Name: Uno Screening basati su cellule dellisolotto pancreatico murino per prodotti chimici ambientali diabetogeni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Impara a isolare le cellule dell'isolotto pancreatico murino per screening di sostanze chimiche che inducono ROS. Questo metodo consente di identificare potenziali xenobiotici diabetogeni e analizzarne gli effetti sulla secrezione di insulina stimolata dal glucosio.

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Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione di progetto pilota da CREH centro sponsorizzato dal NIEHS e dalla Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina (No. 31572626).

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con tutte le pertinenti linee guida, regolamenti e agenzie di regolamentazione. Il protocollo in questione è stato effettuato sotto la guida e l'approvazione del istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della Texas A & M. Istituto per la medicina genomica.
1. soluzione preparazione
<ol><li>Diluire la soluzione salina bilanciata di Hank di 10 x 1 x con doppio distillata H2O e conservare a 4 ° C.</li>
	<li>Preparare la soluzione di isolamento aggiungendo HEPES (10 mM), MgCl2 (1 mM) e glucosio (5 mM). Regolare il pH a 7,4 e tenere sul ghiaccio.</li>
	<li>Preparare la soluzione di collagenasi da collagenasi tipo 4. Nota: In particolare, collagenasi tipo 4 contiene 160 U per mg di peso a secco. 1 g di collagenasi tipo 4 è diluito in 5 mL doppio distillata H2O con una concentrazione di 200 mg/mL. 2 mL della collagenosi diluita viene aggiunto alla soluzione di isolamento freddo ghiaccio 30 mL e 6 mL di soluzione di collagenasi viene trasferito in una provetta 50 mL per ogni mouse.</li>
	<li>Preparare la soluzione di lavaggio aggiungendo 1 mM CaCl2 per la soluzione di isolamento.</li>
	<li>Preparare la soluzione di purificazione con soluzione di sodio polysucrose freddo diatrizoate (1,1119 g/mL, 5 mL).</li>
	<li>Preparare 500 mL di terreno di coltura dell'isolotto con l'aggiunta di L-Glutammina (20 mM), penicillina (100 U/mL), streptomicina (100 µ g/mL) e siero bovino fetale (FBS) (10%) nel medium RPMI.</li>
	<li>Preparare la soluzione di riserva di DCFH-DA sciogliendo la polvere in acqua distillata a 200 µM e conservare a-20 ° C. Nota: Il ROS macchiatura soluzione viene preparato diluendo la soluzione di riserva di DCFH-DA alla concentrazione finale di 5 µM in RPMI. Questo reagente dovrebbe essere protetto dalla luce.</li>
</ol>2. preparazione chirurgica
<ol><li>Iniettare per via intraperitoneale (I.P.) un mouse con avertin (2,5% avertin, 0,4 mL/20 g). Dopo che il mouse è completamente anestetizzato e non risponde più a posteriori del piede pizzichi, eutanasia il mouse e spostare la cappa biologica.</li>
	<li>Posizionare il mouse eutanasizzato col lato addominale rivolto verso l'alto e spruzzare sulla pelle con etanolo al 70% per la sterilizzazione.</li>
	<li>Aprire la cavità addominale con un 1 cm U-incisione sulla parte superiore dell'addome e ritrarre la pelle in direzione rostrale sopra la cassa per esporre la cavità addominale.</li>
</ol>3. rimozione e l'aspersione del pancreas
<ol><li>Come illustrato nella Figura 1, trovare la posizione del ampulla. Utilizzare un paio di pinze curve per serrare il duodeno vicina alla posizione dello sfintere di Oddi. Utilizzare un altro paio di pinzetta per serrare la parete del duodeno per bloccare la via biliare nel duodeno. Nota: L'ampolla non è stata inserita in questo passaggio. Questo passaggio è destinato a bloccare la via biliare nel duodeno.</li>
	<li>Riposizionare il mouse con la testa prossimale e distale per quanto riguarda il ricercatore piedi.</li>
	<li>Trovare il dotto biliare comune e iniettare lentamente 3 mL di soluzione della collagenosi con una siringa di ago e 5 mL di 30 G. Assicurarsi che il dotto biliare comune e il pancreas sono gonfiati dopo l'iniezione.</li>
