Una piattaforma microfluidica per Imaging longitudinale in Caenorhabditis elegans
2 maggio 2018
In questo articolo, dimostriamo live imaging dei singoli vermi che impiegano un dispositivo microfluidico personalizzato. Nel dispositivo, più vermi individualmente sono confinati per separare chambers, permettendo multiplex sorveglianza longitudinale di vari processi biologici.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di visualizzare longitudinalmente i processi dinamici nei nematodi adulti in condizioni ambientali controllate per il monitoraggio delle risposte comportamentali dei vermi e della cinetica dell'espressione genica dei vermi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave su come gli animali si adattano ai cambiamenti nel loro ambiente, comprese le differenze nei comportamenti di base, nell'espressione genica, nella memoria e nell'apprendimento. Questa tecnica consente l'osservazione longitudinale multiplex di singoli animali in ambienti controllati dinamicamente, nonché il campionamento simultaneo di molteplici aspetti dell'adattamento ad alta risoluzione.
Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso una comprensione quantitativa dell'adattamento animale, poiché l'acquisizione di dati cinetici ad alta precisione può facilitare la modellazione matematica e la formulazione e la verifica di ipotesi complesse. Per configurare il dispositivo per la procedura, collegare prima la punta della siringa di uscita a un pezzo di tubo siringa di 50 centimetri. Per realizzare un ago adattatore, utilizzare una pinza per estrarre l'albero dell'ago dal mozzo dell'ago di un ago calibro 20 per mezzo pollice e utilizzare un bruciatore Bunsen per rimuovere i residui di plastica rimanenti.
Tenendo entrambe le estremità dell'ago con una pinza, piegare l'ago adattatore in base alla geometria della configurazione sperimentale e inserire l'ago a metà nell'altra estremità del tubo della siringa di uscita. Quindi, collegare una punta della siringa di ingresso del tampone direttamente a una valvola a tre vie e collegare una siringa di ingresso del tampone a un pezzo di tubo della siringa di un metro. Inserendo l'ago adattatore a metà nell'estremità aperta del tubo, collegare la siringa di scambio del tampone a un pezzo di tubo siringa di 50 centimetri tramite la punta della siringa.
Collegare il tubo della siringa alla porta rimanente della valvola a tre vie e chiudere la valvola. Utilizzando un ago adattatore, collegare la siringa di ingresso della vite senza fine a un pezzo di tubo siringa di un metro come appena dimostrato. Quindi, sciacquare tutti i materiali due volte con S-medium e riempire le siringhe e i tubi risciacquati con S-medium fresco, avendo cura di rimuovere eventuali bolle d'aria.
Ora, collegare il tubo della siringa di uscita all'uscita del dispositivo e collegare l'ago adattatore all'estremità del tubo della siringa di uscita alla porta di uscita. Iniettare un piccolo volume di S-medium attraverso l'uscita per riempire il dispositivo fino a quando S-medium non fuoriesce sia dall'ingresso del tampone che da quello della vite senza fine. Collegare il tubo della siringa di ingresso del tampone alla porta di ingresso del tampone del dispositivo e tappare l'ingresso della vite senza fine con una spina di centraggio in acciaio inossidabile con un diametro di un trenta secondi di pollice.
Montare il dispositivo microfluidico su un microscopio a fluorescenza invertito con tavolino motorizzato e fissare una pompa a siringa a un agitatore vicino al microscopio in modo che la pompa non oscilli durante l'agitazione. Quindi, caricare la siringa di ingresso del tampone sulla pompa a siringa e impostare la pompa in modo che fornisca un flusso continuo di S-medium nel dispositivo a una portata di tre microlitri al minuto. Per caricare i batteri nel dispositivo microfluidico, caricare prima una nuova siringa con una sospensione ad alta densità di E.coli OP50.
