Name: CRISPR-mediata di perdita di funzione di analisi in granuli cerebellari cellule utilizzando nellUtero basati su elettroporazione trasferimento del Gene (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Scopri l'analisi CRISPR di perdita di funzione nelle cellule granulari cerebellari mediante elettroporazione in utero. Questo metodo permette di studiare rapidamente i ruoli genici nello sviluppo cerebellare e nella formazione dei tumori cerebrali.

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Apprezziamo Laura Sieber, Anna Neuerburg, Yassin Harim e Petra Schroeter per assistenza tecnica. Ringraziamo anche la d. ssa K. Reifenberg, K. Dell e P. Prückl per gli interventi utili per gli esperimenti sugli animali presso DKFZ; l'Imaging Core il DKFZ e il centro di formazione immagine di Carl Zeiss in servizi il DKFZ per formazione immagine di microscopia confocale. Questo lavoro è stato supportato dal Deutsche Forschungsgemeinschaft, KA 4472/1-1 (a D.K.).

<ol><li>Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput%2C+High-Resolution+Mapping+of+Protein+Localization+in+Mammalian+Brain+by+In+Vivo+Genome+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by In Vivo Genome Editing.</a> Cell. 165 (7), 1803-1817 (2016).</li>
<li>Zuckermann, M., Hovestadt, V., Knobbe-Thomsen, C. B., Zapatka, M., Northcott, P. A., Schramm, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+CRISPR%2FCas9-mediated+tumour+suppressor+disruption+enables+versatile+brain+tumour+modelling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Somatic CRISPR/Cas9-mediated tumour suppressor disruption enables versatile brain tumour modelling.</a> Nat Commun. 6, 7391(2015).</li>
<li>Chen, F., Rosiene, J., Che, A., Becker, A., LoTurco, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+and+transforming+neocortical+progenitors+by+CRISPR%2FCas9+gene+targeting+and+piggyBac+transposase+lineage+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tracking and transforming neocortical progenitors by CRISPR/Cas9 gene targeting and piggyBac transposase lineage labeling.</a> Development. 142 (20), 3601-3611 (2015).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental biology. 240 (1), 237-246 (2001).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (1), 16-22 (2004).</li>
<li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+in+utero+electroporation%3A+controlled+spatiotemporal+gene+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection.</a> J Vis Exp. (54), (2011).</li>
<li>Kawauchi, D., Taniguchi, H., Watanabe, H., Saito, T., Murakami, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+nucleogenesis+by+precerebellar+neurons%3A+involvement+of+ventricle-directed%2C+radial+fibre-associated+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of nucleogenesis by precerebellar neurons: involvement of ventricle-directed, radial fibre-associated migration.</a> Development. 133 (6), 1113-1123 (2006).</li>
<li>Kawauchi, D., Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+cascade+from+Math1+to+Mbh1+and+Mbh2+is+required+for+cerebellar+granule+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Transcriptional cascade from Math1 to Mbh1 and Mbh2 is required for cerebellar granule cell differentiation.</a> Developmental biology. 322 (2), 345-354 (2008).</li>
<li>Saba, R., Nakatsuji, N., Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+BarH1+confers+commissural+neuron+identity+on+dorsal+cells+in+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mammalian BarH1 confers commissural neuron identity on dorsal cells in the spinal cord.</a> Journal of Neuroscience. 23 (6), 1987-1991 (2003).</li>
<li>Sato, T., Muroyama, Y., Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+gene+expression+in+postmitotic+neurons+by+an+in+vivo+electroporation-based+tetracycline+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Inducible gene expression in postmitotic neurons by an in vivo electroporation-based tetracycline system.</a> J Neurosci Methods. 214 (2), 170-176 (2013).</li>
<li>Kawauchi, D., Ogg, R. J., Liu, L., Shih, D. J. H., Finkelstein, D., Murphy, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+MYC-driven+medulloblastoma+models+from+multiple+embryonic+cerebellar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Novel MYC-driven medulloblastoma models from multiple embryonic cerebellar cells.</a> Oncogene. , (2017).</li>
<li>Feng, W., Kawauchi, D., Korkel-Qu, H., Deng, H., Serger, E., Sieber, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chd7+is+indispensable+for+mammalian+brain+development+through+activation+of+a+neuronal+differentiation+programme%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Chd7 is indispensable for mammalian brain development through activation of a neuronal differentiation programme.</a> Nat Commun. 8, 14758(2017).</li>
<li>Platt, R. J., Chen, S., Zhou, Y., Yim, M. J., Swiech, L., Kempton, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159 (2), 440-455 (2014).</li>
<li>Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Joung, J., Konermann, S., Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., Platt, R. J., Brigham, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+and+transcriptional+activation+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protocols%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening.</a> Nat Protocols. 12 (4), 828-863 (2017).</li>
<li>Cong, L., Ran, F. A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Mashiko, D., Fujihara, Y., Satouh, Y., Miyata, H., Isotani, A., Ikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+mutant+mice+by+pronuclear+injection+of+circular+plasmid+expressing+Cas9+and+single+guided+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA.</a> Scientific Reports. 3, 3355(2013).</li>
<li>Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A. 3rd, Venter, J. C., Merryman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+synthesis+of+the+mouse+mitochondrial+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome.</a> Nature. 7 (11), 901-903 (2010).</li>
<li>Baumgart, J., Baumgart, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortex-%2C+Hippocampus-%2C+Thalamus-%2C+Hypothalamus-%2C+Lateral+Septal+Nucleus-+and+Striatum-specific+In+Utero+Electroporation+in+the+C57BL%2F6+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse.</a> J Vis Exp. (107), e53303(2016).</li>
<li>Martinez, S., Andreu, A., Mecklenburg, N., Echevarria, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+basis+of+cerebellar+development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular basis of cerebellar development.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 7, 18(2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Usando l'elettroporazione exo utero , precedentemente abbiamo segnalato basati su siRNA in vivo analisi funzionali di Atoh1 in una fase iniziale di granuli cerebellari cellulari differenziazione8. A causa di siRNA diluizione/degradazione e l'esposizione di embrioni di fuori della parete uterina, l'analisi fenotipica delle cellule del granello individulamente era limitata a fasi embrionali. Tuttavia, il metodo corrente attivata analisi del fenotipo di animali postnatali.
<p cl...