	<li>Rimuovere il pancreas dilatato usando la pinzetta e forbice per separarla da discendente del colon, intestino, stomaco e milza. Posizionare il pancreas in un tubo da 50 mL contenente 3 mL di soluzione di collagenasi e tenerlo sul ghiaccio.</li>
</ol>4. pancreas digestione
<ol><li>Collocare ciascuna provetta da 50 mL in bagnomaria a 37 ° C. Incubare per 15-20 minuti (il tempo varia con lo sforzo e l'età dei topi).</li>
	<li>Vibrare il tubo con un vortex.</li>
	<li>Girone 4-5 pancreas digerito in un colino grande lavandino sterile e utilizzare una paletta per rendere il pancreas cadere a pezzi accuratamente. Utilizzare una siringa di ago e 10ml 23g contenente la soluzione di lavaggio per pipettare con forza le cellule digerite fuori dallo schermo. Raccogliere la soluzione di lavaggio in un tubo da 50 mL.</li>
	<li>Centrifugare le provette a 97 x g a 4 ° C per 1 min e decantare il supernatante.</li>
	<li>Aggiungere 25 mL di soluzione di lavaggio in provette e risospendere il tessuto delicato nel Vortex. Rotazione verso il basso i tessuti a 97 x g a 4 ° C per 1 min e decantare il supernatante. Ripetere per 3 volte. Fare attenzione a non spostare il tessuto pellettato.</li>
</ol>5. purificazione degli isolotti
<ol><li>Aggiungere 10 mL di soluzione di purificazione al pellet di tessuto lavato e Risospendere delicatamente il contenuto.</li>
	<li>Sovrapposizione delicatamente 5 mL di soluzione di isolamento sulla soluzione di purificazione. Prestare attenzione a mantenere un'interfaccia liquida tagliente tra le due soluzioni.</li>
	<li>Centrifugare la provetta a 560 x g a 4 ° C per 15 min con accelerazione lenta e senza freno. Inserire la pipetta nell'interfaccia e raccogliere lo strato di isolotti in nuove provette da 50 mL.</li>
	<li>Lavare gli isolotti come descritto al punto 3.5.</li>
</ol>6. placcatura e trattamento delle cellule dell'isolotto
<ol><li>Risospendere le isolette in 10 mL di soluzione di cultura di isolotti, delicatamente mescolare bene e mettere 100 µ l/pozzetto con una pipetta multicanale per una piastra a 96 pozzetti. Posizionare bene circa 5 isolotti a 96.</li>
	<li>Posizionare la piastra nell'incubatore coltura tissutale per 12 h.</li>
	<li>Centrifugare (112 x g) la piastra a 96 pozzetti e rimuovere il terreno di coltura.</li>
	<li>Diluire i prodotti chimici ambientali nel terreno di coltura di isolotti. Aggiungere 100 µ l di ciascuno dei diluenti chimici in pozzetti separati della piastra. Risospendere le isolette in ogni pozzetto e incubare per 12 ore a 37 ° C (la concentrazione varia per i diversi prodotti chimici ambientali).</li>
</ol>7. ROS macchiatura e misurazione
<ol><li>Dopo il trattamento di isolotti, lavare con PBS 1X (200 µ l per ogni 96 pozzetti). Nota: La concentrazione delle sostanze chimiche è come segue: AFB1: 3 µM, atrazina: 100 µM, BaP: 10 µM, BPA: 100 µM, β-estrogeno, PCB126: 10 µM, nonilfenolo e BPA: 100 µM.</li>
	<li>Utilizzare N-acetil cisteina (NAC) come antiossidante per placare ROS. Aggiungere 5 mM di NAC per i diluenti chimici indotta da ROS e incubare per 12 ore a 37 ° C.</li>
	<li>Centrifugare la piastra a 96 pozzetti a 112 x g e incubare con soluzione di 5 µM di sonda fluorescente (H2-DCFH-DA dissolto nei media RPMI) a 37 ° C per 60 min.</li>
	<li>Lavare le cellule dell'isolotto trattate 3 volte con PBS e misurare la fluorescenza con un lettore di micropiastre a 488 nm. Nota: L'accumulo di DCF in cellule può essere misurata tramite un aumento nella fluorescenza a 530 nm quando il campione è eccitato a 488 nm.</li>
	<li>Eseguire il glucosio-stimolata dell'insulina secrezione (GSIS) dosaggio9 su xenobiotici che inducono ROS trattati isolette e isolotti non trattati per misurare gli effetti degli xenobiotici sulla funzione fisiologica degli isolotti pancreatici.</li>
</ol>

