CRISPR-mediata di perdita di funzione di analisi in granuli cerebellari cellule utilizzando nell'Utero basati su elettroporazione trasferimento del Gene

L'obiettivo generale di questo approccio di trasferimento genico in vivo basato sull'elettroporazione è valutare il ruolo dei geni di interesse nella differenziazione delle cellule dei granuli cerebellari utilizzando analisi di perdita di funzione mediate da CRISPR. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nelle neuroscienze dello sviluppo e nelle neuro-oncologie, come ad esempio per l'identificazione delle molecole importanti per il normale sviluppo cerebellare e la formazione di tumori cerebrali. La procedura di elettroporazione in utero sarà dimostrata dalla Dr.Lena Herbst, post-doc del laboratorio del Professor Peter Lichter, e poi la successiva immunoistochimica sarà eseguita dal Dr.Weijun Feng, un post-doc del laboratorio del Dr.Haikun Di.

Il vantaggio principale di questo metodo è quello di cercare di eliminare in modo fattibile i geni di interesse nelle cellule cerebellari, utilizzando le tecnologie CRISPR-cas9, invece della generazione della combinazione di animali knock-out. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle funzioni geniche durante il normale sviluppo cerebellare, può essere applicato anche ad altri sistemi, come lo sviluppo di altre regioni fisiche del cervello e la modellazione del tumore cerebrale. Inizia caricando un capillare di vetro borosilicato in un estrattore per micropipette e tirando per creare una punta fine.

Etichettare la punta capillare con inchiostro nero per una migliore visualizzazione durante l'iniezione e tracciare una scala sul vetro. Lavorando al microscopio stereomicroscopio, usa un righello e una pinzetta ad ago affilata per tagliare la punta a una lunghezza di circa sei millimetri e creare un bordo smussato affilato e unilaterale. Filtrare una soluzione madre verde veloce all'1% attraverso un filtro a punto zero da 22 micron per rimuovere le particelle di colorante dalla soluzione.

Mescolare i plasmidi di RNA a guida singola in parti uguali con il plasmide reporter della luciferasi fino a una concentrazione finale di almeno un microgrammo per millilitro per ciascun plasmide. Colorare la soluzione plasmidica con verde veloce a una concentrazione finale dello 0,5%Dopo aver anestetizzato un topo CD-1 gravido con isoflurano, posizionare il topo sul dorso su un termoforo e somministrare un analgesico. Applicare un unguento per gli occhi per prevenire la secchezza oculare durante l'intervento chirurgico.

Fissare la lente con del nastro adesivo e sterilizzare l'addome con un disinfettante. Coprire il topo con una garza, lasciando esposta solo l'area chirurgica. Dopo aver praticato un'incisione cutanea di circa due centimetri di lunghezza, individuare la linea alba e utilizzare le forbici per tessuti a punta smussata per praticare una seconda incisione leggermente più piccola attraverso il peritoneo.

Inumidire la cavità addominale aperta con PBS sterile preriscaldato. Quindi, usa una pinza ad anello per estrarre con cura le corna uterine dalla cavità addominale. Afferrare la parete uterina nello spazio tra le sacche vitellino di due embrioni vicini e tirare delicatamente.

Evitare qualsiasi pressione sull'embrione mentre lo si tira attraverso l'incisione. Una volta estratte le corna uterine, aspirare circa 10-15 microlitri di soluzione plasmidica colorata con il capillare di vetro preparato. Evitare bolle d'aria durante questo processo.

Tenere delicatamente l'embrione con una pinza ad anello e individuare la zona del collo. Penetra lentamente nel rombencefalo dorsale con la punta del capillare di vetro e spostati nel quarto ventricolo. Iniettare circa un microlitro della miscela plasmidica.

Conferma che il DNA colorato non è fuoriuscito dal cervello ed è visibile come una struttura a forma di diamante. Qui è molto importante riempire l'intera regione del quarto ventricolo con una soluzione plasmidica, per consegnare il DNA anche alla parte distale del primordio cerebellare. Allo stesso tempo, assicurati di non causare sanguinamento durante questo processo.

