Name: Effetti doppi di fattori derivati da cellule di Melanoma su differenziazione adipociti del midollo osseo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Scopri un sistema di cocultura bidimensionale per studiare l'interazione tra cellule di melanoma e adipociti del midollo osseo. Questo metodo semplice rivela gli effetti dei fattori tumorali sulla differenziazione adipocitaria e fornisce approfondimenti sui meccanismi delle metastasi ossee.

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Ringraziamo gentilmente Dov Zipori (The Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israele) per averci fornito le cellule stromali del midollo osseo murino linea 14F1.1. Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni da Fondazione Scienza naturale nazionale cinese (nn. 81771729) e l'Università ospedale di Chongqing Yongchuan medica (Nos. YJQN201330; YJZQN201527).

Nota: Tutte le celle utilizzate nel presente protocollo dovrebbero essere cresciute da almeno tre generazioni dopo lo scongelamento da cellule stock congelate.
1. raccogliere i fattori derivati da cellule di Melanoma
<ol><li>
Preparazioni
	<ol>
<li>Ottenere le cellule B16F10 e una linea cellulare di melanoma del topo. Nota: Per questo protocollo, una linea cellulare di melanoma del topo è stata ottenuta dalla banca della cellula formativa dell'Accademia cinese delle scienze.</li>
		<li>Rendere un supporto completo per la coltura delle cellule B16F10 (100 mL). Utilizzare medium dell'Aquila per volta di Dulbecco (DMEM) supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS), 50 U/mL di penicillina e 50 µ g/mL di streptomicina.</li>
		<li>Rendere un medium senza siero per l'inedia delle cellule B16F10 (50 mL). Utilizzare Media senza FBS DMEM, 50 U/mL di penicillina e 50 µ g/mL di streptomicina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparare il melanoma-condizionato medio (CM)
	<ol>
<li>Seme 2.0 x 105 B16F10 cellule in un 100mm piatto con 10 mL di 10% FBS DMEM. Incubare le cellule in un incubatore a 37 ° C in un'atmosfera di 5% CO2 per 24 h.</li>
		<li>Quando le cellule raggiungono circa l'80% di confluenza, rimuovere il terreno di coltura, lavare le cellule due volte con 5 mL di tampone fosfato salino (PBS) (x 1, pH 7.4) e sostituire il mezzo con un 10 mL privo di siero medio per la fame.</li>
		<li>Riporre le cellule nell'incubatore per 18 – 24 h.</li>
		<li>Dopo l'inedia, raccogliere il medium condizionato (CM) con una pipetta e trasferirlo in una provetta da centrifuga fresca 50 mL. Nota: Il medium condizionato è il sovranatante delle colture cellulari B16F10. Assicurarsi che le cellule B16F10 sono in buone condizioni prima di raccogliere i CM.</li>
		<li>Centrifugare il CM per 5 min a 1.000 x g a 4 ° C.</li>
		<li>Pipettare il supernatante e trasferirlo in una provetta sterile fresco o bottiglia. Nota: Evitare di pipettaggio fuori la pallina nella parte inferiore del tubo.</li>
		<li>Per rimuovere i detriti cellulari, è possibile filtrare i CM facendolo passare attraverso un filtro da 0,45 µm siringa-collegato sulla cima di un tubo o bottiglia sterile. Nota: 0,22 µm filtri sono ottimali per il filtraggio del CM.</li>
		<li>Conservare il surnatante filtrato a-20 ° C fino all'utilizzo. Nota: Si consiglia di non conservare il supernatante a-20 ° C per più di un mese. In alternativa, è possibile memorizzare i CM a-80 ° C per più lunghi periodi di tempo per la differenziazione degli adipociti.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. induzione degli adipociti del midollo osseo da fattori derivati da cellule di Melanoma
<ol><li>
Preparazioni
	<ol>
<li>Portare a 100 mL di adipogenico induzione media28. Utilizzare un completo DMEM completate con 5 µ g/mL di insulina, 0,5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine e 1 µM desametasone. Memorizzare a due settimane a 4 ° C.</li>
		<li>Preparare 100 mL di mezzo di manutenzione adipogenico. Utilizzare un DMEM completo o miscelato con il 50% del melanoma CM completati con 5 µ g/mL di insulina.</li>
		<li>Fare una soluzione di riserva di Oil Red O. Sciogliere 30 mg di polvere di Oil Red O in 10 mL di isopropanolo (≥ 99.5%) e mescolarli bene dal vortice. Nota: E ' memorizzare fino a 1 anno a 4 ° C.</li>
		<li>Fare una soluzione di lavoro Oil Red O. In cappa, diluire la soluzione di riserva di Oil Red O (dal punto 2.1.3) con acqua deionizzata in un rapporto di 3:2. Incubare la miscela per 15 min a temperatura ambiente e filtrare attraverso un filtro da 0,22 µm prima dell'uso. Nota: Utilizzare solo la soluzione fresca di lavoro all'interno di 2 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Differenziazione degli adipociti
	<ol>