<ol><li>Maruthur, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growing+prevalence+of+type+2+diabetes%3A+increased+incidence+or+improved+survival%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Current+diabetes+reports%22%5BJournal%5D)">The growing prevalence of type 2 diabetes: increased incidence or improved survival?</a> Current diabetes reports. 13 (6), 786-794 (2013).</li>
<li>Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+have+a+causal+role+in+multiple+forms+of+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance.</a> Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).</li>
<li>Ma, Z. A., Zhao, Z., Turk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+beta-cell+failure+in+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Diabetes+Res%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and beta-cell failure in type 2 diabetes mellitus.</a> Exp Diabetes Res. , 703538(2012).</li>
<li>Valavanidis, A., Vlahogianni, T., Dassenakis, M., Scoullos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biomarkers+of+oxidative+stress+in+aquatic+organisms+in+relation+to+toxic+environmental+pollutants%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+and+environmental+safety%22%5BJournal%5D)">Molecular biomarkers of oxidative stress in aquatic organisms in relation to toxic environmental pollutants.</a> Ecotoxicology and environmental safety. 64 (2), 178-189 (2006).</li>
<li>Robertson, R. P., Harmon, J., Tran, P. O., Tanaka, Y., Takahashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+toxicity+in+%CE%B2-cells%3A+type+2+diabetes%2C+good+radicals+gone+bad%2C+and+the+glutathione+connection%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Glucose toxicity in β-cells: type 2 diabetes, good radicals gone bad, and the glutathione connection.</a> Diabetes. 52 (3), 581-587 (2003).</li>
<li>Kaneto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+induces+p21+expression+in+pancreatic+islet+cells%3A+possible+implication+in+beta-cell+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress induces p21 expression in pancreatic islet cells: possible implication in beta-cell dysfunction.</a> Diabetologia. 42 (9), 1093-1097 (1999).</li>
<li>Maechler, P., Jornot, L., Wollheim, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+peroxide+alters+mitochondrial+activation+and+insulin+secretion+in+pancreatic+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Hydrogen peroxide alters mitochondrial activation and insulin secretion in pancreatic beta cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (39), 27905-27913 (1999).</li>
<li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+palmitate+on+hepatic+insulin+resistance+are+mediated+by+NADPH+Oxidase+3-derived+reactive+oxygen+species+through+JNK+and+p38MAPK+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The effects of palmitate on hepatic insulin resistance are mediated by NADPH Oxidase 3-derived reactive oxygen species through JNK and p38MAPK pathways.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (39), 29965-29973 (2010).</li>
<li>Efendić, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreastatin+and+islet+hormone+release%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Pancreastatin and islet hormone release.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (20), 7257-7260 (1987).</li>
<li>Tian, Y., Ke, S., Denison, M. S., Rabson, A. B., Gallo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ah+receptor+and+NF-%CE%BAB+interactions%2C+a+potential+mechanism+for+dioxin+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ah receptor and NF-κB interactions, a potential mechanism for dioxin toxicity.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (1), 510-515 (1999).</li>
<li>Cui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pregnane+X+receptor+regulates+the+AhR%2FCyp1A1+pathway+and+protects+liver+cells+from+benzo-%5B%CE%B1%5D-pyrene-induced+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Letters%22%5BJournal%5D)">Pregnane X receptor regulates the AhR/Cyp1A1 pathway and protects liver cells from benzo-[α]-pyrene-induced DNA damage.</a> Toxicology Letters. 275, 67-76 (2017).</li>
<li>Li, L. A., Wang, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCB126+induces+differential+changes+in+androgen%2C+cortisol%2C+and+aldosterone+biosynthesis+in+human+adrenocortical+H295R+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">PCB126 induces differential changes in androgen, cortisol, and aldosterone biosynthesis in human adrenocortical H295R cells.</a> Toxicological Sciences. 85 (1), 530-540 (2005).</li>
<li>Asahi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisphenol+A+induces+endoplasmic+reticulum+stress-associated+apoptosis+in+mouse+non-parenchymal+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Life+sciences%22%5BJournal%5D)">Bisphenol A induces endoplasmic reticulum stress-associated apoptosis in mouse non-parenchymal hepatocytes.</a> Life sciences. 87 (13), 431-438 (2010).</li>
<li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2565847/">Murine pancreatic islet isolation.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments). (7), e255(2007).</li>
<li>Kirstetter, P., Lagneau, F., Lucas, O., Krupa, Y., Marty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+endothelium+in+the+modulation+of+isoflurane-induced+vasodilatation+in+rat+thoracic+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22British+journal+of+anaesthesia%22%5BJournal%5D)">Role of endothelium in the modulation of isoflurane-induced vasodilatation in rat thoracic aorta.</a> British journal of anaesthesia. 79 (1), 84-87 (1997).</li>
<li>Brown, E., Umino, Y., Loi, T., Solessio, E., Barlow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthesia+can+cause+sustained+hyperglycemia+in+C57%2FBL6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Visual+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Anesthesia can cause sustained hyperglycemia in C57/BL6J mice.</a> Visual neuroscience. 22 (5), 615-618 (2005).</li>
<li>Vaupel, D., McCoun, D., Cone, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phencyclidine+analogs+and+precursors%3A+rotarod+and+lethal+dose+studies+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Phencyclidine analogs and precursors: rotarod and lethal dose studies in the mouse.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 230 (1), 20-27 (1984).</li>
<li>Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+mouse+pancreatic+islet+isolation+and+intracellular+cAMP+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (88), (2014).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Raccogliendo la prova suggerisce che l'esposizione ai prodotti chimici ambientali svolge un ruolo importante nello sviluppo di T2DM. ROS indotta da xenobiotici è stato riconosciuto come un potenziale fattore eziologico che contribuiscono allo sviluppo di T2DM. Gli esseri umani sono esposti a una vasta gamma di prodotti chimici xenobiotici e c'è un grande bisogno di tecniche di ricerca romanzo di identificare in modo efficace le sostanze tossiche del pancreas e di studiare il meccanismo della tossicità specifica per le ce...

