Name: Enhanced Genome Editing con Cas9 ribonucleoproteina nelle Diverse cellule e degli organismi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Scopri l'editing genomico con complessi ribonucleoproteici Cas9 per modifiche mirate in cellule umane primarie e organismi modello. Questo metodo offre maggiore efficienza e minori effetti off-target rispetto al DNA plasmidico.

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Ringraziamo il precedenti molti membri dei nostri laboratori e la comunità di editing di genoma Bay Area per il loro contributo allo sviluppo di questi metodi. Ringraziamo Ross Wilson per la lettura critica di questo manoscritto.
Ricerca di Alexander Marson è supportato da un regalo dal Jake Aronov e concedere un National Multiple Sclerosis Society (CA 1074-A-21). Alexander Marson detiene un premio alla carriera per gli scienziati medici del Burroughs Wellcome fondo ed è un investigatore di Biohub Zuckerberg Chan. Ricerca di Jacob E. Corn è supportato dai Li Ka Shing Foundation, il patrimonio Medical Research Institute Medical e il California Institute for Regenerative Medicine. Behnom Farboud e di Barbara J. Meyer ricerca è finanziata in parte dalla concessione NIGMS R01 GM030702 a Barbara J. Meyer, che è un ricercatore dell'Howard Hughes Medical Institute. Ricerca Erin Jarvis e Nipam H. Patel è stato in parte finanziata dalla sovvenzione NSF IOS-1257379 ed Erin Jarvis riconosce sostegno da un GRFP NSF e una borsa di studio Philomathia.

Gli autori Alexander Marson e Jacob E. Corn sono co-fondatori di Spotlight terapeutica. Jacob E. Corn è un consulente missione terapeutica e suo laboratorio ha ricevuto il sostegno di ricerca sponsorizzata da AstraZeneca e Pfizer. Alexander Marson è un consigliere di Juno Therapeutics e patto Therapeutics, e il suo laboratorio ha ricevuto il sostegno di ricerca sponsorizzata da Juno Therapeutics, Epinomics e Sanofi. Suo laboratorio ha anche applicato per brevetti relazionati alla tecnologia Cas9 RNP.

Che istituisce un genoma robusto protocollo di modifica in una cella, riga o organismo di interesse richiede l'ottimizzazione ed empirica test di vari parametri chiave, discussi in questa sezione. Cercando alcune variazioni degli approcci generali qui presentati è fortemente incoraggiata. La limitazione di chiave di questo protocollo è che applicando questi metodi ad altre cellule o organismi possono condurre ad un risultato diverso a seconda della specie studiata, e un disegno sperimentale che conduce a un knockout del gene ad alta efficienza non può promuovere l'inserimento di DNA. Pertanto, si consiglia di iniziare con i metodi qui presentati e risoluzione dei problemi come descritto di seguito.
Risoluzione dei problemi di qualità di reagente di editing genomico: Generazione o l'acquisto di reagenti di alta qualità è un passo fondamentale in qualsiasi protocollo di modifica di genoma. Cas9 proteina possa essere purificata in laboratorio o acquistata in commercio. Molti protocolli di notare una concentrazione finale per Cas9 nelle ricette di RNP, ma il gene ottimo attività di editing dipenderà l'attività specifica di qualsiasi preparazione individuale per la proteina Cas9, che varia a seconda della fonte. Una volta che il protocollo presentato qui sta lavorando, considera l'ottimizzazione della quantità di RNP utilizzato da titolazione Cas9 livelli per stabilire una concentrazione ottimale: uno che fornisce la fenditura del DNA target altamente specifico senza inutili fuori bersaglio scissione causata da eccessivo Cas940.
Guida RNA purezza e omogeneità può anche essere fattori determinanti del successo22di editing genomico. SgRNAs acquistati o componenti separati di crRNA e tracrRNA sono generalmente alta qualità reagenti e una varietà di modificazioni chimiche sono disponibili per combattere i problemi con degradazione di RNA o di infondere caratteristiche aggiuntive a RNP91. Mentre modificati chimicamente gRNAs potrebbe non essere necessario per standard genoma esperimenti di editing, alcuni gruppi hanno osservato molto più alti di editing efficienze con tali reagenti, quindi potrebbero essere la pena di provare dopo il processo di mastering e/o quando gRNA degradazione sembra essere un problema22,91. Trascrizione in vitro e gel successiva purificazione è un'alternativa economica, che può essere sufficiente per routine genoma esperimenti17,21,49,50di editing. Ulteriormente, i diversi approcci che sono comunemente applicato per produrre omogenea gRNA popolazioni in vivo, compreso l'asportazione ribozima e tRNA-based di singole guide, può essere esteso a in vitro preparazione di RNA per generare pulitore prodotti92.