Malattie del cervello sono una delle più terribili malattie mortali. Risultano spesso dalle mutazioni genetiche e disregolazione successive. Per comprendere i meccanismi molecolari delle malattie del cervello, perenne sforzi per decifrare il genoma dei pazienti umani hanno scoperto una serie di geni causativi potenziali. Finora, sono stati utilizzati modelli animali geneticamente costruiti di germline per in vivo guadagno di funzione (GOF) e perdita di funzione (LOF) analisi di tali geni candidati. Dovuto lo sviluppo accelerato di studi di validazione funzionale, è auspicabile un più fattibile e flessibile in vivo gene sistema di analisi per lo studio della funzione genica.
L'applicazione di un sistema di trasferimento del gene basati su elettroporazione in vivo per lo sviluppo del cervello del mouse è adatto allo scopo. Infatti, parecchi studi usando l'elettroporazione in utero hanno indicato il loro potenziale per condurre analisi funzionali nel cervello in via di sviluppo1,2,3. In realtà, diverse regioni del cervello del mouse, come la corteccia cerebrale4, retina5, diencefalo6, hindbrain7, cervelletto8e del midollo spinale9 stati presi di mira dalla consegna genica somatica approcci, finora.
Infatti, l'espressione genica transitoria mediante elettroporazione in vivo su cervelli embrionali del mouse lungo è stato usato per analisi GOF. Recenti tecnologie di integrazione genomica basata su trasposone ulteriormente abilitata a lungo termine e/o condizionale espressione dei geni di interesse10,11, che è vantaggioso per sezionare la funzione del gene in modo spaziale e temporale durante sviluppo. In contrasto con analisi GOF, analisi LOF sono stato più impegnativo. Mentre è stata eseguita la trasfezione transiente di siRNA e che trasportano shRNA plasmidi, effetti a lungo termine di LOF di geni non sono garantiti a causa di eventuale degradazione degli acidi nucleici esogenicamente introdotti, quali plasmidi e dsRNA. Tuttavia, la tecnologia CRISPR/Cas fornisce un'innovazione nelle analisi di LOF. Geni codificanti proteine fluorescenti (ad es., GFP) o bioluminescente proteine (ad es., luciferasi firefly) sono stato co-trasfettati con CRISPR-Cas9 e sgRNAs di etichettare le cellule esposte a mutazioni somatiche CRISPR-Cas9-mediata. Tuttavia, questo approccio potrebbe avere limitazioni negli studi funzionali su cellule proliferanti, poiché i geni marcatori esogeni sono diluiti e degradati dopo proliferazione a lungo termine. Mentre le cellule trasfettate e loro cellule figlie subiscono CRISPR-indotto mutazioni nel loro genoma, le loro impronte potrebbero perdersi nel tempo. Così, approcci genetici etichettatura sarebbe adatti per superare questo problema.
Recentemente abbiamo sviluppato un metodo basato su CRISPR LOF in cellule cerebellari del granello che subiscono a lungo termine proliferazione durante la loro differenziazione12. Per etichettare geneticamente le cellule transfettate, abbiamo costruito un plasmide che trasportano un sgRNA insieme a Cre e introdusse il plasmide cervelletti di Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP topi13 usando l'elettroporazione nell'utero . A differenza di vettori del plasmide regolare codifica EGFP, questo approccio correttamente etichettato trasfettato granello precursori del neurone (PNL) e loro cellule della figlia. Questo metodo fornisce grande sostegno nella comprensione in vivo funzione dei geni di interesse in cellule proliferanti nello sviluppo normale del cervello e uno sfondo tumore-incline.