Aumento della prevalenza di T2DM è diventati una crisi sanitaria globale negli ultimi anni ponevano una seria minaccia alla salute pubblica1. Molti fattori sono stati trovati per essere causalmente collegato allo sviluppo di T2DM, tra i quali, ricorrenti risultati suggeriscono che un comune punto convergente per questi fattori è l'induzione di stress ossidativo che porta alla generazione di eccessivo ROS2 , 3.
Un ampio spettro di prodotti chimici ambientali compresi PCB, diossine e BaP è stato trovato per indurre stress ossidativo, che può alterare la funzione delle cellule β del pancreas e portare a insulino-resistenza e T2DM4. Anche se il livello fisiologico di ROS svolge un ruolo importante nelle funzioni cellulari, l'esposizione a ROS che supera la capacità del sistema antiossidante provoca il danno ai tessuti o cellule e conduce a malattie5. Le cellule β del pancreas esprimere un basso livello di enzima antiossidante e quindi sono un obiettivo sensibile per il danno ossidativo di sforzo-mediati6,7. L'esposizione cronica ad alti livelli di ROS è stato indicato per causare la disfunzione di cellula pancreatica indotta da stress5 così come la resistenza di insulina nel fegato e nel tessuto adiposo8.
L'obiettivo generale di questo progetto è quello di sviluppare un'analisi basata su celle a sostanze chimiche di schermo per loro potenziali diabetogeni basati su loro induzione del ROS in cellule pancreatiche. Il pancreas manca disintossicazione metabolica ed è un obiettivo sensibile per danni indotti da xenobiotici6,7. Pertanto, misurando direttamente i ROS generati nelle cellule del pancreas, questo test dovrebbe fornire un'approssimazione diretta della ferita indotta da prodotto nel pancreas. Per sviluppare questo metodo, abbiamo isolato isolotti pancreatici del topo, coltivate l'isolotto isolato sotto condizione di cultura delle cellule con sostanze chimiche e utilizzate la generazione di ROS indotta da sostanze chimiche come la lettura. Questa procedura è semplice ed efficace nell'identificazione di prodotti chimici che inducono ROS nell'isolato isolotto; può essere ulteriormente sviluppato per indagine dei meccanismi di tossicità che sono specifici per il pancreas in vitro.