<li>Cultura una cella stromal linea 14F1.1 dal mouse del midollo osseo29 in un piatto di 60 mm con un completo DMEM al confluency di 80% in un incubatore a 37 ° C in un'atmosfera di 5% CO2. Nota: In alternativa, sostituire 14F1.1 con cellule mesenchimali derivate da midollo osseo primario30.</li>
		<li>Tripsinizzano le cellule con 1,5 mL di una soluzione di tripsina 0.25% in un'incubatrice per 1 – 2 min.</li>
		<li>Aggiungere 5 mL di terreno di 10% FBS alle celle e contare i numeri di cellulare con un emocitometro di vetro; quindi regolare la densità delle cellule a circa 1 – 2 x 105/ml.</li>
		<li>5 x 104 di 14F1.1 cellule per pozzetto di una piastra a 24 pozzetti con 0,5 mL di mezzo di induzione adipogenico del seme. Dopo due giorni di incubazione, le cellule raggiungono circa il 90% di confluenza. Nota: Questo passaggio è molto critico. Cellule stromali del midollo osseo non possono essere indotto a adipociti senza un mezzo di induzione adipogenic.</li>
		<li>Rimuovere il mezzo di induzione e lavare le cellule due volte con 1 mL di PBS ogni volta.</li>
		<li>Cambiare a 1 mL di mezzo di manutenzione adipogenico e continuare a coltivare le cellule fino alla maturazione degli adipociti. Nota: Sotto un microscopio, adipociti apparire come piccole o grandi bolle di sapone e sono molto facili da riconoscere. Di solito, adipocytes maturi sono presenti 6th o 8° giorno.</li>
		<li>Macchiare i adipocytes maturi con Oil Red O o raccogliere gli adipociti per un'analisi di reazione a catena (qPCR) della polimerasi quantitativa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Macchiatura del adipocyte
	<ol>
<li>Lavare il 14F1.1 differenziato cellule 2 volte con PBS e correggerli in formaldeide del 3,7% per 1 h.</li>
		<li>Sciacquare le cellule in 60% isopropanolo e lasciarli asciugare completamente.</li>
		<li>Aggiungere 0,2 mL di soluzione di lavoro di Oil Red O pozzetti e incubare a temperatura ambiente per 0,5-2 h.</li>
		<li>Lavare le cellule con acqua per rimuovere i coloranti non associati.</li>
		<li>Foto gli adipociti tinti sotto un microscopio chiaro.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. coculture degli adipociti del midollo osseo con cellule di Melanoma
<ol><li>
Preparazioni
	<ol>
<li>Preparare l'osso maturo adipociti del midollo: indurre le cellule 14F1.1 in adipociti maturi BM in piastre da 24 pozzetti con il mezzo di induzione adipogenico per 2 giorni e poi mantenerli nel medium adipogenico manutenzione per ulteriori 6-8 giorni.</li>
		<li>Preparare le cellule B16F10: coltura le cellule B16F10 in piastre da 60 mm con 5 mL di terreno DMEM.</li>
		<li>Inumidire l'inserto di membrana (ad es. transwell): aggiungere 150 µ l di terreno DMEM privo di FBS per gli inserti di formato del poro della membrana 0,4 µm e immergerli su pozzetti di piastre da 24 pozzetti riempite con 500 µ l di terreno DMEM privo di FBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Impostazione di coculture
	<ol>
<li>Pipettare lentamente fuori il mezzo di ciascun frutto. Nota: Non distruggono la membrana quando si rimuove il mezzo.</li>
		<li>Seme le cellule B16F10 (0/103105106) nel poro 0,4 µm inserisce dal punto 3.2.1.</li>
		<li>Sostituire il mezzo di manutenzione adipogenico nei pozzetti con gli adipociti maturi del midollo osseo dal punto 3.1.1. con 600 µ l di terreno DMEM completo.</li>
		<li>Trasferire gli inserti riempiti con le cellule B16F10 (dal punto 3.2.2) sui pozzetti con gli adipociti maturi del midollo osseo (dal punto 3.2.3) per gli esperimenti di coculture.</li>
		<li>Incubare i cocultures a 37 ° C e 5% CO2 per 2 giorni.</li>
		<li>Dopo 48 h di incubazione, rimuovere gli inserti del coculture e poi lavare gli adipociti 2 x con 500 µ l di PBS 1X. Nota: Facoltativamente, raccogliere le cellule B16F10 negli inserti per analisi se necessario.</li>
		<li>Gli adipociti con la soluzione di lavoro Oil Red O di macchia o raccogliere gli adipociti per analisi qPCR. Nota: Vedere la procedura di colorazione al punto 2.3.</li>
		<li>Foto gli adipociti tinti sotto un microscopio chiaro.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. qPCR analisi del Adipocyte-specific Gene Signature
<ol><li>Aggiungere 0,5 mL di reagente di isolamento di RNA ready-to-use per pozzetto di una piastra a 24 pozzetti in cui adipocita maturo è pronto a rilevare.</li>
	<li>Seguire un protocollo standard per l'estrazione di RNA e la sintesi di cDNA31.</li>
	<li>Utilizzare il primer per 18S e GAPDH come controllo e CEBPα/β, PPARγ, FABP4, leptina, Pref-1 o adiponectin per la firma genica adipocyte-specifica (tabella 1).</li>
	<li>Eseguire la seguente reazione in un termociclatore: 95 ° C per 20 s, seguiti da 40 cicli di 95 ° C per 1 s e 60 ° C per 20 s.</li>
	<li>Utilizzare il metodo diΔΔCt –2 per calcolare che la piega cambia32.</li>
</ol>

