, montaggio 4 ad alta potenza LED matrici per il pannello posteriore usando supporti LED, collegandoli a un alimentatore di corrente costante e riassemblando la luce diffusa assiale (Vedi tabella di Materiali per i numeri di catalogo). Lo svantaggio di aggiornamento i LED è che i LED passivamente raffreddati non possono essere mantenuti per più di pochi secondi a causa del rischio di surriscaldamento. Pertanto, una luce diversa è necessaria per l'allineamento delle regolazioni post-blocco e fotocamera.
Il metodo di quantificazione del ceppo di membrana misurando la dilatazione di un puntino timbrato sulla membrana è relativamente grezzo, ma può scalare fino a pozzi multipli in modo robusto. Il campo di deformazione nella parte inferiore ben possa essere caratterizzato in modo più dettagliato utilizzando la correlazione di immagini digitali. Questa tecnica comporta un modello macchiato sulla base del pozzo di spruzzatura e quindi imaging a alta velocità durante la deformazione. Software commerciale è utilizzabile quindi per quantificare la deformazione in ogni punto dell'immagine tenendo traccia l'evoluzione del modello macchiato.
Questo protocollo produce un fenotipo di lesioni clinicamente rilevanti, elastico e multi-sfaccettato in hiPSCNs. Morte delle cellule, la degenerazione del neurite e neuriti perline sono tutto ben documentato le conseguenze di TBI in esseri umani e animali modelli15. La chiave del successo in questo modello è stabilire e mantenere sane culture. In generale, un protocollo di cultura cellulare sviluppato con placche rigide convenzionali è un utile punto di partenza per cultura piastra estensibile. Tuttavia, la possibilità che le cellule in questione possono rispondere diversamente sul silicone sempre deve essere considerata. Ciò è particolarmente vero di hiPSCNs, che sono molto sensibili alle condizioni di coltura. Alcuni esempi di ottimizzazione della concentrazione cellulare densità e laminin sono forniti nella sezione Risultati rappresentante (Figura 3, Figura 4). Attivazione del silicone con il trattamento al plasma è di vitale importanza. Il silicone è idrofobo e non reattivo; nel suo stato naturale, esso non verrà associato alla laminina o altre molecole utilizzati per promuovere l'adesione delle cellule. Trattamento al plasma rende la superficie idrofila ed espone gruppi reattivi. Queste modifiche consentono di molecole di adesione legare al silicone e di promuovere il collegamento delle cellule. È importante notare che l'effetto del trattamento al plasma si disperde all'interno di minuti a meno che la superficie sia immerso nel liquido, e quindi procedure che coinvolgono la superficie attivata di essiccazione devono essere eseguite più rapidamente possibile. Un modo semplice per verificare se l'effetto del trattamento al plasma ha portato fuori è quello di mettere una goccia di acqua sulla superficie. Il silicone non trattato, la gocciolina verrà tallone fino mentre il plasma trattato in silicone, si diffonderà. Con la hiPSCNs che abbiamo utilizzato (Vedi Tabella materiali), il produttore consiglia di aggiungere la laminina con la sospensione cellulare piuttosto che pre-rivestimento. Questo protocollo è ripreso con successo questo approccio. Mentre segmentazione può, in teoria, essere realizzato con software open source o linguaggi di programmazione generici, un elevato grado di competenza con questi strumenti è necessaria per ottenere buoni risultati. Neurites sono spesso difficili da distinguere da segnale di fondo perché sono così sottili. Pertanto, si consiglia l'uso di strumenti software commerciali distribuiti dalle società di alto contenuto microscopia con moduli dedicati per la segmentazione e quantificazione dei neuroni, se disponibili. Anche con il software commerciale, si consiglia di esportare immagini della segmentazione di verificare visivamente la precisione.
Ci sono alcune limitazioni connesse con l'utilizzo di piastre stretchable rispetto a lavorare con piastre convenzionali, rigidi. Stretchable piastre possono essere imaged come di consueto con gli obiettivi dell'aria. Tuttavia, la formazione immagine con obiettivi di immersione è molto difficile. Olio di lente può danneggiare il silicone. Inoltre, l'obiettivo esercita una pressione sulla membrana in silicone che si muove verso l'alto. Questa pressione si sposta la membrana verticalmente, rendendo difficile mettere a fuoco il campione. Le membrane in silicone attualmente utilizzate nella fabbricazione le piastre sono circa 250 µm di spessore. Questo spessore supera la distanza focale di molti ad alta potenza, obiettivi di immersione. Deve prestare particolare attenzione a posare le membrane perfettamente piatto prima del serraggio per ottenere la planarità necessaria per microscopia. Sistemi autofocus possono compensare le deviazioni nella planarità del piatto finito in una certa misura. Le versioni future del protocollo precarico la membrana prima è legato alla parte superiore della piastra per garantire la planarità. La procedura senza adesivo per l'incollaggio della membrana di silicone al piatto top14 è considerata un importante punto di forza dell'attuale protocollo. Elimina il rischio di neurotossicità dall'adesivo, nonché eventuali scostamenti di planarità a causa di spessore non uniforme dello strato adesivo.