<table><tbody><tr><td>10&volte; Hank' s soluzione salina bilanciata&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi di tipo 4</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>CLS-4</td><td></td></tr><tr><td>soluzione di polisaccarosio/diatrizoato di sodio&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>2',7'-diclorofluoresceina (DCFH-DA)</td><td>Sigma</td><td>D6883-50MG</td><td></td></tr><tr><td>lettore di micropiastre a fluorescenza&nbsp;</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Sigma</td><td>G8540-25G</td><td></td></tr><tr><td>streptomicina</td><td>GIBCO</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>GIBCO</td><td>11875-085</td><td></td></tr><tr><td>avertin</td><td>Sigma</td><td>T48402-25G</td><td></td></tr><tr><td>Kit ELISA per insulina per ratto / topo</td><td>Millipore</td><td>EZRMI-13K</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Sorval</td><td>Sorval RT7</td><td>per centrifuga a 96 pozzetti Lettore</td></tr><tr><td>di micropiastre</td><td>Biotek</td><td>Epoch 2</td><td>per lettura a fluorescenza</td></tr></tbody></table>

uno screening basati su cellule dell'isolotto pancreatico murino per prodotti chimici ambientali diabetogeni

A Murine Pancreatic Islet Cell-based Screening for Diabetogenic Environmental Chemicals

L'esposizione a determinati prodotti chimici ambientali negli umani e negli animali è stato trovato per causare danno cellulare delle cellule β del pancreas che porterà allo sviluppo di diabete mellito di tipo 2 (T2DM). Anche se i meccanismi per il danno cellulare indotto da chimica β erano poco chiare e probabile che sia complessa, una scoperta ricorrente è che queste sostanze chimiche inducono lo sforzo ossidativo che porta alla generazione di specie di eccessiva reattive dell'ossigeno (ROS) che inducono danni alla la cella β. Per identificare potenziali diabetogeni prodotti chimici ambientali, abbiamo isolato le cellule di Langerhans dai topi C57BL/6 e cellule dell'isolotto coltivate in piastre per colture cellulari di 96 pozzetti; cellule dell'isolotto sono state dosate con prodotti chimici, quindi la generazione di ROS è stata rilevata da 2', 7'-diclorofluorescina (DCFH-DA) tintura fluorescente. Utilizzando questo metodo, abbiamo trovato che il bisfenolo A (BPA), Benzo [a] pirene (BaP) e policlorobifenili (PCB), potrebbe indurre elevati livelli di ROS, suggerendo che potenzialmente possono indurre danni in cellule dell'isolotto. Questo metodo dovrebbe essere utile per lo screening di xenobiotici diabetogeni. Inoltre, cellule dell'isolotto coltivate possono anche essere adattate per l'analisi in vitro della tossicità chimica-indotta in cellule pancreatiche.