Posizionare una pinzetta di platino, dotata di piastre elettrodiche di cinque millimetri di diametro lateralmente sopra la testa dell'embrione, con il polo negativo che copre l'orecchio e il polo positivo posizionato in corrispondenza del primordio cerebellare sopra la parete uterina, e applicare impulsi quadrati elettrici. Quando tutti gli embrioni sono stati elettroporizzati, riposizionare con cura le corna uterine nella cavità addominale e riempirle con PBS sterile. Lascia che le corna uterine scivolino in una posizione naturale.

Disattiva l'anestesia e metti l'animale a pancia in giù in una nuova gabbia per riprendersi. Prima della criosezione, fissare il cervelletto durante la notte in cinque millilitri di PFA al 4% in PBS per cervello, a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, trasferire il cervelletto fisso a dieci millilitri di saccarosio al 30% in PBS per cervello e incubare per una notte a quattro gradi Celsius.

Il giorno seguente, dopo che il tessuto è affondato sul fondo della provetta, rimuovere il cervello dal saccarosio e immergere la soluzione di saccarosio rimanente con un pezzo di carta da filtro di cellulosa. Quindi, immergere ogni cervelletto in un composto per la temperatura di taglio ottimale in uno stampo di plastica usa e getta e congelare su ghiaccio secco. Tagliare il blocco criogenico in sezioni spesse 10 micron, utilizzando un criostato, e mantenere le sezioni a meno 80 gradi Celsius fino all'uso.

Quando si è pronti per procedere all'immunocolorazione, asciugare prima i vetrini a temperatura ambiente per 30 minuti, quindi lavare due volte per 10 minuti ogni volta in PBS. Cerchiare le sezioni con una penna bloccante per liquidi e incubare le sezioni in soluzione bloccante per un'ora a temperatura ambiente. Aggiungere anticorpi primari contro le molecole di interesse nella soluzione bloccante e incubare per una notte a quattro gradi Celsius.

Lavare i vetrini con Tritone allo 0,1% contenente PBS tre volte per 10 minuti ciascuno. Quindi aggiungere un anticorpo secondario coniugato con fluoroforo diluito in una soluzione bloccante contenente DAPI, e incubare le sezioni per un'ora a temperatura ambiente al buio. Lavare i vetrini in PBS-T tre volte per 10 minuti ogni volta, quindi montare i vetrini e mantenerli a quattro gradi Celsius fino all'imaging.

Le cellule hek293T che esprimono stabilmente Streptococco pyogenes Cas9 sono state trasfettate con plasmidi che esprimono e hanno come bersaglio sgRNA. L'espressione di GFP nelle cellule vive è stata monitorata utilizzando un imager cellulare fluorescente 48 ore dopo la trasfezione. Questa immagine mostra una sequenza di sgRNA affetta basata sull'espressione di GFP.

Questa immagine mostra la mancanza di espressione di GFP derivante da una sequenza di sgRNA non efficace. Queste immagini mostrano l'immunocolorazione di GFP, Ki67 e p27 nel cervelletto da un topo knock-in p7-rosa26-LSL-cas9 con cassetta stop floxed e sequenze bicistronic cas9 e EGFP a valle, che è stato sottoposto a elettroporazione a E13.5 con un plasmide Cre che esprime sgRNA di controllo. La sezione è controcolorata con DAPI.

Si noti le cellule che esprimono GFP nello strato esterno di cellule granulari contrassegnate da Ki67. Una volta padroneggiato, questo intervento chirurgico può essere eseguito in meno di 30 minuti per topo. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di maneggiare l'embrione con molta attenzione, di utilizzare sempre capillari a punta affilata e di posizionare gli elettrodi nell'angolo preciso per garantire l'erogazione degli impulsi elettrici al tetto del quarto ventricolo.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle scienze mediche per esplorare i fattori causali dei disturbi neurologici, compresi i tumori cerebrali nel cervelletto del topo.