Ruotare la siringa verticalmente e picchiettare più volte il cilindro per raccogliere tutte le bolle d'aria nella parte superiore della siringa. Spegnere l'agitatore orbitale e chiudere la valvola a tre vie delle siringhe di ingresso del tampone. Sostituire la siringa di ingresso del tampone con la siringa caricata con batteri ed espellere tutta l'aria raccolta nella parte superiore della siringa fino a quando una piccola parte della sospensione batterica non entra nel sistema di scambio del tampone e non rimangono bolle nella siringa caricata con OP50 o nella valvola.
Con la valvola chiusa, collegare la siringa carica di batteri alla pompa a siringa e accendere l'agitatore orbitale. Impostare la velocità di agitazione a circa 200 giri/min e la portata a 100 microlitri al minuto. Una volta che il tampone OP50 si è diffuso in tutto il dispositivo, reimpostare la portata a tre microlitri al minuto.
Per caricare il dispositivo con i nematodi, riempire prima una provetta per microcentrifuga a basso legame da 650 microlitri con 100 microlitri di sospensione OP50 fresca e utilizzare un plettro per trasferire individualmente da 20 a 30 giovani vermi adulti sincronizzati con l'età da una piastra di agar con terreno di crescita per nematodi alla provetta. Riempire la siringa di ingresso del verme e il tubo della siringa con una nuova sospensione OP50 e iniettare circa 500 microlitri di sospensione nella provetta della microcentrifuga. Quindi, aspirare la sospensione del vite senza fine nel tubo della siringa di ingresso del vite senza fine e collegare la siringa di ingresso del vite senza fine all'ingresso del vite senza fine.
Iniettare tutti i vermi attraverso il tubo della siringa di ingresso della vite senza fine nel dispositivo microfluidico e scollegare la siringa di ingresso della vite senza fine e il tubo della siringa. Ostruire l'ingresso della vite senza fine con uno spillo e sganciare la siringa di ingresso del tampone dalla pompa meccanica. Utilizzare la siringa di ingresso del tampone per spostare manualmente i vermi nei canali e la siringa di uscita per invertire il movimento dei vermi, se necessario.
Il caricamento degli animali richiede una certa coordinazione. Spingere delicatamente gli stantuffi della siringa per allinearli con il canale e spingere un po' più forte per spingere il verme fino in fondo. Quindi, lascia che i vermi si adattino al loro nuovo ambiente per due o tre ore prima di iniziare un esperimento.
I vermi sono confinati nei loro canali, ma non sono immobilizzati. La maggior parte dei vermi rimarrà nei propri canali per tutta la durata dell'esperimento, ma alcuni potrebbero sfuggire o rimanere impigliati nelle microfessure. Qui si possono osservare immagini in campo chiaro di un singolo verme rappresentativo nel corso di dieci ore nel dispositivo.
Utilizzando vermi transgenici che esprimono GFP sotto il promotore del gene della risposta immunitaria, dopo l'infezione da PA14 da P.Aeruginosa, l'espressione di GFP viene osservata nella parte centrale e nella coda del verme nelle prime cinque ore di esposizione al patogeno, aumentando fino a una robusta espressione di tutto il corpo nelle successive cinque ore. Il tracciamento della fluorescenza totale di ciascun verme in funzione del tempo post-infezione illustra le dinamiche dell'induzione del gene uno della risposta immunitaria, nonché la variabilità da verme a verme nei tempi e nell'entità dell'induzione. L'imaging time-lapse delle uova deposte dai vermi in ciascun canale consente di tracciare il numero cumulativo di uova deposte da ciascun verme in funzione del tempo post-infezione e cattura la variabilità tra animale e animale, nonché il declino indotto dal patogeno nella deposizione delle uova man mano che l'infezione progredisce.
Una volta padroneggiato, il dispositivo microfluidico può essere preparato e caricato in un'ora. Una volta che il dispositivo è stato caricato e i vermi si sono acclimatati, altri reagenti come farmaci specifici o segnali chimici di interesse possono essere somministrati ai vermi per rispondere a ulteriori domande sul controllo dei sistemi neuronali e genetici dei nematodi. Dopo il suo sviluppo, noi e i nostri collaboratori abbiamo usato questa tecnica per analizzare i comportamenti alimentari dei nematodi e le risposte genetiche dei vermi all'infezione da shock termico e alla fame in una varietà di ambienti.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare un dispositivo microfluidico per eseguire saggi longitudinali.