Multi-elettrodo matrici sono comunemente usate negli esperimenti con hiPSCNs per valutarne la maturità e la funzionalità. Purtroppo, questi sistemi sono compatibili con questo modello perché il substrato di coltura delle cellule è rigido. È possibile creare un array di multi-elettrodi estensibile, anche se questo è finora solo stato dimostrato in un unico ben formato16,17. Si noti che i penetratori possono essere rimosso singolarmente dal blocco penetratore affinché alcuni pozzi non sono rientrate e possono servire come shams. Rimuovendo il penetratore impedisce il rientro ma non elimina completamente carico meccanico poiché non vi è ancora inerzia moto del fluido nei pozzetti durante la fase di spostamento. Vale la pena di confrontare questi pozzi per pozzi in piastre che erano mai soggetti a movimento di fase per misurare qualsiasi influenza patologica di movimento fluido. Inoltre, la matrice di penetratori nel blocco dovrebbe essere bisymmetric (simmetrico da davanti a dietro e di lato). Questa precauzione assicura che la piastra è caricata uniformemente durante il rientro, così che la fase non inclinare lateralmente e causare le aste da associare a loro cuscinetti.
Una delle principali sfide per l'innovazione terapeutica in neurotrauma è la complessità e l'eterogeneità della condizione. Trauma applica contemporaneamente lo stress multi-modale per ogni tipo di cellula nel sistema nervoso centrale. I neuroni sono stati generati in modo affidabile da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSCs) e sono ora ampiamente disponibili da fornitori commerciali. L'innovazione sta procedendo rapidamente in questo campo, e altri tipi di cellule neurali come astrociti18 e microglia19 sono anche essere derivati da hiPSCs. Potrebbe presto essere possibile isolare le risposte delle cellule-autonoma di ciascuno di questi tipi di cellule per trauma in vitro e poi per tipi differenti delle cellule co-coltura per capire come comunicano dopo il trauma. In questo modo, in ultima analisi, è possibile ricreare la sfida clinica dal fondo a capire accuratamente in un sistema umano. Questo approccio è distinto dall'approccio convenzionale basandosi su modelli del roditore e ha il potenziale per generare nuove conoscenze che portano alle prime terapie per questa condizione comune, devastante e intrattabile.

TBI è delle principali cause di mortalità e di morbosità negli Stati Uniti, causando circa 52.000 morti e 275.000 ospedalizzazioni ogni anno1. Più di 30 studi clinici di terapeutica candidato per TBI sono stati condotti senza un singolo successo2. Questo fallimento uniforme suggerisce che umani specifici processi separano TBI umano dalla fisiopatologia osservata nei modelli del roditore pre-clinici comunemente utilizzati.
L'avvento di hiPSCNs ha creato un'opportunità per studiare neurotrauma in un modello umano in vitro . Lo screening con modelli basati su hiPSCN può trasportare i risultati che sono più predittivi di successo clinico rispetto ai modelli che impiegano cellule di roditore. Inoltre, i hiPSCNs possono essere manipolati geneticamente per isolare e studiare l'effetto delle varianti genetiche umane individuali sulla patologia3.
Il metodo descritto in questo manoscritto è progettato per portare i vantaggi unici di malattia hiPSCN-base di modellazione di neurotrauma. In vitro modelli di lesione stretch del neurotrauma sono ben consolidata4,5,6 con cellule di roditore primarie e linee cellulari tumorali neurali umane. La maggior parte di questi modelli generano tratto dal caricamento pneumatico di una membrana di silicone. Questo approccio è efficace in un unico formato bene ma ha dimostrato difficile da scalare fino a un formato multi-pozzetto7. Di conseguenza, non c'è una schermata di throughput elevato per gli agenti trattare stretch neuroni feriti.
In questo modello, la membrana si estende a causa di rientro da sotto con un penetratore rigido. Questo approccio è stato indicato più volte per generare patologia clinicamente rilevante in vitro in singoli sistemi ben8,9,10. Il nostro lavoro recente ha indicato che esso facilmente scale up in un formato a 96 pozzetti, mantenendo le durate di impulso nell'ordine di decine di millisecondi11, ovvero il tempo chiuso dominio di urto della testa eventi12,13.