Un Micrografo dell'isolotto isolato sano è illustrato nella Figura 2, in cui isolotti hanno una forma rotonda o ovale con relativamente uniforme dimensioni (anche se uniformità di dimensione può variare da ceppo a ceppo). Successivamente abbiamo studiato le funzioni pancreatiche in un'analisi in vitro isolando l'isolotto e stimolando la secrezione di insulina negli isolotti di cultura. La figura 3 Mostra la nostra analis...

Qui presentiamo un protocollo per isolare le cellule delle isole pancreatiche del mouse per lo screening di induzioni ROS dai xenobiotici al fine di identificare i potenziali prodotti chimici xenobiotici diabetogeni.

Uno Screening basati su cellule dell'isolotto pancreatico murino per prodotti chimici ambientali diabetogeni

Exposure to certain environmental chemicals in human and animals has been found to cause cellular damage of the pancreatic &#946; cells which will lead to ...

Le cellule del pancreas sono bersagli sensibili per i danni indotti dai ROS, che sono associati allo sviluppo del diabete di tipo 2. Un saggio basato su cellule del pancreas aiuterà a identificare le sostanze chimiche che inducono i ROS. Il vantaggio principale di questa tecnica è quello di utilizzare cellule insulari del pancreas isolate per identificare in modo semplice ed efficace le sostanze chimiche che inducono i ROS che possono avere i potenziali diabetogeni aggiunti.Questo metodo può essere utilizzato anche per un'analisi in vitro sugli effetti di sostanze chimiche su una funzione fisiologica del pancreas, come una secrezione di insulina stimolata dal glucosio. Usa un paio di pinze curve per bloccare il duodeno vicino alla posizione dello sfintere di Oddi. Con un altro paio di pinze curve, bloccare la parete del duodeno per bloccare la via biliare.Trova il dotto biliare comune e con un ago calibro 30 e una siringa da cinque millilitri, inietta lentamente tre millilitri di soluzione di collagenasi. Quindi, riposizionare il mouse con la testa prossimale e i piedi distali. Assicurarsi che il dotto biliare comune e il pancreas siano gonfiati dopo l'iniezione.Usando la pinza curva e le forbici sottili, rimuovere il pancreas disteso per separarlo dal colon discendente, dall'intestino, dallo stomaco e dalla milza. Quindi, metti l'organo in una provetta da 50 millilitri contenente tre millilitri di soluzione di collagenasi e tienilo in ghiaccio. Metti ogni provetta da 50 millilitri in un bagnomaria a 37 gradi Celsius e incubali per 15-20 minuti.Agitare i tubi, quindi riunire quattro o cinque organi digeriti in un grande colino sterile e utilizzare un misurino per rompere completamente il pancreas. Con un ago calibro 23 e una siringa da dieci millilitri contenente soluzione di lavaggio, pipettare energicamente le cellule digerite dallo schermo. Quindi, raccogliere la soluzione di lavaggio in un tubo da 50 millilitri.Centrifugare le provette a 97 g e quattro gradi Celsius per un minuto e decantare il surnatante. Aggiungere 25 millilitri di soluzione di lavaggio ai tubi e risospendere il tessuto agitando delicatamente. Quindi, centrifugare il fazzoletto e travasare il surnatante.Ripetere il lavaggio tre volte, facendo attenzione a non rimuovere il fazzoletto pellettato. Per purificare le isole, aggiungere dieci millilitri di soluzione purificante al pellet di tessuto lavato e risospendere delicatamente il contenuto. Sovrapporre delicatamente cinque millilitri di soluzione isolante sulla soluzione di purificazione.Assicurarsi che venga mantenuta un'interfaccia liquida nitida tra le due soluzioni. Centrifugare la provetta a 560 g a quattro gradi Celsius per 15 minuti, con un'accelerazione lenta e senza interruzioni. Quindi, inserire la pipetta nell'interfaccia e raccogliere lo strato di isole.Trasferire la soluzione in nuove provette da 50 millilitri prima di lavare l'isolotto come appena dimostrato. Dopo aver rimosso il lavaggio finale, aggiungere dieci millilitri di soluzione