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<li>Shafat, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemic+blasts+program+bone+marrow+adipocytes+to+generate+a+protumoral+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Leukemic blasts program bone marrow adipocytes to generate a protumoral microenvironment.</a> Blood. 129 (10), 1320-1332 (2017).</li>
<li>Gazi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+of+lipid+translocation+between+adipocytes+and+prostate+cancer+cells+with+imaging+FTIR+microspectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Direct evidence of lipid translocation between adipocytes and prostate cancer cells with imaging FTIR microspectroscopy.</a> The Journal of Lipid Research. 48 (8), 1846-1856 (2007).</li>
<li>Brown, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+omega-6+PUFA+arachidonic+acid+and+bone+marrow+adipocytes+on+metastatic+spread+from+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Influence of omega-6 PUFA arachidonic acid and bone marrow adipocytes on metastatic spread from prostate cancer.</a> British Journal of Cancer. 102 (2), 403-413 (2010).</li>
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<li>Wagner, M., Bjerkvig, R., Wiig, H., Dudley, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+adipocyte+specification+and+necrosis+augment+tumor-associated+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Adipocyte%22%5BJournal%5D)">Loss of adipocyte specification and necrosis augment tumor-associated inflammation.</a> Adipocyte. 2 (3), 176-183 (2013).</li>
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<li>Hirano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+adipogenesis+induction+by+conditioned+media+obtained+from+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Enhancement of adipogenesis induction by conditioned media obtained from cancer cells.</a> Cancer Letters. 268 (2), 286-294 (2008).</li>
<li>Gordeev, A. A., Chetverina, H. V., Chetverin, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+arrangement+of+eukaryotic+cells+in+merged+hydrogels+combines+the+advantages+of+3-D+and+2-D+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Planar arrangement of eukaryotic cells in merged hydrogels combines the advantages of 3-D and 2-D cultures.</a> Biotechniques. 52 (5), 325-331 (2012).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