In sintesi, i principali vantaggi di questo modello di ferita in vitro sono il formato di 96 pozzetti, l'uso di hiPSCNs e nel dominio del tempo clinicamente rilevanti dell'insulto.

<table><tbody><tr><td>.010 "Foglio di silicone</td><td>Specialty Manufacturing, Inc</td><td>#70P001200010</td><td>foglio di polidimetilsilossano (PDMS)</td></tr><tr><td>Sparkleen</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>#043204</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 256665</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>#12-565-600</td><td>Piastra senza fondo a 96 pozzetti</td></tr><tr><td>Kim Wipes</td><td>ULINE</td><td>S-8115</td><td></td></tr><tr><td>Detergente al plasma</td><td>Harrick Plasma</td><td>#PDC-001-HC</td><td></td></tr> <tr><td>(3-Aminopropil) trietossisilano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#440140</td><td></td></tr><tr><td>APTES Carta pergamena</td><td>Reynolds</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Dome Light</td><td>CCS inc</td><td>LFX2-100SW</td><td></td></tr><tr><td>Alimentatore per luce a cupola</td><td>CCS inc</td><td>PSB-1024VB</td><td></td></tr><tr><td>Unità di illuminazione diffusa assiale&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Siemens</td><td>Nerlite DOAL-75-LED</td> Array di LED ad alta potenza a <td>luce assiale diffusa</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp &nbsp;</td><td>CREE</td><td>XLamp CXA2540</td><td>array di LED ad alta potenza&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Supporto LED</td><td>Molex</td><td>1807200001</td><td>Supporto LED&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Alimentatore LED</td><td>Mean Well</td><td>HLG-320H-36B</td><td>Alimentatore a corrente costante&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Software FastCam Viewer&nbsp;</td><td>Fotocamera Photron</td><td></td><td>Fastcam</td></tr><tr><td>Mini UX50</td><td>Fotocamera Photron</td><td>N/A</td><td>ad alta velocità</td></tr><tr><td>Micro-NIKKOR 105mm f/2.8</td><td>Nikon</td><td>#1455</td><td>Obiettivo fotocamera ad alta velocità</td></tr><tr><td>0,1 mg/mL Poli-L-Ornitina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#P4597</td><td></td></tr><tr><td>iCells</td><td>Cellular Dynamics International</td><td>#NRC-100-010-001</td><td></td></tr><tr><td>iCell media</td><td>Dinamica cellulare internazionale</td><td>#NRM-100-121-001&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Integratore iCell</td><td>Cellular Dynamics International</td><td>#NRM-100-031-001</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#L2020</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>#H3570</tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>#C3099</tr><tr><td>attuatore a bobina mobile&nbsp;</td><td>BEI Kimco</td><td>LA43-67-000A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>encoder lineare ottico&nbsp;</td><td>Renishaw</td><td>T1031-30A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>servoazionamento</td><td>Copley Controls</td><td>Xenus XTL&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Controller</td><td>Controller Power PC in tempo reale National Instruments</td><td>cRIO 9024&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Chassis cRIO</td><td>Modulo</td> di input digitale <td>cRIO 9113</td><td></td></tr> di <tr><td></td><td>National Instruments</td><td>Chassis di acquisizione dati NI 9411</td><td></td></tr><tr><td></td><td>National Instruments</td><td>NI 9113</td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW</td> Software <td>di controllo strumenti</td><td>di</td> National Instruments <td></td></tr><tr><td>hiPSCNs</td><td>Cellular Dynamics International</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

metodo per il pregiudizio elasticizzato ad alta velocità dell'essere umano ha indotto i neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti in un formato a 96 pozzetti

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Ferita di cervello traumatica (TBI) è una grande sfida clinica con un'elevata morbilità e mortalità. Nonostante decenni di ricerca pre-clinica, non sono state sviluppate terapie dimostrate per TBI. Questa carta presenta un nuovo metodo per la ricerca pre-clinica neurotrauma destinato a integrare i modelli pre-clinici esistenti. Essa introduce fisiopatologia umana attraverso l'uso di neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSCNs). Realizza il caricamento impulso durata simile alle durate di caricamento delle cliniche chiuso urto della testa ferita. Si avvale di un formato di 96 pozzetti che facilita gli esperimenti elevato throughput e fa un uso efficiente delle cellule costose e reagenti di cultura. Membrane in silicone vengono prima trattate per rimuovere neurotossico polimero non vulcanizzato e quindi legate agli organismi commerciali piastra a 96 pozzetti per creare stretchable piastre da 96 pozzetti. Un dispositivo su misura viene utilizzato per far rientrare alcuni o tutti i fondi ben da sotto, che inducono sollecitazioni meccaniche equibiaxial che ferisce meccanicamente le cellule in cultura nei pozzetti. Il rapporto tra profondità di rientro e sollecitazioni meccaniche è determinato empiricamente utilizzando Videografia ad alta velocità dei fondali ben durante il rientro. Cellule, tra cui hiPSCNs, possono essere coltivate su queste membrane in silicone utilizzando versioni modificate dei protocolli della coltura cellulare convenzionale. Immagini al microscopio fluorescente di colture cellulari sono acquisiti e analizzati dopo la ferita in modo semi-automatico per quantificare il livello della lesione in ciascun pozzetto. Il modello presentato è ottimizzato per hiPSCNs ma in teoria potrebbe essere applicato ad altri tipi di cella.