<table><tbody><tr><td>Alexa 488 Capra anti-Pollo</td><td>ThermoFisher</td><td>A11039</td><td>Diluizione 1:400</td></tr><tr><td>Alexa 568 Asino anti-Topo</td><td>Life Technologies</td><td>A-10037</td><td>Diluizione 1:400</td></tr><tr><td>Alexa 594 Asino anti-Coniglio</td><td>ThermoFisher</td><td>A21207</td><td>Diluizione 1:400</td></tr><tr><td>Alexa 647 Asino anti-Coniglio</td><td>Life Technologies</td><td>A31573</td><td>Diluizione 1:400</td></tr><tr><td>Alcalino Fosfatasi (FastAP)</td><td>ThermoFisher</td><td>EF0654</td><td></td></tr><tr><td>Banda per autoclave</td><td>Kisker Biotech</td><td>150262</td><td></td></tr><tr><td>BamHI (HF)</td><td>NEB</td><td>R3136S</td><td></td></tr><tr><td>BbsI (FastDigest)</td><td>ThermoFisher</td><td>FD1014</td><td></td></tr><tr><td>Carta da filtro in cellulosa (Whatman)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA10347525</td><td></td></tr><tr><td>Cloth</td><td>Tork</td><td>530378</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale a scansione laser</td><td>Zeiss</td><td>LSM800</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin</td><td>biovision</td><td>7903-1</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>Diluizione 1:1000</td></tr><tr><td>Stampi in plastica monouso (Tissue-Tek Cyromold)</td><td>VWR</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Glutamax</td><td></td><td>ThermoFisher 31966047</td><td></td></tr><tr><td>Siero</td> <td>d'asinoSigma-Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI (HF)</td><td>NEB</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>Electro Square Porator</td><td>BTX</td><td>ECM830</td><td></td></tr><tr><td>Endofree Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Merck</td><td>107017</td><td></td></tr><tr><td>Unguento per gli occhi (Bepanthen)</td><td>Bayer</td><td>81552983</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Merck</td><td>104022</td><td></td></tr><tr><td>Filtro FBS</td><td>ThermoFisher</td><td>10270-016</td><td></td></tr><tr><td>(0,22 &; micro; m)</td><td>Merck</td><td>F8148</td><td></td></tr><tr><td>Imager cellulare fluorescente (ZOE)</td><td>Biorad</td><td>1450031</td><td></td></tr><tr><td>Pinze dritto</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Garza (X100 ES-pads 8f 10 x 10 cm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15387311</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo GFP</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td>diluizione 1:1000</td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master</td><td>Mix NEB</td><td>E2611S</td><td></td></tr><tr><td>Capillare in vetro con filamento</td><td>Narishige</td><td>GD1-2</td><td></td></tr><tr><td>Pad riscaldante</td><td>ThermoLux</td><td>463265 / -67</td><td></td></tr><tr><td>Software di elaborazione delle immagini (ImageJ e Fiji)</td><td>Siringa NIH-Insulina</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>(B. Braun OMNICAN U-100)</td><td>Carl Roth</td><td>AKP0.1</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Zoetis</td><td>TU061219</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina LT Serie III Calibro</td><td>Perkin Elmer</td><td>CLS136331</td><td></td></tr><tr><td>Kalt Aghi da sutura</td><td>Strumenti per la scienza fine</td><td>12050-02</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HIFI HOTSTART READY mix</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK2601</td><td></td></tr><tr><td>Ki67 anticorpo</td><td>Abcam</td><td>ab15580</td><td>Diluizione 1:500</td></tr><tr><td>Light Pointer</td><td>Photonic</td><td>PL3000</td><td></td></tr><tr><td>Penna bloccante liquidi</td><td>Kisker Biotech</td><td>MKP-1</td><td></td></tr><tr><td>Metamizol</td><td></td> <td>WDT-Microgrinder</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Narishige</td><td>EG-45</td><td></td></tr><tr><td>Microiniettore</td><td>Narishige</td><td>IM300</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore per micropipette</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Software per microscopio P-97</td><td></td></tr><tr><td>ZEN</td><td>Zeiss-Filo</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>di sutura in seta non sterile (0,12 mm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-50</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. Compound (Tissue-Tek)</td><td>VWR</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>p27 anticorpo</td><td>BD bioscience</td><td>610241</td><td>diluizione 1:200</td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Roth</td><td>335,3</td><td></td></tr><tr><td>PBS ( 1x)</td><td>Life Technologies</td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-EGxxFP</td><td>Addgene</td><td>50716</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimmina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>pX330 plasmide</td><td>Addgene</td><td>42230</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Kit di estrazione del gel</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Kit di legatura rapida</td><td>NEB</td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>Pinza ad anello</td><td>Strumenti per scienze fini</td><td>11103-09</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini (SuperFrost)</td><td>Software</td><td>ThermoFisher 10417002</td><td></td></tr><tr><td>per biostatistica (Prism 7)</td><td>Software GraphPad,</td> <td>Inc-Spitacid</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>EcoLab</td><td>3003840</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Nikon</td><td>C-PS</td><td></td></tr><tr><td>Sucrosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5016</td><td></td></tr><tr><td>Forbici chirurgiche</td><td>Fine Science Tools</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Forbici chirurgiche con punta smussata</td><td>Fine Science Tools</td><td>14072-10</td><td></td></tr><tr><td>Sutura (Supramid schwarz DS 16, 1.5 (4/0))</td><td>SMI</td><td>220340</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligation Buffer</td><td>NEB</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>Forbici per tessuti Smussato (11,5 cm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14072-10</td><td></td></tr><tr><td>TOP2B anticorpo</td><td>Santa Cruz</td><td>sc13059</td><td>Diluizione 1:200</td></tr><tr><td>Tripsina (2,5 %)</td><td>ThermoFisher</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette con elettrodi a disco da 5 mm e Oslash Platinum</td><td>Xceltis GmbH</td><td>CUY650P5</td><td></td></tr><tr><td>Vaporizzatore</td><td>Dr&auml; gerwerk AG</td><td>GS186</td><td></td></tr></tbody></table>