Cocultures con inserti sono stati ampiamente usati per studiare le interazioni cellula--cellula. Il sistema di coculture 2D è un modo efficace per osservare come le due parti diafonia in vitro, mediante il quale abbiamo mostrato qui due differenti del cancro delle cellule-guidati effetti sugli adipociti del midollo osseo. Molti laboratori hanno utilizzato questo metodo per indagare il crosstalk tra adipociti e cancro cellule6,12,<sup class="xr...

Le metastasi dell'osso sono diffuse fra i pazienti di cancro avanzato, ma un trattamento curativo non è ancora disponibile. Di là di specializzata nella conservazione di energia come grasso, adipociti è in grado di supportare la crescita del tumore e metastasi nel midollo osseo e altri organi1,2,3,4,5,6. Inoltre, adipociti svolgono un ruolo essenziale nella regolazione del cancro cellula biologia7,8,9,10 e metabolismo4,11,12 ,13,14,15,16, come bene come in osso metastasi1,4,12. Nella nicchia del midollo osseo, adipociti possono anche influenzare il comportamento biologico del cancro cellule4,6,17. L'interazione tra adipociti del midollo osseo e le cellule tumorali con osteotropism è significativo per la comprensione della metastasi dell'osso. Tuttavia, piccolo è conosciuto.
Basati sugli studi di correnti, vari metodi vengono applicati ai adipocytes, tra cui bi - o tri - dimensionale (2/3D) ed ex vivo culture17,18,19,20,21. Recentemente, Herroon et al. progettato un nuovo approccio di 3D-cultura per studiare le interazioni degli adipociti del midollo osseo con cancro cellule22. Anche se il 3D coculture è ottimale per mimare fisiologiche interazioni tra adipociti e cancro cellule in vivo, soffre di scarsa riproducibilità22,23. Rispetto ad un sistema di coculture 2D, un sistema di coculture 3D può fornire diversi fenotipi cellulari, come ad esempio cellule morfologia21,22,24,25,26. Inoltre, la cultura ex vivo di frammenti di tessuto isolato cancellous dell'osso può portare a un'escrescenza robusta degli adipociti dal midollo osseo coltivate cellule17.
In contrasto con questi modelli precedenti, tuttavia, il modello della coltura cellulare 2D rimane una tecnica classica, affidabile e facile scansione rapidamente molecole candidate e i fenotipi cambiati in adipociti o cancro cellule in vitro1, 4,6,12,15,27. Per comprendere meglio il crosstalk tra adipociti del midollo osseo e le cellule del melanoma, forniamo un protocollo dettagliato per un sistema di coculture 2D degli adipociti del midollo osseo con cellule di melanoma.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen Inc.</td><td></td><td></td>11965092</tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>16000&ndash; 044</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>91077C</td><td></td></tr><tr><td>3-isobutil-1-metil-xantina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>Desametasone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>Olio Rosso o</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 24 pozzetti</td><td>Corning</td><td>CLS3527</td><td></td></tr><tr><td>Inserto</td> <td>TranswellMillipore</td><td>MCHT24H48</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>isopropanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>0,25% tripsina</td><td>Thermo Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>emocitometro</td><td>Bio-Rad</td><td>1450016</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore per colture</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL falcon</td><td>Corning</td><td>CLS430828</td><td></td></tr><tr><td>Banco</td><td>Pulito Termo Scientifico-Microscopia</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Olympus-200</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>&mu; Puntali per pipette a L</td><td>BeyoGold</td><td>FTIP620</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette da 1.000 mL</td><td>BeyoGold</td><td>FTIP628</td><td></td></tr></tbody></table>

effetti doppi di fattori derivati da cellule di melanoma su differenziazione adipociti del midollo osseo

Dual Effects of Melanoma Cell-derived Factors on Bone Marrow Adipocytes Differentiation