Il dispositivo di barella è in grado di muoversi sul palco ripetibile con durate di impulso breve come 10-15 ms a seconda dell'ampiezza dell'impulso (Figura 2A). Le ampiezze di impulso sono altamente ripetibile, ma la durata dell'impulso varia da circa 1 ms tra le ripetizioni. L'ampiezza di impulso effettivo diverge dall'ampiezza di impulso prescritto quando vengono caricato un gran numero di pozzi, e l'ampiezza prescritta è elevata (Vedi Figura 2B). Come l'ampiezza dello spostamento di fase è aumentato oltre 3 mm, l'ampiezza di spostamento reale cade sempre più a corto dell'ampiezza di spostamento prescritto (Vedi Figura 2B). Attento allineamento del blocco post elimina qualsiasi tendenza nel ceppo di membrana in righe o colonne (Figura 2). 3.5 mm prescritto ampiezza di spostamento di fase (3,3 mm di ampiezza di spostamento reale) con 52 pozzi rientrati, lo sforzo di Lagrangiana medio in tutte le sedi bene era 0.451 (deviazione standard dei mezzi per tutte le sedi = 0.051, media delle deviazioni standard per tutte le sedi = 0,065, n = 5 misurazioni per pozzetto). Questi risultati sono presentati qui per completezza, anche se alcuni di loro sono già stati segnalati11.
Una coltura ottima, illeso avrà pochi eventuali grumi di cellule più di 5. Neurites sarà individuale, lungo, sottile e curvo con poco o nessun segno di tensione o di perline (Figura 3A). In condizioni ideali, la redditività delle colture dovrebbe avvicinarsi molto attentamente l'attuabilità specificato nella scheda tecnica del produttore (in genere 60-70%) e culture silicone dovrebbero essere simile a quelli mantenuti su substrati di coltura convenzionale rigida ( Figura 3B). Neurites possono o potrebbero non essere visibili su un microscopio del campo luminoso di bassa potenza. Laminina concentrazione e densità delle cellule sia influenzare culture al basale e dopo la ferita. Aumentando la densità cellulare è aumentato il numero e le dimensioni dei grumi che si formano nella cultura. L'aumento della concentrazione di laminina spesso contrastato questo effetto (Figura 3A). Tuttavia, aumentando la laminina concentrazione troppo ottuso la sensibilità delle colture alla lesione (Figura 4). La concentrazione ottimale laminin per culture illeso era 50 µ g/mL di laminina (Figura 3), ma la separazione ottima fra le popolazioni ferite iniezioni sham e stretch è stata ottenuta a 10 µ g/mL di laminina (Figura 4). Più alte concentrazioni di laminina ridotto la sensibilità delle culture per infortunio in breve tempo punti (Figura 4), ma anche vitalità cellulare migliore della linea di base a intervalli di tempo più lungo (ad es., 7 giorni). In sintesi, vale la pena per ottimizzare la concentrazione di laminina per ogni scenario sperimentale.
Ceppo di membrana, imaging punto di tempo post-infortunio, laminina concentrazione e densità delle cellule ha esercitato un effetto principale altamente statisticamente significativo sulla lunghezza del neurite per cella (ANOVA, p &lt; 0,001). L'effetto di deformazione della membrana sulla lunghezza del neurite per cella aveva altamente statisticamente significative interazioni con alberino-ferita imaging tempo punto e laminin concentrazione (ANOVA, p &lt; 0,001) e un'interazione statisticamente significativa con cella densità (ANOVA, p &lt; 0,05). Analogamente, ceppo di membrana, post-infortunio punto di tempo, di imaging cellulare densità e laminin concentrazione tutti ha esercitato un effetto principale altamente statisticamente significativo sulla vitalità cellulare (ANOVA, p &lt; 0,001). L'effetto del ceppo membrana sulla vitalità cellulare ha avuto un'interazione altamente statisticamente significativa con il punto di tempo post-lesione imaging (ANOVA, p &lt; 0,001) e un'interazione statisticamente significativa con la densità delle cellule (ANOVA, p &lt; 0.05). Questi risultati dimostrano che tempi, la densità delle cellule e la concentrazione di laminina esercitano un'importante influenza sul rapporto tra l'insulto applicata e risultati sperimentali, così ognuno deve essere ottimizzato con attenzione.