crispr-mediata di perdita di funzione di analisi in granuli cerebellari cellule utilizzando nell'utero basati su elettroporazione trasferimento del gene

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

Malformazione del cervello è spesso causato da mutazioni genetiche. Decifrare le mutazioni in tessuti derivati dal paziente ha identificato potenziali fattori causali delle malattie. Per convalidare il contributo di una disfunzione dei geni mutati per lo sviluppo della malattia, la generazione di modelli animali che trasportano le mutazioni è un approccio più ovvio. Mentre germline geneticamente modelli murini (GEMM) sono popolari strumenti biologici e mostrano risultati riproducibili, è limitato dal tempo e costi. Nel frattempo, non di germline GEMM consentono spesso esplorare funzione del gene in un modo più fattibile. Poiché alcuni cervello malattie (ad es., tumori cerebrali) sembrano derivare da somatico ma non le mutazioni di germline, modelli di topi chimerici non germinale, in cui convivono le cellule normali e anormali, potrebbero essere utile per analisi rilevanti per la malattia. In questo studio, segnaliamo un metodo per l'induzione di mutazioni somatiche CRISPR-mediata nel cervelletto. In particolare, abbiamo utilizzato il condizionali topi knock-in, in cui Cas9 e GFP sono cronicamente attivati dal promotore CAG (CMV enhancer/pollo ß-actina) dopo Cre-mediata ricombinazione del genoma. La singolo-guida auto-progettata RNAs (sgRNAs) e la sequenza di Cre ricombinasi, sia codificato in un plasmide singolo costrutto, sono stati consegnati in cellule staminali/progenitrici cerebellari in una fase embrionale usando l'elettroporazione nell'utero . Di conseguenza, cellule trasfettate e loro cellule della figlia sono stati etichettati con la proteina fluorescente verde (GFP), facilitando così ulteriori analisi fenotipiche. Quindi, questo metodo è non solo risultati basati su elettroporazione genico in cellule embrionali cerebellare ma anche proponendo un nuovo approccio quantitativo per valutare CRISPR-mediata di fenotipi di perdita-de-funzione.