Donatore del DNA e RNA guida progettare suggerimenti: Selezione di RNA di guida è un fattore critico nel raggiungimento di editing on target altamente efficiente, riducendo al minimo le probabilità di fenditura fuori bersaglio. Per facilitare la selezione della guida, parecchi studi hanno utilizzato schermi di alto-rendimento accoppiati con sequenziamento di nuova generazione per compilare caratteristiche di sequenza di successo guide47,79,93,94, 95,,96. Queste caratteristiche sono state utilizzate per sviluppare algoritmi predittivi e strumenti online per aiutare nella guida selezione44,45,46,47,48. Tali algoritmi sono fondati su schermi utilizzando sistemi basati su DNA per guida espressione del RNA. Guide sono espresse utilizzando un promotore Pol III, e pertanto la loro espressione è soggetta alle limitazioni associate trascrizione Pol III, ad esempio la terminazione prematura quando rileva tracce di uracile97,98, 99. Tuttavia, l'uso di RNP fatto con in vitro-guida sintetizzato RNAs ignora tali preoccupazioni e semplifica i vincoli sul design di guida. Una caratteristica comune che è emerso da questi algoritmi ed è stata confermata in numerosi studi con l'editing genomico altamente efficace, è la presenza di una purina, particolarmente una guanina, all'estremità 3 ' della sequenza target-specifici della guida. Questa funzionalità di guida ha avuto molto successo tra gli organismi che vanno dai mammiferi di c. elegans, moscerini della frutta e zebrafish65,100,101. Inoltre, per c. elegans, progettazione di guide con un dinucleotide GG all'estremità 3 ' della regione di destinazione della guida è una strategia efficace per la predizione di guida altamente efficace RNAs65. Idealmente, è possibile testare più guide in parallelo per determinare quale è il maggior successo per una determinata applicazione.
Quando si tenta di introdurre una sequenza di DNA nel genoma, il design del donatore o del modello del DNA è anche cruciale. Donatori di singolo-incagliato oligonucleotide (ssODNs) vengono inseriti in modo più affidabile rispetto a altri modelli tipici riparazione, lineare double-stranded e plasmide DNA54,55,102. Alcuni loci, HDR efficienza può essere migliorata con ssODNs che sono complementari alle non-bersaglio o sfollati filo del DNA e possedere armi di omologia che sono asimmetriche in lunghezza27,55. Poiché il modello di riparazione viene inserito nel sito di taglio e comprende la sequenza mirata, deve intraprendere per impedire che Cas9 fendendo il donatore del DNA prima o dopo l'inserimento di genomica. Questa operazione viene eseguita facendo mutazioni silenti per la sequenza di PAM o la regione di seme, evitando il riconoscimento di Cas9 pur mantenendo la funzione del gene inserito21,103. Se anche singolo nucleotide cambia il PAM hanno probabilità di abolire associazione104, provare a cambiare almeno quattro nucleotidi per essere sicuri.
Significato e applicazioni future: Editing con CRISPR-Cas9 genomico è emerso come un potente metodo che consente di facile manipolazione genetica di qualsiasi organismo. Editing con il RNP Cas9 prende un po' più sforzo in un primo momento, ma è semplice da usare una volta reagenti e protocolli sono stabiliti in un laboratorio. Modifica delle celle con pre-assemblati RNP invece di DNA del plasmide conduce a una maggiore efficienza di editing generale, compreso l'inserimento del gene difficile da raggiungere via HDR, con meno effetti fuori bersaglio24,25,26 , 27 , 29. Inoltre, gli sperimentatori evitare problemi con l'espressione genica, RNA degradazione, piegatura della proteina e l'associazione tra gRNA e Cas9 molecole sintetizzate separatamente all'interno della cella22,23. Modifica di RNP elude anche preoccupazioni di sicurezza per mutagenesi inserzionale e sostenuta espressione che può sorgere quando i metodi di consegna virali sono usati clinicamente14. A causa di questi vantaggi, molti scienziati conducendo pre-clinici, esperimenti di proof-of-concept bomboniera RNP editing per applicazioni terapeutiche umane. In vivo ed ex vivo basato su RNP genoma editing approcci sono in sviluppo a trattare o curare anche una varietà di condizioni, da malattie genetiche come Duchenne distrofia muscolare105 e cellule falciformi27 a L'HIV1129 e cancro. Interessante, Cas9 RNP viene impiegato sempre più come un metodo di consegna per ingegneria agricola perché permette di 'DNA-free' editing delle piante33,34,36.

Fil CRISPR-Cas9 sistema permette agli scienziati di alterare regioni mirate di qualsiasi genoma1. Questa tecnologia veloce e poco costoso ha rivoluzionato la ricerca di base e promette di rendere un profondo impatto sullo sviluppo di terapie personalizzate di malattia, l'agricoltura di precisione e oltre2. CRISPR editing è uno strumento di democratizzazione e implementazione del sistema in un nuovo laboratorio non richiede nessuna particolare esperienza nelle competenze di biologia molecolare del genoma engineering, solo di base. I ricercatori possono ora studiare organismi precedentemente insolubili con pochi mezzi alternativi per manipolazione genetica3,4. Negli ultimi cinque anni da solo, CRISPR editing genomico è stato usato per ingegnere oltre 200 differenti classi di vertebrati, invertebrati, piante e specie microbiche.
Adattato dal pathway di prokaryotic difesa CRISPR, gli elementi fondamentali necessari per l'editing di genoma site-specific sono le proteine Cas9, in genere da S. pyogenes e codone-ottimizzato con un segnale di aggiunta la localizzazione nucleare (NLS) e la sua specializzati RNA Guida5,6. Anche se non è discusso qui, altri Cas9 ortologhi o endonucleasi CRISPR possono anche essere utilizzati. Il gRNA natura è composto di due pezzi separatamente trascritti, il RNA CRISPR (crRNA) e il trans-attivazione crRNA (tracrRNA)7. Questi RNA possono essere fuse in una singola trascrizione, nota come il singolo-guida RNA (sgRNA)8. Maggior parte degli editor di genoma scegliere la snella sgRNA9, anche se il dual-guida è anche usato regolarmente10,11. Gli sperimentatori scegliere un bersaglio di DNA genomico 20 nucleotidi (nt), assicurando che si trova accanto a una breve firma licenza necessaria per il riconoscimento di Cas9, chiamato un motivo adiacente protospacer (PAM) e progettare una gRNA che contiene la sequenza complementare12 .