Vitalità cellulare basso e perline neurites, insieme a crescita stentata del neurite, indicano condizioni di coltura tossici che possono derivare da impropriamente preparati in silicone. Saltare o accorciando l'ammollo in acqua o al forno asciutto può lasciare etanolo assorbito o acqua nella membrana, rispettivamente, che può diffondersi nella media e sottolineare le cellule. Ben ferite Culture avrà ridotto attuabilità delle cellule, neurites ridotto o mancante, neuriti in rilievo e neurites che sembrano teso o tese. Ferita può indurre che ragruppa in colture cellulari che sono stati ben disperso pre-infortunio. Grandi ciuffi possono confondere l'analisi morfologica. Per l'analisi morfologica, il livello di pregiudizio deve essere ottimizzato tale che si verificano cambiamenti notevoli, ma le cellule sono ancora presenti con alcune neurites.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57305/57305fig1.jpg"> Figura 1 : A con l'etichetta schematica del dispositivo ferita. Vista superiore (A), (B) vista isometrica, (C) vista frontale, vista laterale destra (D). La barra della scala si applica alle viste ortogonali (A, B e D). <a href="/files/ftp_upload/57305/57305fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57305/57305fig2.jpg"> Figura 2 : Cinematica dell'insulto meccanico. Storie di (A), lo spostamento di fase sopra 5 impulsi a una gamma di ampiezze prescritte (ampiezze prescritte sono elencate nella legenda) quando non vengono caricati pozzi. (B), lo spostamento di fase storie sopra 10 impulsi a una gamma di ampiezze prescritte (ampiezze prescritte sono elencate nella legenda) quando vengono caricati 52 pozzi. (C), il ceppo medio in ciascun pozzetto con ampiezza di spostamento di fase di 3,3 mm (n = 5 misurazioni per pozzetto, media errore standard per pozzetto = 0,029). Notare che la C4-F4 e C9-F9 sono pozzetti di controllo non stirata. Questa figura è stata modificata da Sherman et al. 11 <a href="/files/ftp_upload/57305/57305fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57305/57305fig3.jpg"> Figura 3 : Ottimizzazione della cultura condizioni silicone. (A) l'effetto di variare la concentrazione cellulare di densità e laminin sulle culture hiPSCN silicone. Agglutinamento aumenta con l'aumento della densità delle cellule e diminuendo la concentrazione di laminina. Concentrazione di densità e laminin cellulare deve essere ottimizzata per ottenere colture mono-disperse. Mono-disperse culture sono meno vulnerabili ai manufatti durante la quantificazione. Si noti che la gamma dinamica è stata regolata per ottimizzare la visualizzazione dei neurites. Di conseguenza, molto più luminoso soma sono saturi. Questa presentazione è preferibile all'alternativa di ottimizzare la gamma dinamica rispetto al soma, che rende molto neurites il dimmer quasi invisibile. La condizione evidenziata dalla Piazza rossa è stata ritenuta ottimale per gli esperimenti di lesione elasticizzato in vitro . (B) in condizioni ottimali, culture su membrane in silicone appaiono simili a culture su substrati rigidi convenzionali. Il pannello di sinistra mostra hiPSCNs coltivate a 33.750 cellule/cm2 con 3,3 µ g/mL di laminina su una piastra a 96 pozzetti convenzionale, rigida (il substrato di coltura delle cellule è un coltura di tessuti trattato olefina ciclico co-polimero). Il pannello di destra riproduce il pannello delineato in rosso da (A). Scala bar = 100 µm. <a href="/files/ftp_upload/57305/57305fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57305/57305fig4.jpg"> Figura 4 : Il fenotipo di lesioni e sua dipendenza dalla concentrazione di laminina. (A) cultura sana, utilizzando 10 µ g/mL laminina e 67.500 cellule/cm2. Neurites sono long con nessun perline. Ci sono alcuni nuclei morti e pochi ciuffi. Cultura (B) utilizzando le stesse condizioni di cultura, ferito con ceppo di picco del 57% e ripreso dopo 4 h. Neurites sono ridotti o mancanti e alcuni hanno Perline (indicati dalle frecce). Ci sono meno cellule di calceina AM-positive e più calceina AM-negativo (cioè, morto) i nuclei. Ferita è aumentato agglutinamento fra le cellule sopravvissute. (C) 4 h dopo la lesione, lunghezza del neurite per cella diminuisce con l'aumento di ceppo in un modo che dipende dalla concentrazione di laminina. (D) 4 h dopo la lesione, attuabilità delle cellule diminuisce con l'aumento di sforzo in un modo che dipende dalla concentrazione di laminina. (E) 24 h dopo la lesione, lunghezza del neurite per cella diminuisce con l'aumento di ceppo in un modo che dipende dalla concentrazione di laminina. (F) 24 h dopo la lesione, attuabilità delle cellule diminuisce con l'aumento di sforzo in un modo che dipende dalla concentrazione di laminina. (n = 4 per bar, barre di errore sono ± 1 deviazione standard, barre della scala = 100 µm). Valori di deformazione sono dedotte da spostamento di fase utilizzando i dati di una precedente pubblicazione di Sherman et al. 11 <a href="/files/ftp_upload/57305/57305fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Complementare figura 1: disegno del penetratore tecnico. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Figure_1.pdf" target="_blank">Per favore clicca qui per scaricare questa figura.</a>
