Titolazione ELISA come un metodo per determinare la costante di dissociazione dell'interazione ligando del recettore
15 febbraio 2018
Un protocollo dettagliato per eseguire una titolazione ELISA è descritto. Inoltre, un algoritmo di romanzo è presentato per valutare titolazione ELISAs e ottenere una costante di dissociazione di legame di un ligando solubile ad un recettore di immobilizzato piastra di microtitolo.
L'obiettivo generale di questo ELISA di titolazione è determinare la costante di affinità di due partner di legame in modo riproducibile ed efficiente utilizzando un nuovo algoritmo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave non solo nel campo dell'interazione proteina-ligando e della ricerca sui recettori, ma anche nelle scienze della vita applicate come la ricerca farmaceutica e la farmacologia. Il principale vantaggio di questa tecnica è che la costante di affinità di un'interazione recettore-ligando può essere determinata facilmente titrando un recettore con un ligando su una piastra ELISA e utilizzando un nuovo algoritmo di valutazione.
Inizia questa procedura diluendo la soluzione di scorta del dominio A di Integrina Alfa 2 ad una concentrazione finale di cinque microgrammi per millilitro in tampone TBS cloruro di magnesio. In questa dimostrazione verranno utilizzati sia un dominio A di Integrina Alfa 2 di tipo selvaggio che un dominio A di Integrina Alfa 2 mutante. Riempi ogni pozzetto di una riga su una piastra microtitolante a mezza area con 50 microlitri della soluzione di rivestimento del dominio A di Integrina Alfa 2.
Esegui ogni riga di titolazione almeno in duplicati. In questo esempio, ogni riga di titolazione viene eseguita in quadruplo. Sigilla la piastra con della pellicola e lasciala a quattro gradi Celsius durante la notte.
Il giorno successivo, rimuovi la soluzione di rivestimento e riempi ogni pozzetto con 15 microlitri di tampone TBS cloruro di magnesio. Rimuovi la soluzione di lavaggio e riempi i pozzetti con nuova soluzione di lavaggio. I lavaggi rimuoveranno le molecole di recettore solubili che non sono state immobilizzate sulla superficie di plastica per assorbimento fisico.
Il passo successivo è bloccare i siti di legame non specifici aggiungendo 50 microlitri di soluzione di BSA all'1% in tampone TBS cloruro di magnesio in ogni pozzetto. Risigillate la piastra e incubate a temperatura ambiente per un'ora. Mentre i pozzetti della piastra microtitolante vengono bloccati con BSA, preparate una diluizione seriale del ligando Rodocetina.
In questo caso si utilizza una concentrazione iniziale di 243 Rodocetina smaltata e un fattore di diluizione di 2,3. Per le otto curve di titolazione in questo esperimento, preparate 920 microlitri di soluzione di Rodocetina alla massima concentrazione in BSA all'1% in TBS cloruro di magnesio nel tubo di prova numero uno. Pipetta 520 microlitri di soluzione di BSA all'1% in TBS cloruro di magnesio in ciascuno degli altri dieci tubi di prova numerati da due a undici.
Trasferisci 400 microlitri della soluzione di Rodocetina dal tubo di prova al tubo di prova due. Mescola entrambe le soluzioni mediante agitazione e poi trasferisci 400 microlitri di questa miscela nel tubo di prova tre. Continua questa diluizione seriale fino al tubo di prova undici.
Per il successo di questa procedura, è importante riempire sempre ogni pozzetto rapidamente con la soluzione per assicurarsi che i pozzetti non si secchino. Al termine dell'incubazione di un'ora, rimuovi la soluzione di blocco dai pozzetti della piastra microtitolante. Aggiungi immediatamente 50 microlitri della soluzione di Rodocetina dal tubo di prova uno nei pozzetti della colonna uno, la soluzione dal tubo di prova due nei pozzetti della colonna due e continua fino alla colonna undici.
Aggiungi 50 microlitri di BSA all'1% e TBS cloruro di magnesio come controllo privo di ligando nei pozzetti della colonna dodici. Risigillate la piastra e incubate a temperatura ambiente per un'ora e mezza. Per rimuovere le molecole di ligando non legate, rimuovi la soluzione di legame e riempi ogni pozzetto con 50 microlitri di tampone HBS cloruro di magnesio.
Quindi rimuovi il tampone HBS e aggiungi nuovo tampone HBS. Per fissare chimicamente il recettore e il ligando legato, riempi ogni pozzetto della piastra microtitolante con 50 microlitri di una soluzione di glutaraldeide al 2,5% in tampone HBS cloruro di magnesio. Incuba la piastra microtitolante a temperatura ambiente per dieci minuti.