Una volta all'interno della cellula, il complesso RNP individua il bersaglio genomic, le coppie di basi gRNA con il DNA complementare per ogni fila, e quindi l'enzima idrolizza due filamenti di DNA per generare un doppio filo rompono2. Meccanismo di riparazione del cellulare consente di correggere il DSB da uno di almeno due vie: via pathway (NHEJ) errori non-omologo fine-assemblaggio o la riparazione di omologia-diretto (HDR), che incorpora perfettamente DNA contenente 'armi' di omologia su entrambi i lati della rottura. Il sentiero di riparazione ex in genere conduce alla indel formazione e rottura del gene conseguente, mentre quest'ultimo permette di sperimentatori inserire o modificare il DNA sequenze1.
L'efficienza e la precisione di editing dipendono i mezzi con cui Cas9 e gRNA immettere nella cella. Questi componenti possono essere consegnati a cellule coltivate, embrioni o organismi sotto forma di acidi nucleici o come un preassemblato RNP complesso13,14,15. Metodi basati su acido nucleico consegna comuni includono la trasduzione virale, transfezione o elettroporazione di mRNA o di DNA plasmidico. Guida RNA e proteina Cas9 vengono poi prodotti all'interno della cellula e si associano per formare un complesso.
La consegna diretta di RNP richiede la purificazione separata della Guida RNA e proteina Cas9. Questo può essere fatto in casa, o la proteina e sgRNA possono essere acquistati da uno dei diversi fornitori commerciali. Una volta acquisito, il Cas9 e gRNA sono mescolati per formare il complesso RNP enzimaticamente competente e presentare alle cellule di iniezione diretta in embrioni e le uova fecondati, trasfezione basata sui lipidi16o elettroporazione. Il primo rapporto di RNP editing compreso iniezione in c. elegans gonadi17. Microiniezione è ancora il mezzo preferito di introdurre RNP nel embrioni e interi organismi, anche se efficace elettroporazione è stata dimostrata in18,19 e ratto20 embrioni di topo. Descriviamo i protocolli per iniettare direttamente RNP gonadi di c. elegans e p. hawaiensis embrioni e consiglia un tipo specializzato di elettroporazione di consegnare RNP durante la modifica di cellule umane primarie. Questo metodo, il nucleofection, coinvolge ottimizzato elettroporazione programmi e soluzioni specifiche per tipo di cella e permette il RNP entrare sia il citoplasma e il nucleo21.
L'editing genomico con RNP offre diversi vantaggi distinti. Poiché i componenti di RNA e proteine sono pre-assemblati e qualità può essere assicurata prima della consegna, RNP editing evita molti trabocchetti connessi con la consegna dell'acido nucleico-basato. Vale a dire, non c'è alcun rischio di integrazione Cas9-codifica del DNA nel genoma ospite, mRNA non è mai esposto per degradazione ed elude problemi con in vivo gRNA o proteina espressione, pieghevole e associazione22,23. Inoltre, utilizzando RNP conduce per abbassare la tossicità e molti meno eventi fuori bersaglio rispetto l'espressione basata su plasmide, un risultato della più breve emivita di RNP dentro la cella24,25,26,27.
Infine, in modo dimostrabile RNP modifica porta ad alti tassi di editing in una varietà di linee cellulari umane, cellule primarie come fibroblasti, cellule staminali embrionali (ESCs), indotta da cellule staminali pluripotenti (iSPCs), HSPCs, e cellule di T16,24, 25,26,27,28,29; negli invertebrati, tra cui c. elegans, p. hawaiensise mosche della frutta3,17,30; in specie di vertebrati come zebrafish, topi e ratti31,32; nel piantare specie tra cui Arabidopsis, tabacco, lattuga, riso, vite, mela, mais e grano33,34,35,36; e in Chlamydomonas, Penicilliume Candida specie37,38,39. La frequenza di formazione di indel può essere più elevata quando si utilizza RNP rispetto alla consegna del plasmide e inserimento di HDR-mediato del DNA può essere più facile raggiungere25,27,29.
Il protocollo descritto qui utilizza il RNP Cas9 ed è una tecnica efficace, facilmente adattabile che è semplice da applicare a una vasta gamma di sistemi biologici40,41, soprattutto nelle cellule che sono altrimenti difficili da lavorare con e negli organismi senza sistemi affermati per la manipolazione genetica precisa. Iniziamo descrivendo come progettare, ottenere e assemblare il RNP Cas9 prima di coprire il suo utilizzo attraverso organismi e modello diversi tipi di cellule. Cellule staminali/progenitrici ematopoietiche (HSPCs) e cellule T vengono modificate utilizzando lo stesso metodo, il nucleofection, quindi sono coperti insieme nei passaggi 2 e 3 del presente protocollo. Procedure di editing per C. elegans sono descritte nei passaggi 4 e 5 e P. hawaiensis editing è coperto nei passaggi 6 e 7. Infine, poiché il successo di un esperimento di modifica del gene in qualsiasi organismo può essere valutato mediante sequenziamento di genotipo, sottopassaggi che descrive i metodi di analisi possibile per tutte le cellule e organismi descritti nel protocollo sono indicate nel passaggio 8.