di coltura delle isole e mescolare delicatamente e accuratamente per risospendere le isole. Quindi, utilizzando una pipetta multicanale, trasferire 100 microlitri per pozzetto ai pozzetti di una piastra da 96 pozzetti.Incubare la piastra in un incubatore di coltura tissutale per 12 ore. Quindi, centrifugare la piastra a 112 g e rimuovere il terreno di coltura. Diluire le sostanze chimiche ambientali nel terreno di coltura delle isole.Aggiungere 100 microlitri di ciascuno dei diluenti chimici in pozzetti separati della piastra. Risospendere le isole in ogni pozzetto e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 12 ore. Dopo il trattamento chimico delle isole, utilizzare 1x PBS per lavare i campioni.Quindi, aggiungere cinque millimolari di N-acetil cisteina o NAC ai pozzetti, come antiossidante per spegnere i ROS e incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 12 ore. Centrifugare la piastra a 96 pozzetti a 112 g, quindi aggiungere cinque soluzioni micromolari di sonda fluorescente e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 60 minuti. Utilizzare il PBS per lavare tre volte le cellule insulari trattate e utilizzare un lettore di micropiastre a 480 nanometri per misurare la fluorescenza.Infine, eseguire il test GSIS (secrezione insulinica stimolata dal glucosio) sulle isole xenobiotiche trattate e non trattate che inducono ROS, per misurare gli effetti degli xenobiotici sulla funzione fisiologica delle isole pancreatiche. Qui sono mostrate isole pancreatiche sane, isolate da topi C57 Black/6, che sono di forma rotonda o ovale e sono di dimensioni relativamente uniformi. In questo test GSIS, utilizzando isole isolate stimolate con glucosio per secernere insulina, è stata osservata una risposta dose-dipendente.Quando le isole isolate sono state trattate con gli xenobiotici qui elencati, diverse sostanze chimiche tra cui atrazina, BaP, BPA e PCB hanno causato una significativa induzione di specie reattive dell'ossigeno. Tuttavia, l'aggiunta di NAC è stata in grado di estinguere la produzione di ROS mediante trattamenti chimici. Inoltre, le isole pancreatiche pretrattate con PCB126 e BPA hanno mostrato una significativa diminuzione della secrezione di insulina rispetto al gruppo di controllo, confermando l'importante ruolo dei ROS nel causare danni alla funzione fisiologica delle cellule beta pancreatiche che portano al T2DM.Una volta padroneggiato, l'isolamento delle isole del pancreas può essere effettuato in due ore se eseguito correttamente. Durante il tentativo di questa procedura è importante utilizzare la centrifugazione in gradiente per purificare le isole lontano dagli altri detriti pancreatici. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la secrezione di insulina stimolata dal glucosio per rispondere a ulteriori domande come gli effetti delle sostanze chimiche sulle funzioni fisiologiche delle isole del pancreas.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della tossicologia per esplorare i potenziali diabetogeni delle sostanze chimiche ambientali nelle cellule isolate delle isole pancreatiche di topo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare le isole del pancreas del topo e utilizzare queste cellule insulari per l'identificazione.

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Murino pancreatica isolamento Islet

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Un metodo per l&#39;isolamento del mouse isole pancreatiche e intracellulare cAMP Determinazione

Presentiamo qui un protocollo per l'isolamento delle isole dal modello murino di diabete di tipo 2, Leprdb e i dettagli di un test su cellule vive per la misurazione della secrezione di insulina da isole intatte che utilizza la microscopia a 2 fotoni.

LEPR<sup&gt; Db</sup&gt; Mouse Modello di diabete di tipo 2: pancreas isolamento Islet e live-cella 2-Photon Imaging di isolotti Intact

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