Gel-seq: Un metodo per la preparazione di libreria simultanea di sequenziamento del DNA e RNA utilizzando matrici di idrogel

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di generare librerie di sequenziamento di nuova generazione sia dal DNA che dall'RNA di piccole popolazioni di cellule senza dividere il campione in nessun punto. Questo metodo fornisce ai ricercatori un nuovo approccio per studiare le variazioni strutturali del DNA sull'espressione dei geni. Quando abbiamo pensato per la prima volta a Gel-seq, non esistevano protocolli per sequenziare simultaneamente sia il DNA che l'RNA dallo stesso campione.

Fortunatamente, ora ci sono tre approcci pubblicati che risolvono questo problema. Il vantaggio principale di questa tecnica è che sia le informazioni genomiche che quelle trascrittomiche possono essere ottenute dallo stesso insieme di cellule con un costo aggiuntivo trascurabile. Gel-seq è stato originariamente sviluppato con cassette verticali, tuttavia, questo protocollo può essere adattato per funzionare con qualsiasi cassetta standard per elettroforesi su gel.

Preparare le miscele di riempitivi, precursori ad alta densità e a bassa densità in tre provette. Aggiungere i reagenti nell'ordine descritto e agitare la miscela. Non aggiungere prematuramente né APS né Temed.

Attendi fino a quando non viene indicato. Successivamente, degassare ogni soluzione di monomero in gel inserendo prima un ago attraverso il cappuccio. Quindi collegando l'ago a una linea del vuoto domestica e immergendo questo gruppo in un bagno ultrasonico.

Attendere circa un minuto fino a quando non emergono più bolle dal liquido. Successivamente, alla miscela di precursori del riempitivo, aggiungere il Temed e l'APS e agitare brevemente. Entro tre minuti, utilizzare una pipetta da un millimetro per aggiungere sei millimetri a ciascuna cassetta di gel senza fuoriuscire.

Assicurarsi che il fluido sia in piano posizionando le cassette in posizione verticale su un tavolo livellato. Quindi, rabboccare gradualmente le cassette con acqua degassata e ionizzata, facendo attenzione a ridurre al minimo la miscelazione della miscela polimerizzante con l'acqua. Quindi, lasciare indurire il polimero per un'ora o tutta la notte.

Una volta che il polimero è indurito, scarica la copertura d'acqua e da sei pollici di distanza usa un leggero flusso di aria compressa per asciugare la superficie del gel. Quindi, aggiungere Temed e APS al precursore del gel ad alta densità e agitare brevemente. Entro tre minuti, trasferisci 320 microlitri in ciascuna cassetta e distribuiscilo sullo strato di gel riempitivo facendo oscillare la cassetta avanti e indietro alcune volte.

Quindi, rabboccare le cassette con acqua deionizzata e degassata e lasciare indurire il polimero per circa un'ora. Una volta indurito, asciugare il polimero come prima. Infine, aggiungere Temed e APS alla miscela di precursori del gel a bassa densità e vortice.

Quindi, riempi rapidamente il resto delle cassette con questa miscela e inserisci i pettini di gel prima che inizi a polimerizzare. A questo punto, aggiungere l'eccesso di precursore di riserva sul pettine da adsorbire durante la polimerizzazione. Dopo l'indurimento, la cassetta è pronta per l'uso.

Dopo aver convertito l'RNA in cDNA, utilizzare un gel per recuperare la frazione di interesse. Innanzitutto, pulire accuratamente la camera di elettroforesi utilizzando diversi millilitri di un prodotto per la rimozione del DNA e un panno privo di lanugine. Quindi, riempire la camera con XTBE pulito e zero virgola cinque e posizionare l'intero apparato in un forno a reticolazione UV a 254 nanometri e sterilizzare per 15 minuti.

Ora, inserisci una cassetta Gel-seq nella camera di elettroforesi e bloccala in posizione. Quindi, rimuovere lentamente il pettine in gel tirando delicatamente verso l'alto senza strappare il gel. A questo punto, caricare i campioni utilizzando una pipetta.

Inserire completamente la punta nei pozzetti durante il caricamento dei campioni per ridurre al minimo la possibilità di contaminazione tra i pozzetti. Applicare un campo elettrico di 250 volt attraverso la cassetta Gel-seq per 30 minuti per separare il gDNA dagli ibridi cDNA/RNA. Dopo aver caricato, eseguito e raccolto il gel, utilizzare un bisturi per tagliare il gel a metà appena sotto lo strato ad alta densità e scartare la metà del gel di riempimento.