Rimuovi e inattiva l'eccesso di glutaraldeide rimuovendo la soluzione di fissazione e riempiendo ogni pozzetto con 50 microlitri di tampone TBS cloruro di magnesio. Rimuovi il tampone di lavaggio e aggiungi nuovo tampone di lavaggio in ogni pozzetto. Per iniziare questo saggio, rimuovi il tampone di lavaggio da tutti i pozzetti della piastra microtitolante e aggiungi a ciascun pozzetto 50 microlitri della soluzione dell'anticorpo primario, diluita da 1 a 2000 in BSA all'1% TBS cloruro di magnesio.
Risigillate la piastra e incubatela a temperatura ambiente. Rimuovi la soluzione dell'anticorpo primario da tutti i pozzetti e aggiungi a ciascun pozzetto 50 microlitri di tampone TBS cloruro di magnesio. Lavare tre volte con tampone TBS cloruro di magnesio.
Quindi, aggiungi a ciascun pozzetto 50 microlitri della soluzione dell'anticorpo secondario, diluita da 1 a 2000 in BSA all'1% in TBS cloruro di magnesio. Risigillate la piastra e lasciatela a temperatura ambiente. Rimuovi la soluzione dell'anticorpo secondario dai pozzetti e aggiungi a ciascun pozzetto 50 microlitri di tampone TBS cloruro di magnesio.
Lava tre volte. Dopo il terzo lavaggio, tampona la piastra microtitolante su un panno di carta per rimuovere ogni traccia di liquido. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungi prontamente 50 microlitri della soluzione di rilevamento della fosfatasi alcalina a ciascun pozzetto della piastra microtitolante per avviare la conversione enzimatica il più simultaneamente possibile.
Incuba la piastra a temperatura ambiente fino a quando la soluzione nei pozzetti con la massima concentrazione di ligando diventa gialla. A seconda dell'intensità del segnale, il tempo di incubazione può variare tra cinque minuti e un'ora. Interrompi la conversione del substrato della fosfatasi utilizzando una pipetta multicanale per aggiungere 50 microlitri di una soluzione di idrossido di sodio 1,5 molare a ciascun pozzetto nello stesso ordine in cui è stata aggiunta la soluzione di rilevamento della fosfatasi alcalina.
Lascia la piastra per diversi minuti per garantire un'uniforme miscelazione di entrambe le soluzioni. Misura la densità ottica a 405 nanometri di ciascun pozzetto utilizzando un lettore ELISA. Avvia l'analisi dei dati aprendo la tabella dei dati grezzi.
Copia le colonne dal file Excel, apri Graph Pad Prism Five, apri un nuovo file di progetto nel Menu Principale e sotto nuovo dato e grafico, scegli il formato X Y. Scegli l'opzione Inserisci e Traccia un Singolo Punto per ciascun valore per l'asse Y e incollali nel foglio dati di Graph Pad Prism come valori X e y rispettivamente. Trasponi i valori di densità ottica a 405 nanometri in un formato colonna.
Nel foglio dati, la prima colonna rappresenta le concentrazioni come ligando aggiunto come valori X, mentre le colonne a destra contengono i valori del segnale delle otto curve di titolazione come valori Y. Poiché verrà tracciato un grafico semilogaritmico, l'ultima riga, che conta i segnali dei controlli privi di ligando, concentrazione zero, viene eliminata. Graph Pad Prism disegna il grafico che è visibile
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Panoramica
Questo articolo descrive un protocollo dettagliato per eseguire un'ELISA di titolazione al fine di determinare la costante di affinità delle interazioni recettore-legante. Viene introdotto un nuovo algoritmo per valutare i risultati in modo efficiente, facilitando la ricerca sulle interazioni proteiche e la farmacologia.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Chimica biochimica
- Farmacologia
Sfondo
- Comprendere le interazioni recettore-legante è fondamentale in diversi ambiti biologici.
- I metodi tradizionali possono presentare carenze in termini di efficienza e riproducibilità.
- L'ELISA in titolazione offre un approccio sistematico per misurare le affinità di legame.
- Un algoritmo innovativo migliora la valutazione dei dati garantendo una maggiore accuratezza.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo affidabile per la determinazione delle costanti di affinità.
- Facilitare la ricerca sulle interazioni proteina-ligando.
- Fornire uno strumento per applicazioni farmaceutiche.
Metodi Utilizzati
- Diluizione del dominio A dell'integrina alfa 2 in tampone TBS cloruro di magnesio.
- Rivestimento di piastre microtitolazione con la soluzione del recettore.
- Utilizzo di un nuovo algoritmo di valutazione per l'analisi dei dati.
- Confronto tra il dominio A dell'integrina alfa 2 di tipo selvaggio e mutante.
Risultati principali
- Il metodo consente una facile determinazione delle costanti di affinità.
- I risultati dimostrano riproducibilità tra prove diverse.
- L'algoritmo innovativo fornisce valutazioni accurate delle interazioni di legame.
- Le informazioni ottenute possono influenzare la ricerca farmaceutica e gli studi sui recettori.