Il crosstalk tra adipociti del midollo osseo e le cellule del tumore può giocare un ruolo critico nel processo di metastasi ossee. Una varietà di metodi sono disponibili per studiare il crosstalk significativo; Tuttavia, un sistema di transwell bidimensionale per coculture rimane un classico, affidabile e facile modo per questo studio di diafonia. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato che mostra il coculture delle adipociti del midollo osseo e le cellule del melanoma. Tuttavia, un tale sistema di coculture potrebbe non solo contribuire allo studio di trasduzioni segnale cellulare delle cellule di cancro indotte dagli adipociti del midollo osseo, ma anche per il futuro meccanicistico studio della metastasi dell'osso che può rivelare nuovi bersagli terapeutici per osso metastasi.

Nel midollo osseo, adipociti possono apparire nel tumore microambiente1,13,33,34,35 in una fase precoce per sostenere la progressione del tumore attraverso fattori solubili o attivazione12,6,osteoclastogenesis36, soprattutto nel contes...

Qui, presentiamo un sistema affidabile e semplice coculture bidimensionale (2D) per studiare l'interazione tra le cellule del tumore e adipociti del midollo osseo, che rivela un duplice effetto di fattori derivati da cellule di melanoma su adipociti del midollo osseo differenziazione e pone anche un metodo classico per lo studio meccanicistico della metastasi dell'osso.

Effetti doppi di fattori derivati da cellule di Melanoma su differenziazione adipociti del midollo osseo