Per l'analisi funzionale in vivo , è fondamentale per identificare le celle in cui sono stati introdotti geni esogeni. Mentre l'espressione di un marcatore, come GFP in cellule non proliferanti possono essere continuati per un lungo periodo di tempo, il segnale si perde in sequenza nelle cellule proliferanti. Un'illustrazione di questo effetto è dimostrata nella Figura 1. Per ovviare a perdere l'impronta delle cellule transfected nelle analisi di LOF...

Studi convenzionali di perdita di funzione di geni mediante animali knockout sono stati spesso lunghe e costose. Basato su elettroporazione mutagenesi somatica CRISPR-mediata è un potente strumento per capire il gene funziona in vivo. Qui, segnaliamo un metodo per analizzare i fenotipi di knockout in cellule di proliferazione del cervelletto.

CRISPR-mediata di perdita di funzione di analisi in granuli cerebellari cellule utilizzando nell'Utero basati su elettroporazione trasferimento del Gene

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

L'obiettivo generale di questo approccio di trasferimento genico in vivo basato sull'elettroporazione è valutare il ruolo dei geni di interesse nella differenziazione delle cellule dei granuli cerebellari utilizzando analisi di perdita di funzione mediate da CRISPR. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nelle neuroscienze dello sviluppo e nelle neuro-oncologie, come ad esempio per l'identificazione delle molecole importanti per il normale sviluppo cerebellare e la formazione di tumori cerebrali. La procedura di elettroporazione in utero sarà dimostrata dalla Dr.Lena Herbst, post-doc del laboratorio del Professor Peter Lichter, e poi la successiva immunoistochimica sarà eseguita dal Dr.Weijun Feng, un post-doc del laboratorio del Dr.Haikun Di.Il vantaggio principale di questo metodo è quello di cercare di eliminare in modo fattibile i geni di interesse nelle cellule cerebellari, utilizzando le tecnologie CRISPR-cas9, invece della generazione della combinazione di animali knock-out. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle funzioni geniche durante il normale sviluppo cerebellare, può essere applicato anche ad altri sistemi, come lo sviluppo di altre re

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Biologia dello sviluppo

Elettroporazione in utero è un metodo prezioso per trasfezione delle cellule progenitrici neuronali in vivo. A seconda del posizionamento degli elettrodi e la timepoint sviluppo di elettroporazione, alcuni sottoinsiemi di cellule corticali può essere mirati. Cellule bersaglio può quindi essere analizzato in vivo o in vitro per gli effetti di alterazione genetica.

In utero Elettroporazione seguita da primaria Cultura neuronale per studiare la funzione dei geni in sottoinsieme di neuroni corticali

Elettroporazione in utero permette per la consegna rapida in un gene-spazialmente e temporalmente modo controllato nello sviluppo del sistema nervoso centrale (SNC). Qui descriviamo altamente adattabile a protocollo di elettroporazione utero che possono essere usati per fornire costruisce espressione in più domini embrionale del SNC, tra cui il diencefalo telencefalo, e della retina.

Gene consegna efficiente in più territori SNC utilizzo In Utero Elettroporazione

Questo video dimostra la consegna di DNA plasmidico nelle cellule neuronali cerebellari di embrioni murini utilizzando l'elettroporazione in utero. Questo metodo è utile per comprendere la funzione in vivo dei geni nel normale sviluppo cerebrale e i cambiamenti nell'espressione genica delle cellule neuronali durante la progressione tumorale.