Complementare tabella 1: Custom costruito dispositivi. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Table_1-Custom_Devices-Bill_of_Materials.xlsx" target="_blank">Per favore clicca qui per scaricare questa tabella.</a>
Complementare tabella 2:96 ben piatto-caricatore Pinout cablaggio. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Table_2-96_Well_Plate_Loader.xlsx" target="_blank">Per favore clicca qui per scaricare questa tabella.</a>
Complementare codice File 1: disegni di progettazione assistita da elaboratore del dispositivo ferita. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_1-Injury_Device-FULL_ASSEMBLY-Generic_3D.STEP" target="_blank">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
Complementare codice File 2: disegni di progettazione assistita da elaboratore del morsetto di montaggio piastra. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_2-Press_Die-Generic_3D.STEP" target="_blank">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
Complementare codice File 3: rappresentazione 3D della geometria del timbro, adatta per l'utilizzo con una stampante 3D. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_3-stamp.STL" target="_blank">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
4 File di codice complementare: SubVI per MuStLiMo_si_initialize.vi, che è un SubVI per motion_control.vi. Converte le voci nelle finestre di dialogo in parametri per movimento. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_4-compute_init_param.vi" target="_blank">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
Supplementare 5 File di codice: SubVI per più Moves_simplified.vi di linea retta, che è un SubVI per motion_control.vi. Converte le voci nelle finestre di dialogo in parametri per movimento. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_5-compute_parameters.vi" target="_blank">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
Complementare codice File 6: SubVI per position_tracker.vi. Spostamento di tracce di contatore input da encoder lineare. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_6-Counter-Continuous_Output.vi" target="_blank">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
File di codice supplementare 7: Base LabVIEW Project. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_7-in_vitro_neurotrauma.lvproj" target="_blank">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
Complementare codice File 8: Top livello VI che sposta il dispositivo di. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_8-motion_control.vi" target="_blank">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
Complementare codice File 9: SubVI per motion_control.vi. Esegue lo spostamento rapido che si estende la piastra. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_9-Multiple_Straight_Line_Moves_simplified.vi" target="_blank">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
Complementare codice File 10: SubVI per motion_control.vi. Esegue lo spostamento lento che si muove il palco. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_10-MuStLiMo_si_initialize.vi" target="_blank">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
Complementare codice File 11: SubVI per motion_control.vi. Traccia una storia di cilindrata (solitamente sottocampionamento) nel pannello di controllo motion_control.vi. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_11-plot_displacement.vi" target="_blank">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
Complementare codice File 12: Top livello VI che registra la cronologia di spostamento. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_12-position_tracker.vi" target="_blank">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
Complementare codice File 13: variabile2 contiene, che comunica tra motion_control.vi e position_tracker.vi. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_13-Untitled_Library_2.lvlib" target="_blank">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
Complementare codice File 14: schematico per circuito stampato. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_14-interconnector_circuit_board.dch" target="_blank">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
Complementare codice File 15: Layout per circuito stampato. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_15-interconnector_circuit_board.dip" target="_blank">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>

Qui presentiamo un metodo per un modello umano in vitro della lesione elasticizzato in un formato a 96 pozzetti su una scala cronologica pertinente all'impatto del trauma. Sono inclusi i metodi per la realizzazione di piastre stretchable, quantificare l'insulto meccanico, coltura e ferendo le cellule, imaging e alto contenuto analisi per quantificare il danno.