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Panoramica
Questo articolo dimostra un metodo per l'imaging in diretta di singoli vermi utilizzando un dispositivo microfluidico personalizzato. Il dispositivo permette la sorveglianza longitudinale multiplexed di vari processi biologici nei nematodi.
Componenti chiave dello studio
Area di scienza
- Neuroscienza
- Biologia
- Studi comportamentali
Contesto
- Comprendere l'adattamento animale ai cambiamenti ambientali.
- Investigare comportamenti di base ed espressione genica nei nematodi.
- Esplorare memoria e apprendimento in risposta agli stimoli.
- Utilizzare tecniche di imaging ad alta risoluzione per osservazioni dettagliate.
Obiettivo dello studio
- Immaginare longitudinalmente processi dinamici in nematodi adulti.
- Tracciare risposte comportamentali e cinetica dell'espressione genica.
- Facilitare la comprensione quantitativa dell'adattamento animale.
Metodi utilizzati
- Dispositivo microfluidico personalizzato per il confinamento individuale dei vermi.
- Imaging longitudinale in condizioni ambientali controllate.
- Campionamento simultaneo di molteplici aspetti biologici.
- Tecniche di osservazione ad alta risoluzione.
Risultati principali
- Tracciamento di successo dei comportamenti dei vermi nel tempo.
- Osservazione dettagliata della dinamica dell'espressione genica.
- Intuitioni sui meccanismi di adattamento nei nematodi.
- Potenziale per la modellazione matematica dei processi biologici.
Conclusioni
- La tecnica fornisce un quadro per studiare l'adattamento animale.
- L'acquisizione di dati ad alta precisione aiuta nel test delle ipotesi.
- Questo metodo può migliorare la comprensione delle risposte comportamentali e genetiche.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Longitudinal microfluidic imaging in Caenorhabditis elegans enables high-resolution, multiplexed tracking of behavioral and gene expression dynamics under controlled conditions. This capability supports predictive confidence in early discovery by quantifying adaptation and response kinetics at the single-animal level. The approach enhances mechanistic de-risking and informs translational continuity for target validation and pathway interrogation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of adaptive responses to environmental or pathogenic stimuli.
- Supports functional target validation by tracking gene expression and behavioral phenotypes in real time.
- Facilitates mechanistic de-risking through multiplexed, longitudinal observation of individual animals.
- Provides high-precision kinetic data for mathematical modeling and hypothesis testing.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, live biological systems for downstream compound or genetic screening workflows.
- Delivers standardized, reproducible, and quantitative outputs for behavioral and gene expression assays.
- Enables scalable, multiplexed analysis of multiple animals in parallel for robust screening readiness.
- Supports reliable evaluation of compound effects on dynamic biological processes.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant modeling by enabling infection and stress-response studies in vivo.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by capturing longitudinal adaptation data.
- Supports risk-adjusted advancement decisions with quantitative, time-resolved phenotypic outputs.
- Enhances predictive de-risking for translational biomarker identification.
Pipeline & Workflow Integration
This microfluidic imaging platform integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical validation.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification by enabling real-time tracking of gene expression and behavior.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible, and quantitative outputs for compound or genetic perturbation studies.
- Analytics: Generates high-precision kinetic measurements and statistical outputs for condition comparison and modeling.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and preclinical continuity by modeling infection and adaptation in vivo.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, adaptable platform for diverse mechanistic and phenotypic studies across R&D teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable workflows for longitudinal studies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust, quantitative data early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of candidates based on dynamic phenotypic evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics, live imaging, and quantitative data analysis.
- Needs access to fluorescence microscopy and microfluidic fabrication or procurement capabilities.
- Demands cross-team standardization for data acquisition and interpretation.
- Adaptable to various genetic backgrounds and environmental conditions in C. elegans.
- Potential limitations include animal escape or entanglement and the need for careful device handling.
