Caratterizzazione di cellule immunitarie nel tessuto adiposo umano mediante citometria a flusso

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di utilizzare la citometria a flusso per isolare la frazione vascolare stromale dal tessuto adiposo umano per la fenotipizzazione delle diverse popolazioni di cellule immunitarie presenti all'interno del tessuto adiposo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella ricerca metabolica, come ad esempio quali cellule immunitarie si accumulano nel tessuto adiposo di individui obesi e in che misura. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la misurazione simultanea di più marcatori sulle cellule immunitarie e l'identificazione e la quantificazione di queste cellule immunitarie nel tessuto adiposo.

Sebbene questa tecnica possa fornire informazioni cruciali sull'infiammazione del tessuto adiposo, può essere applicata anche ad altri organi e tessuti. In generale, gli individui nuovi a questa tecnica lotteranno principalmente con la contaminazione delle cellule vascolari stromali e la perdita di cellule durante la procedura di colorazione. Due dei miei candidati al dottorato, Suzan Wetzels e Mitchell Bijnen, eseguiranno il protocollo.

Inizia usando un bisturi per tritare un grammo di biopsia del tessuto adiposo in pezzi quadrati di circa due millimetri. Trasferire i pezzi in una provetta da centrifuga da 50 millilitri e aggiungere 10 millilitri di soluzione di collagenasi ai campioni. Incubare i frammenti di tessuto per 60 minuti in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius a 60 cicli al minuto.

Segue la filtrazione attraverso un filtro da 200 micrometri in un nuovo tubo conico da 50 millilitri. Sciacquare il filtro con sette millilitri di PBS prima della centrifugazione. Quindi utilizzare una pipetta per rimuovere il surnatante senza immergere l'intero puntale della pipetta nella soluzione.

Il pellet deve essere chiaramente visibile e rimuovere quasi tutto il surnatante per evitare la contaminazione della frazione vascolare stromale con cellule adipose. Sospendiamo il pellet di cellule vascolari stromali con cinque millilitri di PBS fresco e filtriamo la frazione vascolare stromale attraverso un colino da 70 micrometri in un nuovo tubo. Dopo la centrifugazione, sospendiamo il pellet della frazione vascolare stromale lavato in tre millilitri di tampone di lisi eritrocitaria per cinque minuti su ghiaccio.

Quindi arrestare la lisi con sette millilitri di PBS e pellettare le cellule mediante centrifugazione. Per colorare la frazione vascolare stromale per l'analisi citofluorimetrica, risospendere il pellet in 90 microlitri di smistamento cellulare attivato da fluorescenza a quattro gradi Celsius, o tampone FACS, e bloccare la colorazione non specifica con dieci microlitri di IgG umane. Dividere la sospensione cellulare tra due pozzetti di una piastra con fondo a V a 96 pozzetti e porre le cellule sul ghiaccio per 15 minuti.

Al termine dell'incubazione, lavare ogni campione con 100 microlitri di tampone FACS, capovolgendo la piastra con un movimento fluido senza picchiettare per scartare i surnatanti al termine della centrifugazione. Assicurati di poter vedere chiaramente il pellet nella parte inferiore della piastra prima di capovolgerla per evitare la perdita delle cellule durante la procedura. Risospendere il primo pellet in 29,5 microlitri di cocktail di anticorpi per il primo pannello FACS e il secondo pellet in 23 microlitri di cocktail di anticorpi per il secondo pannello FACS.

Dopo 30 minuti di ghiaccio al buio, lavare le celle con 150 microlitri di tampone FACS per pozzetto e fissare i pellet cellulari in 150 microlitri di soluzione di formaldeide all'uno per cento. Trasferire le sospensioni cellulari da ciascun pozzetto nelle provette FACS corrispondenti e porre i campioni sul ghiaccio. Prima dell'analisi, caricare un controllo negativo non colorato sul citometro a flusso per impostare i parametri di dispersione diretta e laterale.

Quindi regolare le tensioni del citometro a flusso secondo le istruzioni del produttore fino a quando tutte le popolazioni di interesse sono visibili nei grafici di dispersione diretta e laterale e si può fare una distinzione tra i detriti e le cellule vive. Quando tutti i parametri sono stati impostati, agitare il primo campione sperimentale a 800 giri/min per risospendere completamente le cellule e caricare il campione sul citometro. Leggere un minimo di 50.000 eventi nel live gate, quindi vorticare e caricare il secondo campione per l'analisi come appena dimostrato.

Per consentire l'analisi delle popolazioni di macrofagi del tessuto adiposo in questo esperimento rappresentativo, sono state escluse altre cellule immunitarie, come le cellule T, le cellule B, i neutrofili e le cellule natural killer per rivelare la presenza di CD11b+CD11c+macrofagi, CD11B+CD11C-macrofagi e CD11Blow-CD11C+cellule dendritiche. La quantificazione della principale intensità di fluorescenza di queste cellule ha rivelato l'espressione delle cellule dendritiche citoidi plasmatiche e dei marcatori generici delle cellule dendritiche sulle cellule CD11B+CD11C+ e CD11Blow-CD11C+, con una maggiore espressione di entrambi i marcatori osservata sulle cellule CD11Blow-CD11C+, confermando che le cellule CD11Blow-CD11C+ erano in realtà cellule dendritiche. Il gating delle cellule CD45 positive ha rivelato popolazioni di cellule T B CD19 positive e CD3 positive, queste ultime potrebbero essere ulteriormente suddivise in CD3+CD4+T helper, e CD3+CD8+cellule T citotossiche, e CD3-CD56+cellule natural killer.

Per ciascun soggetto è stata quindi calcolata la percentuale di cellule immunitarie vitali, rivelando un aumento significativo della percentuale di macrofagi pro-infiammatori CD11B+CD11C+ nel tessuto adiposo viscerale di soggetti maschi adulti obesi. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita entro quattro ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante mantenere i tamponi e le frazioni cellulari sul ghiaccio e, durante l'etichettatura delle cellule con gli anticorpi, è molto importante tenerle al buio.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha permesso ai ricercatori nel campo della ricerca metabolica di esplorare le alterazioni delle cellule immunitarie nel tessuto adiposo degli esseri umani. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare le cellule immunitarie del tessuto adiposo e come eseguire la citometria a flusso su queste cellule. Tieni presente che stai lavorando con materiale e sostanze umane potenzialmente infettive, come la formaldeide, che possono essere pericolose.

Prendere sempre le precauzioni indossando guanti e occhiali di sicurezza.