<table><tbody><tr><td>Reagenti/Materiali</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA oligonucleotidi</td><td>Integrated DNA</td><td></td> <td>Technologies-IDT fornirà sequenze di DNA personalizzate, comprese quelle nella Tabella 1</td></tr><tr><td>RNA guida</td><td>Synthego-Synthego</td><td></td> <td>fornirà sgRNA di alta qualità per S. pyogenes Cas9, inclusi sgRNA personalizzati contenenti le sequenze di targeting incluse nella Tabella 1</td></tr><tr><td>Proteina Cas9 purificata (EnGen&nbsp; Cas9 NLS,&nbsp;S. pyogenes)</td><td>New England Biosciences</td><td>M0646T</td><td>Se possibile, la purificazione di Cas9 in-house o l'acquisto da strutture di base locali è un'opzione meno costosa</td></tr><tr><td>Cellule staminali/progenitrici CD34+ nel sangue periferico normale</td><td>AllCells</td><td>PB032-2</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan SFEM&nbsp;</td><td>StemCell Technologies</td><td>09650</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan CC110</td><td>StemCell Technologies</td><td>02697</td><td></td></tr><tr><td>P3 Cellula primaria 4D-Nucleofector X Kit</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3032</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium, Con bicarbonato di sodio, senza L-glutammina, liquido</td><td>Sigma</td><td>R0883-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>EasySep&trade; Kit di isolamento delle cellule T umane</td><td>Stemcell</td><td>17951</td><td></td></tr><tr><td>piastra per colture cellulari, 96 pozzetti, rotonda</td><td>Fisher Scientific</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28</td><td>Life Tech</td><td>40203D&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Reombinant Human IL-2</td><td>UCSF Pharmacy</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>SepMate-50 500-pack IVD</td><td>Stemcell Technologies</td><td>85460</td><td></td></tr><tr><td>OP50 Escherichia coli</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>OP-50</td><td>https://cgc.umn.edu/</td></tr> <tr><td>Naematode Growth Media agar in piastre di Petri</td> <td>-</td><td></td> <td>Vedi Stiernagle, T (ref. 59)</td></tr><tr><td>Capillari standard in vetro borosilicato con filamento:&nbsp; 4 pollici (100 mm), 1/0,58 OD/ID</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Capillari in vetro borosilicato standard a cilindro singolo: 6 pollici (152 mm), 2/1,12 OD/ID&nbsp;</td><td>Strumenti di precisione mondiali</td><td>1B200-6&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Vetro di copertura; 24 & 50 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-544E</td><td></td></tr><tr><td>Vetro di copertura; 22 & volte; 22 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-518-105K</td><td></td></tr><tr><td>Apex LE agarosio</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-102</td><td></td></tr><tr><td>Olio alocarbonico 700</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>H8898-100ML</td><td></td></tr><tr><td>pCFJ90 plasmide</td><td>Addgene</td><td>19327</td><td></td></tr> Piastre di coltura <tr><td>con azoto-60</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>mM</td><td>compresse BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Provette capillari con filamento: 4 pollici (1,0 mm)&nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>T2100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri (100 &volte; 15 mm)</td><td>-</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filo di tungsteno (0,005 pollici di diametro)</td><td>Ted Pella</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perfluoroalcossi-alcano (PFA)</td><td>-</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sale</td> <td>marino-9</td><td></td><td></td></tr><tr><td>" pipette pasteur</td><td>-</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rosso fenolo-Senza</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>nucleasi acqua</td><td>-</td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>Attrezzatura</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4D Nucleofector</td><td>Lonza</td><td>AAF-1002X</td><td></td></tr><tr><td>MZ75&nbsp; Stereomicroscopio</td><td>Leica</td><td>Fuori produzione. Il modello attuale è lo stereomicroscopio</td><td></td>M80</tr><tr><td>Axio Vert35 microscopio fluorescente a contrasto di fase invertito</td><td>Zeiss</td><td>fuori produzione. Il modello attuale è l'estrattore per micropipette basato su laser Axio VertA.1</td><td></td></tr><tr><td>(per il protocollo C. elegans)</td><td>Sutter Instrument&nbsp;</td><td>FG-P2000</td><td></td></tr><tr><td>Microiniettore Picoliter (per protocollo C. elegans)</td><td>Warner Instruments</td><td>PLI-100A</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipolatore oleodinamico a joystick a tre assi</td><td>Narishige International</td><td>MO-202U</td><td></td></tr><tr><td>Manipolatore grossolano</td><td>Narishige International</td><td>MMN-1</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore per micropipette (per protocollo P. hawaiensis)</td><td>Sutter Instrument&nbsp;</td><td>P-80/PC</td><td></td></tr><tr><td>Microiniettore (per protocollo P. hawaiensis)</td><td>Narishige</td><td>IM300</td><td></td></tr><tr><td>Microloader puntali per pipette</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>NG-agar</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

enhanced genome editing con cas9 ribonucleoproteina nelle diverse cellule e degli organismi

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

L'editing genomico eucariotica site-specific con CRISPR (cluster regolarmente interspaziati brevi ripetizioni palindromi)-sistemi di Cas (CRISPR-associata) è rapidamente diventato un luogo comune tra i ricercatori perseguire un'ampia varietà di domande biologiche. Gli utenti utilizzano più spesso la proteina Cas9 derivata da Streptococcus pyogenes in un complesso con una guida facilmente riprogrammata RNA (gRNA). Questi componenti vengono introdotti nelle cellule, e attraverso una base in abbinamento con una regione complementare del genoma doppia elica (dsDNA), l'enzima si unirà entrambi i fili per generare una rotture a doppio filamento (DSB). Riparazione successiva conduce a inserimento casuale o cancellazione eventi (indels) o l'incorporazione di DNA forniti da sperimentatore presso il sito della rottura.