Metodo per il pregiudizio elasticizzato ad alta velocità dell'essere umano ha indotto i neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti in un formato a 96 pozzetti

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

L'obiettivo generale di questo modello è quello di creare un fenotipo di neurotrauma clinicamente rilevante in un formato a 96 pozzetti per facilitare il confronto efficiente e simultaneo delle lesioni subite in più condizioni sperimentali. Lo scopo principale di questo modello è quello di consentire screening fenotipici ad alto contenuto per la scoperta di farmaci nei neurotraumi, con neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo. Le piastre utilizzate in questo modello mantengono la geometria standard del settore a 96 pozzetti, mantenendo la loro compatibilità con i macchinari di screening ad alto contenuto esistenti, come i bracci robotici e i microscopi automatizzati.Per iniziare, posiziona una piastra a 96 pozzetti senza fondo con il lato inferiore rivolto verso l'alto all'interno di un pulitore al plasma da 200 watt per 60 secondi ad alta potenza. Quindi, immergere la piastra in 200 millilitri di APTES all'1,5% appena preparato in acqua deionizzata, con il lato inferiore rivolto verso il basso, per 20 minuti in una cappa aspirante. Dopo 10 minuti dall'inizio dell'incubazione, utilizzare una pinza per posizionare una membrana in silicone trattato al plasma sopra un rettangolo di carta pergamena di 7,5 x 11 centimetri e allineare una lastra di alluminio di 7,5 x 11,05 centimetri sulla parte inferiore del morsetto di fabbricazione della piastra.Quindi utilizzare una pinza per allineare la membrana in silicone e la carta da forno sulla lastra di alluminio. Al termine del periodo di rivestimento, rimuovere la piastra senza fondo dal bagno APTES e scrollarsi di dosso la soluzione in eccesso. Immergi il piatto senza fondo in due bagni d'acqua deionizzata consecutivi da 200 millilitri per cinque secondi ogni immersione e scrollati di dosso l'acqua in eccesso.Dopo la completa asciugatura con aria compressa, posizionare la piastra senza fondo nella parte superiore del morsetto di fabbricazione della piastra e chiudere delicatamente il morsetto per premere insieme la piastra senza fondo e il silicone. Per allineare il blocco del penetratore, utilizzare i morsetti del tavolino per fissare la piastra sul tavolino del dispositivo di allungamento sotto una telecamera con un feed live e posizionare una luce a cupola sopra il dispositivo. Avvia il software di controllo dello strumento sul computer collegato al dispositivo per lesioni e fai clic sulla finestra di avvio per eseguire il progetto di neurotrauma in vitro.Dalla finestra del progetto, fare doppio clic sugli strumenti virtuali Motion Control e position tracker. Chiudere la gabbia che circonda il dispositivo di lesione e fare clic sulla freccia nello strumento virtuale di controllo del movimento per far funzionare lo strumento. Fare clic vicino alla parte inferiore per abbassare il tavolino entro due millimetri dal contatto con i penetratori, quindi fare clic su stop per fermare lo strumento virtuale.Nella finestra del progetto, fare clic con il pulsante destro del mouse su Axis One e fare clic su Interactive Test Panel. Immettere 500 unità nel campo Posizione target nella finestra visualizzata per impostare la dimensione del passo su 50 micrometri. Quindi fare clic su Vai ripetutamente, fino a quando la lastra non entra in contatto per la prima volta con eventuali penetratori, verificando la presenza di contatto sull'immagine dal vivo visualizzata dalla telecamera.La posizione verticale del palco sarà riportata in alto a sinistra nella finestra del pannello interattivo di test. Abbassare ulteriormente la piastra fino a quando ogni pozzetto non è entrato in contatto con i penetratori, muovendo la telecamera e il tavolino secondo necessità per visualizzare l'intera lastra. Annotare la posizione verticale del palco quando tutti i montanti sono in contatto e chiudere il pannello di test interattivo.Quindi, eseguire lo strumento virtuale di controllo del movimento e fare clic su Superiore per sollevare il tavolino, utilizzando il pulsante di arresto per arrestare lo strumento virtuale quando il tavolino è in posizione. Aprire lo sportello per disattivare il dispositivo, quindi allentare la vite di sicurezza sull'angolo che è entrato in contatto per primo per abbassare l'angolo e serrare la vite opposta per sollevare l'angolo che ha fatto contatto per ultimo. Ripetere l'abbassamento, l'osservazione e la regolazione del blocco fino a quando la piastra non entra in contatto con tutti i penetratori contemporaneamente.Un attento allineamento del blocco del penetratore è importante per ottenere una lesione uniforme su tutti i pozzetti della piastra. Aprire lo sportello per disattivare nuovamente il dispositivo e inserire le viti di fissaggio nei rispettivi fori sul blocco penetratore. Quindi serrare le viti in posizione e annotare la posizione del tavolino riportata dal pannello di prova interattivo quando la piastra entra in contatto.Per allungare la piastra, modificare