Conclusioni
- Il metodo ELISA di titolazione è efficace per lo studio delle interazioni recettore-legante.
- L'algoritmo innovativo migliora in modo significativo l'efficienza dell'analisi dei dati.
- Questo approccio può far progredire la ricerca in varie scienze della vita applicate.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
La determinazione accurata delle costanti di dissociazione recettore-legante è essenziale per la validazione degli obiettivi e l'ottimizzazione dei composti iniziali nella scoperta di farmaci. Questo metodo di titolazione ELISA, potenziato da un nuovo algoritmo di regressione non lineare, consente misurazioni riproducibili dell'affinità senza ricorrere a stime grafiche, sostenendo decisioni basate sui dati di tipo sì/no. L'approccio migliora l'affidabilità predittiva nelle fasi iniziali della scoperta quantificando la forza di legame tra diverse varianti del legante e mutanti del recettore.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo Biofarmaceutica
Scoperta Precoce e Convalida del Target
- Valore scientifico: Consente il confronto quantitativo dell'affinità di legame dei ligandi per recettori di tipo selvaggio e mutanti, supportando la verifica di ipotesi sulle relazioni struttura-attività.
- Valore operativo: Fornisce direttamente il valore della costante di dissociazione a partire dai dati grezzi del segnale, riducendo la variabilità nel confronto delle affinità.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Genera curve di titolazione standardizzate per più ligandi contemporaneamente, consentendo lo screening parallelo di librerie di composti su bersagli immobilizzati.
- Valore operativo: Utilizza un rilevamento compatibile con ELISA, permettendo l'integrazione in piattaforme di immunodosaggio esistenti per analisi di affinità su larga scala.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Misura la concentrazione di recettori attivi al legame insieme al Kd, fornendo informazioni per prevedere l'interazione con il bersaglio in sistemi rilevanti per la malattia.
- Valore operativo: Fornisce parametri valutabili statisticamente a partire da curve di titolazione replicate, supportando decisioni di avanzamento con valutazione del rischio.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio all'identificazione del capostazione, in cui dati quantitativi sull'affinità guidano la priorizzazione e la riduzione del rischio meccanicistico.
- Discovery Biology: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche quantificando come le mutazioni o le modifiche alterino l'affinità di legame del ligando.
- Screening: Fornisce segnali di legame quantitativi e riproducibili, che permettono una valutazione affidabile dei composti su diverse concentrazioni.
- Analytics: Calcola la costante di dissociazione e la concentrazione del recettore mediante regressione non lineare, fornendo parametri confrontabili per l'analisi struttura-attività.
- Translational Research: Collega i dati di legame in vitro alla ricerca preclinica caratterizzando gli spostamenti di affinità nei recettori mutati, rilevanti per la resistenza ai farmaci.
- Enterprise Reuse: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per il profilo di affinità applicabile a diverse coppie proteina-ligando, riducendo la dipendenza da alternative a bassa produttività.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nelle interazioni tra target e ligandi attraverso la determinazione accurata e guidata da algoritmi della Kd.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la standardizzazione delle misurazioni di affinità tra laboratori e progetti.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo un rapido ordinamento per affinità di ligandi e mutanti, riducendo il rischio di fallimento in fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Facilita la priorizzazione dei candidati farmacologici in base al rischio, basandosi su dati quantitativi di legame e sul potenziale di interazione con il recettore.
Considerazioni per l'Implementazione
- Richiede competenze nella purificazione delle proteine, nelle tecniche di ELISA e nell'analisi di regressione non lineare mediante software come GraphPad Prism.
- Dipende dall'accesso a lettori di piastre microtitrate, sistemi di pipettaggio e controlli di incubazione per una titolazione riproducibile del ligando.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro riguardo alle condizioni di tampone, agli agenti bloccanti e ai protocolli di fissazione, al fine di ridurre al minimo la variabilità.
- Comporta considerazioni di adattamento nell'applicare il metodo a diverse coppie recettore-ligando, in particolare per quanto riguarda l'efficienza di immobilizzazione e la stabilità del ligando.
- Include limitazioni pratiche, come il potenziale danneggiamento dell'epitopo causato dalla fissazione con glutaraldeide, che deve essere validato empiricamente per ogni coppia bersaglio.
Domande frequenti di biofarmaceutica
Chapters in this video
0:04
Title
0:45
Immobilization of the Receptor (Integrin α2A-domain) to a Microtiter Plate
2:09
Preparation of a Serial Dilution Row of the Ligand (Rhodocetin)
3:25
Binding of Ligand at Different Concentrations to Immobilized Receptor
5:03
Quantification of Receptor-bound Ligand by ELISA
7:06
Evaluation of the Titration Signals
10:58
Conclusion
9:30
Results: Rhodocetin Binds with Lower Affinity to Mutant Integrin α2A-domain