L'uso di un singolo-guida RNA e Cas9 proteina purificata, preassemblati per formare un RNP e consegnati direttamente alle cellule, è un approccio potente per raggiungere gene altamente efficiente di editing. RNP editing particolarmente migliora il tasso di inserimento del gene, un risultato che è spesso difficile da raggiungere. Rispetto alla consegna tramite un plasmide, la più breve persistenza della RNP Cas9 all'interno della cellula conduce a meno eventi fuori bersaglio.
Nonostante i suoi vantaggi, molti utenti occasionali di CRISPR gene editing hanno meno familiari con questa tecnica. Per abbassare la barriera di ingresso, abbiamo delineare protocolli dettagliati per l'attuazione della strategia di RNP in una gamma di contesti, evidenziando i vantaggi distinti e le diverse applicazioni. Ci occupiamo di editing in due tipi di cellule umane primarie, le cellule T e le cellule staminali/progenitrici ematopoietiche (HSPCs). Mostriamo anche come Cas9 RNP editing consente la facile manipolazione genetica di interi organismi, tra cui il verme Caenorhabditis elegans di modello classico e più recentemente introdotto crostaceo di modello, Parhyale hawaiensis.

Questi esperimenti Visualizza come pre-assemblati Cas9 RNP può essere utilizzato per manipolare il genoma di cellule primarie e interi organismi. I ricercatori purificano o acquistare sgRNA e proteina Cas9, combinano i due componenti per la pre-formare il complesso e introducono il RNP in loro cellule o organismo di interesse. Dopo aver lasciato abbastanza tempo per l'editing per verificarsi e per la prole di ultima generazione per essere Nato (se applicabile), controllare i fenotipi e/o raccogliere le cellule per la genotipizzazione. Fenotipi possono essere osservati tramite saggi funzionali, analisi di espressione, visualizzazione (ad occhio o con microscopia) o altri metodi, a seconda dell'esperimento.
Ad esempio, HSPCs che sono stati modificati per correggere la mutazione di β-globina che causa anemia falciforme può essere differenziato in eritrociti e analizzati per la produzione di sano o la falce dell'emoglobina27,87 (Figura 1 A). T le celle modificate a knock out del gene del ricevitore di IL-2 ad alta affinità, CD25 (IL2RA), possono essere analizzati dalla macchiatura superficiale e flusso cytometry88e funzionalmente analizzati per rilevare una segnalazione risposta a stimolo del-2 (Figura 1B ). L'efficacia antitumorale in vivo di auto-T cellule11e cellule T possono anche essere riprogrammate in molti modi clinicamente importanti che richiedono la valutazione di diversi fenotipi, tra cui l'efficacia di HIV infezione89 .
Utilizzando un approccio di screening co-CRISPR/co-conversion, c. elegans worm vengono modificati contemporaneamente a due loci62. HDR al gene di riferimento dpy-10 utilizzando un ssODN riparazione risultati di modello in una mutazione di guadagnare-de-funzione facilmente segnato dominante dpy-10 . Eterozigoti F1dpy-10(gof) animali sono rullo (Rol) e gli animali omozigoti dpy-10(gof) sono losca (Dpy). La presenza del fenotipo indica che Cas9 l'editing si è verificato in questi animali e migliora le probabilità di individuare un evento editing presso il secondo locus negli animali1 Rol o Dpy F. 33-50% di iniettato P0 vermi producendo 20 o più prole1 F che sono Rol o Dpy90dovrebbe provocare un esperimento riuscito di editing. Quindi è possibile scegliere gli animali non-Rol tornare dpy-10 wildtype e selezionare per la modifica omozigotica di interesse. Come regola generale, la concentrazione di crRNA del gene di riferimento co-CRISPR di targeting dovrebbe essere metà che del crRNA di mira il gene di interesse. Se una modifica del gene di interesse non viene recuperata, i rapporti dei due CRISPR RNA possono essere regolati per aumentare le probabilità di recuperare la mutazione desiderata. Per esempio, aumentando la quantità di crRNA per il gene di interesse riguardante la crRNA del gene di riferimento aumenterà la percentuale di vermi che possiedono modifiche nel gene di interesse all'interno della popolazione di vermi che possiedono anche modifiche al luogo del gene di riferimento. Frequenze di co-conversione variano, ma le tariffe sono in genere 20-60%, spesso producendo omozigotiche modifiche nella generazione1 F (Figura 1C).
P. hawaiensis hatchlings che sono state omesse per buttare giù il gene Addominale-B (Abd-B) visualizzare anomalie morfologiche chiaro3 (Figura 1D). Questo gene è necessario per la corretta addominale modellatura, e relativi risultati di rottura in toracica tipo saltando e zampe sostituendo le gambe nuoto e ancoraggio che sono di solito presentano sull'addome.