il nome del file nel campo Percorso file nello strumento virtuale di controllo della posizione con un nome file univoco e fare clic sulla freccia Esegui. Impostare la profondità e la durata dell'indentazione e i campi Infortunio e Durata infortunio nello strumento virtuale del pannello di controllo del movimento. Con la piastra in posizione zero, eseguire lo strumento virtuale del pannello di controllo del movimento e fare clic su Lesione per far rientrare la piastra.Fare clic su Superiore per spostare il tavolino verso l'alto, fare clic su stop quando la piastra è nella posizione superiore e aprire la porta per disattivare il dispositivo di lesione. Quindi ispezionare la cronologia degli spostamenti dello stadio presentata nello strumento virtuale di tracciamento della posizione per confermare che è stato applicato lo spostamento massimo specificato ed esportare i dati in un programma di fogli di calcolo appropriato. Per valutare l'allungamento della membrana siliconica, dopo il trattamento al plasma, posizionare la lastra su una superficie morbida e adescare la piccola sporgenza su un timbro con inchiostro da un pennarello indelebile.Inserire il timbro nel primo pozzetto da testare e picchiettare per garantire un buon trasferimento dell'inchiostro. Quando tutti i pozzetti sono stati timbrati, posizionare la telecamera ad alta velocità su un supporto a braccio sopra il dispositivo di lesione con l'obiettivo impostato sul più piccolo F-stop numerato in modo che il campo visivo contenga 12 penetratori in una griglia tre per quattro. Con il punto di posizione zero, fare clic sul pulsante di registrazione sul software della fotocamera in modo che legga il trigger e attivare la luce assiale diffusa e brillante.Quindi indentare la piastra come appena dimostrato e spegnere la luce assiale. Per danneggiare una coltura cellulare, aggiungere 100 microlitri di neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo trattati con laminina a ciascun pozzetto della piastra trattata con plasma e lasciare che le cellule si attacchino al fondo della piastra per 15 minuti a temperatura ambiente prima di posizionare la piastra nell'incubatore per colture cellulari. Dopo due o tre giorni di coltura, bloccare la piastra sul tavolino del dispositivo per lesioni e regolare la posizione del coperchio per fissare la piastra senza esporre le colture all'aria ambiente.Quindi, con la piastra nella posizione del punto zero, indentare la piastra come appena dimostrato. Una coltura ottimale illesa avrà pochi o nessun grumo di più di cinque cellule e i neuriti saranno individuali, lunghi, sottili e curvi, con poche o nessuna perlatura. In condizioni ideali, la vitalità delle colture dovrebbe avvicinarsi molto a quella specificata nella scheda tecnica del produttore e le colture su silicone dovrebbero assomigliare a quelle mantenute su substrati di coltura rigidi convenzionali.L'aumento della densità cellulare aumenta il numero e le dimensioni dei grumi che si formano in coltura, mentre l'aumento della concentrazione di laminina in genere contrasta questo effetto. Nelle colture danneggiate con un ceppo di picco del 57%, quattro ore dopo la lesione, i neuriti sono accorciati o mancanti e alcuni hanno perle con agglomerazione dimostrata dalle cellule vitali rimanenti. In particolare, i trattamenti con laminina a dosi più elevate riducono la gravità del danno alle colture cellulari in modo dipendente dalla concentrazione, come evidenziato dall'aumento della lunghezza dei neuriti e della vitalità cellulare nelle colture trattate con laminina a dosi più elevate.Durante il tentativo di questa procedura, è importante considerare i tempi di consegna. Ad esempio, la disintossicazione delle membrane richiede tre giorni e le piastre prodotte devono polimerizzare durante la notte prima dell'uso. Non dimenticare che il dispositivo per lesioni contiene una potente bobina mobile per guidarne il movimento, e si dovrebbe sempre tenersi lontani dal dispositivo quando è attivo e spegnere il dispositivo solo quando il tavolino è al massimo della sua corsa.

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Differenziazione di cellule staminali pluripotenti indotte umane in neuroni su array di microelettrodi

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Quantificazione tridimensionale di spine dendritiche da piramidale neuroni derivate da cellule staminali umane pluripotenti indotte

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Protocollo per la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte dall&#39;uomo in culture miste di neuroni e glia per la sperimentazione della neurotossicità

Questo protocollo descrive una procedura dettagliata per la resuspending e la coltura di neuroni derivati da cellule staminali umane che in precedenza erano differenziati dai progenitori neurali in vitro per più settimane. La procedura facilita i saggi basati sull'imaging di neuriti, sinapsi e marcatori neuronali che esprimono tardivamente in un formato compatibile con la microscopia leggera e lo screening ad alto contenuto.

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