Consegna genica basata sull'elettroporazione in utero: una tecnica per iniettare DNA plasmidico nelle cellule cerebellari embrionali di embrioni murini

In questo video, eseguiamo l'elettroporazione di fette di cervelletto di embrioni di pollo con plasmidi genetici reporter. La tecnica facilita la visualizzazione dello sviluppo e della migrazione dei precursori delle cellule granulari per formare uno strato granulare.

Elettroporazione ex vivo di fette cerebellari di embrioni di pollo: un metodo per introdurre il DNA plasmidico che codifica la proteina fluorescente verde per visualizzare lo sviluppo delle cellule granulari

Morfogenesi neuronale e la migrazione sono eventi cruciali alla base un corretto sviluppo del cervello. Qui, descriviamo i metodi per manipolare geneticamente colture di neuroni granulari del cervelletto e del cervelletto in via di sviluppo per la valutazione della morfologia e delle caratteristiche migratorie dei neuroni.

Manipolazione genetica delle cerebellare granuli neuroni<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Per studiare neuronale Morfologia e migrazione

La migrazione dei neuroni è regolata da numerosi fattori autonomi e non cellulari.  Questo protocollo mostra come l'elettroporazione in utero possa essere utilizzata per determinare se un fenotipo in un topo transgenico è dovuto all'interruzione di un meccanismo intrinseco cellulare o alla compromissione dell'interazione tra il neurone e il suo ambiente.

L'induzione di proteine ​​Cancellazione Through In Utero Elettroporazione per definire deficit in migrazione neuronale in modelli transgenici

Lo strato granulare esterno cerebellare è il sito della più grande amplificazione transito nel cervello sviluppo. Qui, vi presentiamo un protocollo di indirizzare la modificazione genetica di questo strato al culmine della proliferazione usando ex vivo elettroporazione e la cultura di fette cerebellare da embrionali Giorno 14 embrioni di pollo.

Ex Cultura Vivo del Chick cerebellare fette e spazialmente mirata elettroporazione di granuli precursori delle cellule

Eterotopia nodulare periventricolare (PNH) è la forma più comune di malformazione dello sviluppo corticale (MCD) nell'età adulta, ma la base genetica rimane sconosciuta nei casi più sporadici. Recentemente abbiamo sviluppato una strategia per identificare nuovi geni candidati per MCDs e confermare direttamente loro ruolo causativo in vivo.

Una nuova strategia che unisce Array-CGH, sequenziamento dell'intero-esoma e nell'Utero elettroporazione in roditori per identificare geni causativi per le malformazioni del cervello

Cella-autonome funzioni dei geni nel cervello possono essere studiate inducendo perdita o guadagno di funzione in popolazioni sparse delle cellule. Qui, descriviamo in utero elettroporazione per consegnare la Cre ricombinasi nelle popolazioni sparse di sviluppare neuroni corticali con floxed geni per causare la perdita di funzione in vivo.

Induzione della ricombinazione di Cre-lox nella corteccia cerebrale del Mouse attraverso elettroporazione In Utero

Qui descriviamo un metodo per visualizzare la sinaptogenesi dei neuroni granuli nel cervelletto del topo nel corso dello sviluppo postnatale del cervello quando queste cellule perfezionano le loro strutture sinaptiche e formano sinapsi per integrarsi nel circuito cerebrale generale.

Utilizzo dell'elettroporazione postnatale in vivo per studiare la morfologia dei granuli cerebellari e lo sviluppo delle sinapsi

Qui, descriviamo una semplice tecnica destinata alla generazione efficiente di topi geneticamente modificati chiamata CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Questo metodo fornisce reagenti di editing mediante elettroporazione negli embrioni con un'efficienza vicina al 100%. Questo protocollo è efficace per mutazioni puntiformi, piccole inserzioni genomiche e delezioni in embrioni di mammifero.

Editing efficiente del genoma dei topi mediante elettroporazione CRISPR degli zigoti

Scopri l'analisi CRISPR di perdita di funzione nelle cellule granulari cerebellari mediante elettroporazione in utero. Questo metodo permette di studiare rapidamente i ruoli genici nello sviluppo cerebellare e nella formazione dei tumori cerebrali.

CRISPR-mediata di perdita di funzione di analisi in granuli cerebellari cellule utilizzando nellUtero basati su elettroporazione trasferimento del Gene (Video) | JoVE Journal

CRISPR-mediata di perdita di funzione di analisi in granuli cerebellari cellule utilizzando nell'Utero basati su elettroporazione trasferimento del Gene

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