Determinare esiti a livello genotipico di editing genomico richiede sequenziamento o un'analisi in vitro che rileva le variazioni di sequenza. Qui, indichiamo dati di sequenziamento rappresentante dai nostri tipi cellulari modello e organismi, evidenziando i diversi approcci alla quantificazione di editing. Si noti che le etichette di figura sono generalizzate perché tutti i metodi mostrati qui possono essere applicati a qualsiasi sistema biologico.
Approcci basati sul sequenziamento variano in complessità tecnica e profondità dei risultati. Per popolazioni clonali modificate o organismi individuali facilmente separabili, possono essere sequenziati individui modificati dopo estrazione del DNA genomico. Risultati di sequenziamento Sanger standard rivelerà il cambiamento di sequenza nel sito Cas9-taglio in un dato individuo, con ipotetici frameshift che sconvolgerebbe la sua funzione (Figura 2A). Lo strumento online utilizzato per il sequenziamento è un altro approccio di base di sequenziamento Sanger che può essere applicato a popolazioni miste, piuttosto che singoli mutanti78. Sequenze sono analizzate con uno strumento online che può approssimare complessiva efficienza di editing come pure i risultati sequenza predominante. I dati rappresentativi sono illustrati nella Figura 2B.
Il metodo di sequenziamento più approfondito qui descritto è sequenziamento profondo (a volte denominato sequenziamento high throughput o generazione). Questo metodo fornisce sequenze di DNA da singoli genomi in una popolazione mista. Tali dati possono essere illustrati in una varietà di modi. Qui, abbiamo classificato individuale sequenziamento letture da celle modificate sulla base del risultato di editing (Figura 2C). Maggior parte delle cellule vengono modificata tramite la via NHEJ, che in genere si traduce in rottura del gene. In altri casi, il gene dell'obiettivo è stato scambiato per una versione alternativa via HDR27.
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/57350/57350tbl1v2.jpg"> Tabella 1: positivo controlla per genoma preliminare esperimenti di editing. Questa tabella mostra le informazioni chiave necessarie per eseguire un genoma di prima volta editing esperimento in ciascuna delle cellule e degli organismi descritti nel presente protocollo. Seguendo questi parametri è probabile per produrre un risultato positivo che può essere utilizzato per verificare il protocollo o come base per il confronto una volta lo sperimentatore prende di mira un gene di proprio interesse. F: avanti, retromarcia r:, HDR: riparazione omologia-diretto. <a href="/files/ftp_upload/57350/Farboud_et_al_Table_1.xlsx" target="_blank">Per favore clicca qui per scaricare questa tabella.</a>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57350/57350fig1v2.jpg"> Figura 1 : Rappresentante fenotipica risultati da Cas9 RNP editing di cellule umane primarie e organismi. (A) si tratta di un'analisi HPLC risultati che dopo successo genoma di editing, HSPCs che sono differenziati in ritardo-fase eritroblasti produrrà più funzionale dell'emoglobina di emoglobina di falce. Eritrociti mutanti producono emoglobina falciforme (HbS), mentre cellule modificato correttamente produrrà emoglobina sano (HbA e HbA2) così come l'emoglobina fetale (HbF). L'assorbanza è rappresentato graficamente in unità arbitrarie (au). Questo pannello è stato pubblicato in DeWitt eal t 27. è ristampato con il permesso dell'associazione americana per l'avanzamento della scienza. (B) sulla sinistra, per ogni condizione, questo pannello mostra flusso cytometry dati mostrando che superficie-macchiato T cellule non esprimono CD25 dopo il gene di CD25 è stato buttato con RNP. L'abbondanza di CD25 viene tracciata sull'asse x con le dimensioni della cella sull'asse y. A destra, per ogni condizione, questo pannello mostra la quantificazione di fosfo-Stat5 (pStat5) dopo un'induzione con il-2. La segnalazione è ridotta quando il recettore il-2 è assente (CD25 KO). L'abbondanza di pStat5 viene tracciata sull'asse x e i dati risultanti da tre diversi livelli di IL-2 input vengono confrontati in verticale. (C) questo pannello mostra una Caenorhabditis elegans co-CRISPR/co-conversion schermata dpy-10 come l'indicatore di CO-Conversione di targeting. Due guida RNA bersaglio due loci, dpy-10 e il tuo preferito gene (yfg), in stesso P0-animale iniettato. HDR a dpy-10 provoca un fenotipo Rol o Dpy. La selezione di Rol - o Dpy-F1 animali aumenta le probabilità di individuare modifiche presso il secondo locus. (D) questo pannello mostra che wildtype hawaiensis Parhyale hatchlings normale addomi con gambe nuoto e ancoraggio. Le covate di knock-out di Abd-B (individui di0 F) sviluppano un addome trasformato verso il torace. Così, il nuoto e le gambe ancore sono scomparsi e sostituite da saltare e a piedi gambe connesse con un torace normale. <a href="/files/ftp_upload/57350/57350fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57350/57350fig2v2.jpg"> Figura 2 : I risultati tipici di modificare i metodi di analisi del risultato. (A) questo pannello mostra esempi del Sanger sequenziamento risultati da diversi organismi di1 hawaiensis p. F, inclusi la sequenza di wildtype e tre diversi indels che disturba la funzione genica spostando l'open reading frame. (B) marea questi risultati mostrano la gamma di operazioni di inserimento e gli eventi di eliminazione che si è verificato in un sito di Cas9-destinazione in un pool di cellule T in sequenza. L'asse x indica la lunghezza di una determinata inserzione o omissione in nucleotidi. (C) questi risultati di sequenziamento profondo non mostrano nessun editing genomico senza nucleofection o gRNA e successo editing con intatta Cas9 RNP, raggruppati per risultato di riparazione del DNA in HSPCs. <a href="/files/ftp_upload/57350/57350fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Utilizzando un Cas9 preassemblati complesso ribonucleoproteico (RNP) è un metodo potente per l'editing genomico precisa, efficiente. Qui, si evidenzia sua utilità in una vasta gamma delle cellule e degli organismi, tra cui cellule umane primarie e classico ed emergenti organismi modello.

