Optogenetica trascinamenti di teta Hippocampal oscillazioni nel comportarsi topi

Descriviamo l'uso di optogenetica e registrazioni elettrofisiologiche per manipolazioni selettive delle oscillazioni di teta hippocampal (5-10 Hz) in topi si comporta. L'efficacia di trascinamento ritmo è controllata mediante potenziali di campo locale. Una combinazione di opto - e farmacogenetica inibizione indirizzi la lettura efferente di sincronizzazione hippocampal.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della neurofisiologia, come il ruolo causale dell'oscillazione theta nella navigazione speciale e nei comportamenti associati. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente un controllo in tempo reale sulla frequenza e la regolarità delle oscillazioni theta dell'ippocampo nei topi che si comportano. A dimostrare la procedura sarà la dottoressa Franziska Bender, ex studentessa laureata nel mio laboratorio.

Inizia con il topo completamente anestetizzato fissato nel telaio stereotassico. Praticare un foro sopra il setto mediale. Immergere la punta dell'ago per iniezione in una gocciolina di virus su un pezzo di pellicola di paraffina e aspirare con cura il virus a circa 500 nanolitri al minuto osservando il livello del fluido.

Per evitare che l'aria entri nell'ago per iniezione, interrompere l'astinenza prima che il virus sia completamente assorbito. Pulisci l'ago con un fazzoletto di carta. Controllare che il virus e l'olio siano separati da una bolla d'aria e segnare il livello del virus sulla provetta.

Posizionare l'ago sopra la craniotomia e inserirlo lentamente nel cervello al primo punto di iniezione. Iniettare 450 nanolitri di virus a una velocità compresa tra 100 e 150 nanolitri al minuto. Dopo l'iniezione, attendere 10 minuti.

Dopo 10 minuti, spostare con cautela l'ago verso l'alto di 0,1 millimetri e attendere altri cinque minuti. Utilizzare un micro stripper per rimuovere 125 micrometri di rivestimento da una fibra ottica multimodale mentre la fibra è ancora attaccata alla bobina di fibra. Quindi, usa un coltello diamantato per tagliare la fibra a una lunghezza di circa due o tre centimetri.

Inserire la fibra ottica in una boccola in ceramica di zirconio con un diametro interno di 126 micron. Circa 0,5-un millimetro di fibra dovrebbe sporgere dal lato convesso della ghiera. Usando un ago, applica una goccia di colla epossidica su entrambe le estremità della ghiera, ma non sui lati della ghiera.

Dopo l'essiccazione, utilizzare una pellicola lucidante in fibra diamantata con grana da tre micron per lucidare il lato convesso della ghiera. Per preparare l'array di fili di tungsteno, incollare prima diverse guide per tubi di silice da 100 micron sul lato adesivo di un pezzo di nastro adesivo. Quindi utilizzare una pinza per infilare fili di tungsteno da 45 micron isolati in formvar attraverso i tubi guida.

Quindi, usa un bisturi per spellare l'isolamento da entrambe le estremità di sei fili di rame sottili isolati in smalto lunghi circa cinque millimetri. Quindi spellare l'isolamento da entrambe le estremità di un filo di messa a terra lungo circa due o tre centimetri. Saldare ogni filo spellato ai pin del nanoconnettore.

Collegare ciascun filo di collegamento a un filo di tungsteno utilizzando una goccia di vernice conduttiva all'argento. Dopo l'asciugatura, applicare una piccola quantità di cemento per coprire i fili di rame. Evitare di applicare cemento sulla parte superiore del nanoconnettore.

Dopo aver lasciato asciugare il cemento per almeno 30 minuti, utilizzare forbici smussate in acciaio inossidabile per tagliare i fili di tungsteno con un angolo da cinque a 20 gradi. Iniziare praticando quattro fori di 0,8 mm di diametro nel cranio pulito dell'animale anestetizzato. praticare due fori rostrali alla sutura coronale e due sopra il cervelletto.

Quindi, posizionare le viti ossee in acciaio inossidabile per la messa a terra e la stabilizzazione dell'impianto. Posizionare la vite di messa a terra collegata a un filo di rame sopra il cervelletto. Coprire completamente la vite di messa a terra con cemento per evitare artefatti muscolari durante le registrazioni elettrofisiologiche.

Costruisci un anello di mento che colleghi tutte le viti. Eseguire una craniotomia sopra il sito di impianto, quindi applicare circa un microlitro di soluzione fisiologica sterile sulla superficie del tessuto cerebrale. Usa la stereolisi per abbassare lentamente l'array di fili nella craniotomia.

Quindi applicare circa cinque microlitri di cera liquida calda sopra il sito di impianto per proteggere il tessuto cerebrale. Applicare il cemento attorno alla matrice di fili e coprire il cranio con cemento. Applicare una goccia di flusso sul filo di terra presaldato o sul filo presaldato collegato alla vite di messa a terra e fondere i fili utilizzando una saldatrice.

Infine, coprire l'intero filo di terra con cemento. Controllare l'emissione luminosa dal cavo patch. Se la velocità di trasmissione della fibra impiantata era del 50%assicurarsi che l'emissione luminosa sulla punta del cavo patch sia di 20 milliwatt.

Collegare il preamplificatore dello stadio principale al connettore impiantato e collegare il cavo patch in fibra ottica alla fibra ippocampale impiantata per la stimolazione optogenetica. Registrare il comportamento di base per una durata appropriata per i parametri da misurare. Aprire il software per controllare il generatore di stimoli.

Fare clic su file, aprire e selezionare il file di protocollo desiderato. Fare clic su download e avviare la stimolazione luminosa. Osservate il controllo del ritmo theta da parte degli impulsi luminosi.

Qui si vede il potenziale di campo locale dell'ippocampo durante le oscillazioni spontanee theta. Si notino gli inviluppi gamma, un indicatore del ritmo theta fisiologico. Qui si osserva il potenziale di campo locale dell'ippocampo a sette hertz durante il trascinamento optogenetico.

Le strisce blu indicano le finestre temporali di applicazione della luce. Notare il ripristino di fase tramite l'impulso luminoso indicato qui da una freccia. Il potenziale di campo locale dell'ippocampo a 10 hertz riflette il trascinamento optogenetico.

Si noti che gli inviluppi gamma ad aggancio di fase e l'inversione di fase tra Stratham Orians e Stratum radiatum viene mantenuta anche durante il trascinamento. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in quattro ore di esperimento, più sei settimane per l'espressione virale. Durante il tentativo di questa procedura, è essenziale ricordare di garantire un'efficiente trasduzione virale.

Collegare correttamente l'impianto in fibra ottica al cavo patch e ottenere una buona qualità delle oscillazioni theta del potenziale di campo locale spontaneo.