The crosstalk between bone marrow adipocytes and tumor cells may play a critical role in the process of bone metastasis. A variety of methods are ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della ricerca sulle metastasi ossee, come ad esempio quali cambiamenti sono indotti nella crescita degli adipociti del midollo osseo e il loro sviluppo in un microambiente tumorale. I grandi vantaggi di questa tecnica sono che è facile da eseguire e che le molecole candidate possono essere ottenute rapidamente. Questo metodo può fornire informazioni sul crosstalk tra gli adipociti del midollo osseo e le cellule melanomeniche.Può essere applicato anche ad altri tipi di cellule, come gli osteoblasti. Inizia seminando due volte da 10 alla quinta cellule di melanoma B16F10 in un piatto da 100 millimetri con 10 millilitri di DMEM integrato con il 10% di FBS, per un'incubazione di 24 ore a 37 gradi Celsius e il 5% di CO2. Il giorno successivo, lavare due volte la coltura cellulare confluente all'80% con cinque millilitri di PBS per lavaggio e affamare le cellule con 10 millilitri di terreno di coltura privo di siero nell'incubatore per colture cellulari per 18-24 ore.Il giorno successivo, utilizzare una pipetta per trasferire il surnatante condizionato in una provetta conica da 50 millilitri per la centrifugazione e caricare il terreno in una siringa dotata di un filtro con pori da 0,45 micron. Quindi, filtrare la soluzione in un contenitore sterile per rimuovere eventuali detriti cellulari rimanenti e conservare il terreno condizionato a meno 20 gradi Celsius per un massimo di un mese. Per indurre gli adipociti del midollo osseo, coltivare cellule stromali del midollo osseo F14 1.1 di topo in un piatto da 60 millimetri con DMEM completo a una confluenza dell'80%.Nella fase appropriata della coltura, raccogliere le cellule con 1,5 millilitri di una soluzione di tripsina allo 0,25% per uno o due minuti a 37 gradi Celsius. Quando le cellule si sono staccate, arrestare la reazione enzimatica con cinque millilitri di terreno integrato con il 10% di FBS e regolare le cellule a una concentrazione di una o due volte 10 al quinto di cellule per millilitro con terreno di coltura fresco integrato con siero. Seminare cinque volte 10 alla quarta cellula in 0,5 millilitri di terreno di induzione adipogenico per pozzetto in una piastra da 24 pozzetti e rimettere le cellule nell'incubatore di coltura cellulare per altri due giorni, fino a raggiungere circa il 90% di confluenza.Quindi, sostituire il surnatante con un millilitro di terreno di mantenimento adipogenico per pozzetto e continuare a coltivare le cellule fino alla maturazione degli adipociti. Quando le cellule appaiono come bolle di sapone piccole o grandi al microscopio ottico, lavare questi adipociti maturi due volte con PBS, seguito dalla fissazione in 0,2 millilitri di formaldeide al 3,7% per un'ora. Sciacquare le cellule fissate con isopropanolo al 60% e lasciare asciugare completamente i pozzetti.Aggiungere 0,2 millilitri di soluzione di lavoro Oil Red O alle cellule per un'incubazione da 30 a 120 minuti a temperatura ambiente e lavare le cellule con acqua per rimuovere qualsiasi colorante non legato per l'imaging degli adipociti mediante microscopia ottica. In alternativa, al momento della loro maturazione, aggiungere 0,5 millilitri di reagente di isolamento dell'RNA pronto all'uso a ciascun pozzetto di coltura di adipociti e utilizzare i primer appropriati per confermare la firma genica specifica per gli adipociti delle cellule. Quindi, eseguire la reazione in un termociclatore utilizzando le impostazioni indicate.Per impostare una co-coltura di cellule di melanoma adipocitario derivato dal midollo osseo, aggiungere prima 150 microlitri di DMEM privo di siero alle camere interne di inserti di membrana con pori di 0,4 micron e posizionare ciascun inserto in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti contenente 500 microlitri di terreno privo di siero per pozzetto. Diluire le cellule di melanoma B16F10 da una coltura cellulare all'80% a una concentrazione sperimentalmente appropriata in terreno fresco privo di siero e sostituire il terreno nella camera interna di ciascun inserto con 150 microlitri di cellule. Successivamente, sostituire il surnatante del mezzo di mantenimento adipogenico in ciascun pozzetto di una coltura di adipociti di midollo osseo maturo confluente al 90% con 600 microlitri di DMEM completo e trasferire gli inserti contenenti cellule di melanoma in ciascun pozzetto della piastra di coltura per adipociti maturi.Quando tutti gli inserti sono stati trasferiti, posizionare la piastra nell'incubatore per colture cellulari. Dopo due giorni, rimuovere gli inserti e lavare il fondo di ogni pozzetto due volte con 500 microlitri di PBS per lavaggio. Quindi, colorare gli adipociti con la soluzione di lavoro Oil Red O o analizzare l'espressione genica degli adipociti mediante PCR quantitativa, come dimostrato.Gli adipociti maturi differenziati in terreno condizionato dal tumore contengono goccioline lipidiche, che consentono agli adipociti differenziati di essere facilmente identificati mediante colorazione Oil Red O. La firma genica adipocitaria-specifica di queste cellule può anche essere confermata dalla PCR quantitativa. Una riduzione dell'accumulo lipidico si osserva negli adipociti co-coltivati in presenza di un elevato numero di cellule di melanoma, così come una de-differenziazione nel fenotipo degli adipociti, come evidenziato da una diminuita espressione genica adipocitaria-specifica in queste cellule precedentemente mature.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come progettare e impostare un sistema di co-coltura 2D per studiare le interazioni tra due diversi tipi di cellule.

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Questo video dimostra la differenziazione delle cellule stromali del midollo osseo (BMSC) in adipociti. Nel processo in due fasi, in presenza di specifici fattori di crescita e ormoni, le BMSC indifferenziate si differenziano prima in preadipociti. La seconda fase, che prevede il trattamento con glucosio e insulina, porta alla formazione di adipociti maturi con più goccioline lipidiche.

Differenziazione in vitro delle cellule stromali del midollo osseo di topo in adipociti

Il tessuto adiposo (AT) può influenzare l'omeostasi di tutto il corpo, quindi è importante comprendere i meccanismi molecolari della differenziazione e della funzione degli adipociti. Forniamo un protocollo per ottenere nuove informazioni su questi processi analizzando l'omeostasi degli adipociti, la differenziazione e l'esposizione all'ipossia come modello per l'apoptosi indotta degli adipociti.

Meccanismo di regolazione dei numeri adipociti in organismi adulti attraverso la differenziazione e l&#39;apoptosi omeostasi

Negli organismi pluricellulari, i fattori solubili secreti suscitano risposte da diversi tipi di cellule come risultato della segnalazione paracrina. I sistemi di co-coltura in insert offrono un modo semplice per valutare i cambiamenti mediati da fattori solubili secreti in assenza di contatto cellula-cellula.