Enhanced Genome Editing con Cas9 ribonucleoproteina nelle Diverse cellule e degli organismi

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di apportare modifiche genomiche mirate in una varietà di cellule e organismi utilizzando complessi ribonucleoproteici CRISPR/Cas9. Questo metodo può aiutare ad affrontare questioni biologiche fondamentali dando ai ricercatori il potere di generare inserimenti, delezioni e sostituzioni progettati su misura in genomi altrimenti non modificati di organismi modello e non modello. Il vantaggio principale dell'utilizzo di complessi ribonucleoproteici o RNP al posto del DNA plasmidico è che l'efficienza è maggiore e gli eventi fuori bersaglio sono ridotti.Le implicazioni di questa tecnica si estendono alle terapie ex vivo per combattere cose come il cancro, l'HIV o le malattie genetiche. Questo perché l'editing del genoma può essere utilizzato per correggere mutazioni dannose o addirittura migliorare la capacità delle cellule di combattere malattie dannose. Quindi questo metodo può fornire informazioni sulle cellule umane primarie, C.elegans e Parhyale hawaiensis.Può essere applicato per apportare modifiche genetiche in centinaia di altri sistemi, inclusi organismi precedentemente intrattabili. Iniziare questa procedura con la progettazione e la preparazione dell'RNA guida come descritto nel protocollo di testo. Assemblare un complesso RNP mescolando una quantità da una a due volte molare di RNA guida con 200 picomoli di proteina Cas9 in un volume totale di 10 microlitri.Molto lentamente, aggiungere Cas9 concentrato all'RNA guida per circa 30 secondi, facendo dei rapidi cerchi con la pipetta. Portando la concentrazione finale di Cas9 a 20 micromolari. Quindi, aggiungi 10 microlitri di RNP in ogni pozzetto della cuvetta.Dopo aver preparato le HSPC come descritto nel protocollo di testo, contare le cellule con un emocitometro e trasferire da 150.000 a 200.000 cellule per cuvetta da elettroporare in una provetta da centrifuga. Girare il tubo a 100 volte la gravità per 10 minuti per pellettare le cellule. Aspirare il surnatante con una pipetta o un aspirapolvere, rimuovendo eventuali bolle.Risospendere delicatamente le cellule con 20 microlitri di tampone di elettroporazione per pozzetto della cuvetta. Quindi, aggiungere 20 microlitri di cellule che contengono da 150.000 a 200.000 HSPC in ogni pozzetto della cuvetta che possiede già 10 microlitri di RNP e mescolare bene pipettando su e giù senza creare bolle. Infine, elettroporare le cuvette dopo averle messe in un nucleoforno.Per gli HSPC, utilizzare il codice a impulsi ER-100. Iniziare con la preparazione di C.elegans in pastiglie di agarosio come descritto nel protocollo di testo. Posizionare un tampone per iniezione di agarosio e un vetrino coprioggetto su un cannocchiale di dissezione.Usa un piccone a vite senza fine per stendere una piccola traccia di olio alocarbonico lungo un bordo del pad. Quindi, utilizzare il plettro a vite senza fine rivestito di olio per sollevare diversi vermi dalla piastra di agar NG e nella traccia dell'olio. Con un pelo sottile attaccato a una pipetta, come una ciglia o un baffo di gatto, posiziona i vermi in parallelo, spingendo delicatamente i vermi nel tampone di agarosio.Fino a quando non si è a proprio agio con la procedura di microiniezione, montare un'iniezione solo un verme alla volta. Una volta in posizione e attaccati al tampone, sovrapponi i vermi con altre gocce di olio di alocarburi dalla punta del piccone. Posizionare il vetrino coprioggetti con i vermi montati sul microscopio per iniezione.A basso ingrandimento, posizionare i vermi perpendicolarmente all'ago per iniezione che è stato riempito con la soluzione di RNP, come descritto nel protocollo di testo. Passare a un ingrandimento elevato e riposizionare l'ago adiacente al braccio della gonade, corrispondente alla regione vicino ai nuclei nel pachitene medio-tardivo. Usando il micromanipolatore, muovi l'ago contro il verme, premendo leggermente la cuticola.Quindi, con una mano, picchiettare il lato del tavolino del microscopio per far oscillare l'ago attraverso la cuticola. Premere la paletta o il pulsante per l'iniezione, riempire lentamente il braccio delle gonadi con la miscela per iniezione e rimuovere l'ago. Ripetere il passaggio con l'altro braccio della gonade.Una volta iniettati i vermi, rimuovere il vetrino coprioggetto e il tampone di agarosio e metterlo sotto un microscopio da dissezione. Utilizzando una pipetta capillare tirata, spostare l'olio dai vermi pipettando su di essi un tampone M9. Eseguire questo trattamento per liberare i vermi dall'agar.Dopo 10 minuti, quando i vermi si dimenano nel tampone, spostarli su una piastra di agar NG con batteri OP50 utilizzando la pipetta capillare tirata. Posizionare il piatto a 20 gradi Celsius per due o tre ore fino a quando i vermi si sono ripresi e si