Quindi, staccare delicatamente il gel rimanente dalla cassetta facendo un uso attento di uno strumento raschiante. Dopo aver verificato la separazione con un gel doc, utilizzare un transilluminatore per asportare le bande. Il gDNA dovrebbe essere localizzato all'inizio del gel a bassa densità e il cDNA dovrebbe essere all'interfaccia delle regioni a bassa e alta densità.

Ora, usa un bisturi per ritagliare le regioni del gel contenenti gDNA e cDNA. Rimuovere anche le stesse sezioni dalla corsia di controllo negativa. Usando una pinzetta smussata, trasferisci delicatamente le sezioni del gel in tubi a strisce.

Se il gel si rompe, trova e trasferisci tutti i pezzi rotti nel tubo. Quindi, macinare ogni gel con movimenti circolari e premendo con la punta di una pipetta. Prima di rimuovere le punte, aggiungere 40 microlitri di acqua priva di nucleasi al gDNA e 80 microlitri ai campioni di cDNA.

Quindi, rimuovere con cura e gettare le punte. Ora, fissa i tubi a spirale in un miscelatore a vortice a 37 gradi Celsius e agitali per otto-12 ore. Il DNA sfuggirà quindi al gel.

Dopo l'agitazione, pipettare i campioni in una piastra filtrante a maglie da otto micron. Quindi, centrifugare la piastra a 2.600 g per cinque minuti per filtrare i frammenti di gel. Quindi, sollevare la piastra filtrante a rete dalla piastra di alloggiamento e utilizzare una pipetta per trasferire i campioni privi di gel dalla piastra a nuove provette a strisce da 200 microlitri.

A ciascun campione contenente gDNA, aggiungere un microlitro di proteasi e pipettare su e giù per mescolare bene. Quindi, incubare i campioni a 50 gradi Celsius per 15 minuti. Seguire con un'attivazione del riscaldamento a 70 gradi Celsius per 15 minuti.

Questa fase di deplezione dei nucleosomi è fondamentale. Quindi, utilizzare un ago calibro 18 per praticare un foro nel tappo di ogni provetta del campione. Quindi, utilizzare un vuoto per ridurre i campioni di gDNA a cinque microlitri e i campioni di cDNA a 10 microlitri.

Se il volume scende al di sotto del bersaglio, aggiungere acqua priva di nucleasi secondo necessità. Gli ibridi gDNA e cDNA/RNA sono stati fisicamente separati utilizzando il dispositivo Gel-seq. Il controllo negativo non ha autofluorescenza del gel alle interfacce.

Le scale di DNA mostrano solo una banda scura all'interfaccia tra le membrane a bassa e alta densità, rivelando che piccoli frammenti possono passare attraverso il gel a bassa densità. Un campione biologico di 500 cellule PC3 mostra la separazione desiderata di DNA genomico e ibridi cDNA/RNA. Una banda scura nella parte superiore della membrana a bassa densità è costituita da DNA genomico su scala megabase, mentre gli ibridi cDNA/RNA sono impilati all'interfaccia delle regioni a bassa e alta densità.

I piccoli frammenti di coppie di basi inferiori a 100 sono prodotti fuori bersaglio generati da oligonucleotidi primer durante la trascrizione inversa e sono prevedibili. Le librerie sono state generate da 500 celle PC3 o 750 celle HeLa. Le distribuzioni dei frammenti delle librerie abbinate generate da Gel-seq sono state confrontate con campioni non corrispondenti generati con protocolli standard.

La distribuzione dei frammenti nucleotidici era simile con entrambi i metodi. I risultati del sequenziamento della libreria cellulare PC3 sono stati confrontati con i metodi tradizionali. Sono state confrontate le variazioni del numero di copie a livello di genoma.

Statisticamente, i due metodi hanno ottenuto risultati simili. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare librerie di sequenziamento accoppiate di nuova generazione sia per il DNA che per l'RNA dallo stesso campione di partenza. Come per qualsiasi esperimento di sequenziamento a basso input, è imperativo ricordare di mantenere un ambiente di lavoro pulito.

È necessario prestare molta attenzione alla sterilizzazione dei tubi e ai guanti per la pulizia. Anche con queste precauzioni, gli esperimenti a volte falliscono a causa della contaminazione. Una nota importante, l'ubiquità e la sicurezza dei gel di poliacrilammide rendono facile dimenticare che i precursori di fabbricazione sono pericolose neurotossine.

Dovresti sempre lavorare con questi reagenti in una cappa aspirante e pulire immediatamente eventuali fuoriuscite. Abbiamo progettato Gel-seq in modo che sia semplice da implementare per i ricercatori nei propri laboratori e speriamo che questo faciliti la rapida adozione di questa tecnologia.