Sviluppo di un sistema di inserimento co-coltura di due tipi cellulari in assenza del cellula-cellula di contatto

Qui riportiamo un metodo per l'isolamento delle popolazioni di cellule progenitrici di Adipocyte (APC) da tessuto adiposo perivascolare (PVAT) utilizzando la selezione delle cellule magnetiche (MCS). Questo metodo consente un aumento dell'isolamento di APC per grammo di tessuto adiposo se confrontato con la selezione delle cellule attivate con fluorescenza (FACS).

L&#39;espansione e l&#39;adipogenesi dell&#39;induzione di progenitori adipociti da tessuto adiposo perivascolare isolati da cellule magnetiche attivate

Metodi tradizionali di valutazione adipogenico differenziazione sono economici e facili da usare, ma non sono specifici di cambiamenti nell'espressione genica. Abbiamo sviluppato un test per quantificare la differenziazione delle cellule mesenchimali in adipociti maturi con un pennarello specifico lignaggio. Questo test ha diverse applicazioni attraverso la ricerca di base e della medicina clinica.

Visualizzazione e quantificazione del potenziale di differenziazione delle cellule mesenchimali adipogenico con un Marker specifico lignaggio

La differenziazione degli adipociti bianchi e beige da progenitori vascolari del tessuto adiposo porta il potenziale di miglioramento metabolico nell'obesità. Descriviamo i protocolli per CD34 + CD31 + isolamento di cellule endoteliali da grasso umano e per una successiva in vitro espansione e differenziazione in adipociti bianchi e beige. Diverse applicazioni a valle sono discussi.

Isolamento, espansione e adipogenico induzione di CD34 + CD31 + cellule endoteliali dal tessuto adiposo umano omentale e sottocutaneo

La seguente procedura descrive un metodo per il controllo spaziale e temporale dell'iniziazione tumorale melanocitica nella pelle dorsali murina, utilizzando un modello di topo geneticamente modificato. Questo protocollo descrive l'iniziazione macroscopica e microscopica del melanoma cutaneo.

Controllo spaziale e temporale dell'iniziazione del melanoma murino dalle cellule staminali di melanociti mutanti

Il protocollo consente la generazione di una popolazione di adipociti puri da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). L'acido retinoico viene utilizzato per differenziare le iPSC in cellule staminali mesenchimali (MSC) utilizzate per la produzione di adipociti. Quindi, viene utilizzato un approccio di selezione basato sulla colorazione rossa del Nilo per ottenere adipociti puri.

Robusta differenziazione delle iPSC umane in una popolazione pura di adipociti per studiare i disturbi associati agli adipociti

Questo protocollo descrive l'isolamento semi-automatico della frazione vascolare stromale (SVF) dal tessuto adiposo murino per ottenere preadipociti e ottenere la differenziazione degli adipociti in vitro. L'uso di un dissociatore tissutale per la digestione della collagenasi riduce la variazione sperimentale e aumenta la riproducibilità.

Isolamento semi-automatico della frazione vascolare stromale dal tessuto adiposo bianco murino mediante un dissociatore tissutale

Questo articolo descrive un protocollo per la propagazione delle cellule tumorali circolanti nel liquido cerebrospinale (CSF-CTC) raccolte da pazienti con malattia leptomeningea associata a melanoma (M-LMD) per sviluppare modelli preclinici per lo studio di M-LMD.

Ex Vivo Coltura di cellule tumorali circolanti nel liquido cerebrospinale da pazienti con melanoma per studiare la malattia leptomeningea associata al melanoma

Scopri un sistema di cocultura bidimensionale per studiare l'interazione tra cellule di melanoma e adipociti del midollo osseo. Questo metodo semplice rivela gli effetti dei fattori tumorali sulla differenziazione adipocitaria e fornisce approfondimenti sui meccanismi delle metastasi ossee.

Effetti doppi di fattori derivati da cellule di Melanoma su differenziazione adipociti del midollo osseo

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