muovono. Una volta recuperati, trasferire singolarmente i vermi su piastre di agar NG con OP50.Quindi, trasferire le piastre in un'incubatrice a 25 gradi Celsius. Raccogli gli embrioni di Parhyale a cellula singola da zero a quattro ore dopo la fecondazione anestetizzando prima le femmine gravide con olio di chiodi di garofano allo 0,02% e acqua di mare. Raschiare delicatamente gli embrioni dalla sua sacca ventrale usando una pipetta di vetro arrotondata e tirata a fiamma e un paio di pinze numero tre opache.Utilizzando l'azoto compresso, iniettare gli embrioni di Parhyale al microscopio da dissezione utilizzando un microiniettore e un micromanipolatore. Caricare 1,5 microlitri di miscela per iniezione nella parte posteriore di un tubo capillare estratto utilizzando un puntale per pipetta con microcaricatore. Dopo aver posizionato l'ago sull'apparecchio per l'iniezione, rompere la punta dell'ago utilizzando un paio di pinze sotto il cannocchiale da dissezione.Calibrare il volume erogato iniettandolo nell'olio alocarbonico 700 e misurando il diametro della bolla. Tagliare un trogolo dall'agente indurente usando una lama di rasoio. Riempilo a metà con acqua di mare sterilizzata con filtro e allinea gli embrioni di Parhyale nella mangiatoia per l'iniezione.Iniettare gli embrioni utilizzando il sistema di microiniezione, stabilizzando ogni embrione con un paio di pinze durante l'iniezione. Dopo l'iniezione, utilizzare una pipetta di trasferimento in vetro per trasferire gli embrioni in una piastra di coltura fresca da 60 millimetri riempita a metà con acqua di mare sterilizzata con filtro prima di sezionare e fissare gli embrioni in varie fasi. Crea aghi da dissezione infilando un pezzo piegato di filo di tungsteno lungo circa 0,5 pollici nell'estremità di un ago da insulina.Utilizzare una siringa da un millilitro come impugnatura dell'ago di dissezione e affilare l'ago in idrossido di sodio sotto corrente. Riempi a metà un pozzetto di un piatto di vetro a tre pozzetti con una soluzione appena fatta di nove parti di tampone PEM, una parte di PBS 10X e una parte di PFA al 32%. Metti da tre a cinque embrioni nel piatto e fai un piccolo foro in ogni embrione usando un ago di tungsteno affilato per colpire e uno leggermente smussato per stabilizzare, permettendo al tuorlo di defluire e al fissativo di entrare.Usando un paio di aghi di tungsteno affilati, stuzzicare delicatamente le due membrane esterne che circondano l'embrione di Parhyale. Sezionali in fissativo per rendere gli embrioni più robusti, ma lavora rapidamente per evitare che la membrana si fissi all'embrione, il che rende più difficile la rimozione della membrana. Lasciare che gli embrioni si fissino per un totale di 15-20 minuti per la colorazione degli anticorpi o da 40 a 50 minuti per l'ibridazione in situ.A volte, i risultati di un esperimento di editing sono meglio valutati attraverso un saggio sperimentale. Qui sono mostrati i risultati rappresentativi sia delle cellule T wild type che delle cellule knock out CD25. La citometria a flusso mostra che le cellule che non sono state modificate con Cas9 RNP esprimono CD25.Tuttavia, le cellule in cui il CD25 è stato eliminato non esprimono la proteina. Per le perturbazioni su larga scala, i risultati dell'editing possono avere fenotipi visivi chiari. Ad esempio, il Parhyale hawaiensis di tipo selvatico ha addomi normali con zampe di nuoto e di ancoraggio.L'interruzione del gene Abd-B sostituisce il nuoto addominale e le gambe di ancoraggio con le gambe che saltano e camminano, che di solito sono associate solo al torace. Oltre a controllare i fenotipi, gli sperimentatori dovrebbero anche analizzare il genotipo per valutare l'efficienza complessiva dell'editing e per rilevare specifici cambiamenti genetici. Per i singoli cloni, questo può essere ottenuto attraverso un semplice sequenziamento Sanger.Nelle popolazioni miste di cellule, si raccomanda un'analisi di sequenziamento più avanzata. Ad esempio, TIDE può mappare tutti i diversi indels che si sono verificati nelle singole cellule all'interno di un pool modificato con RNP. Quando si tenta per la prima volta questa procedura, provare a utilizzare uno dei controlli positivi elencati nella tabella uno.L'utilizzo di un RNA guida collaudato può aiutarti a farti un'idea dell'editing con RNP prima di progettare il tuo esperimento.

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L'obiettivo di questo protocollo è quello di consentire l'editing CRISPR/Cas9 senza soluzione di continuità del genoma di C. elegans utilizzando complessi di ribonucleoproteine assemblati e il marcatore co-CRISPR dpy-10 per lo screening. Questo protocollo può essere utilizzato per apportare una varietà di modificazioni genetiche in C. elegans tra cui inserzioni, delezioni, sostituzioni geniche e sostituzioni codone.

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