Il comportamento larvale della drosofila in risposta alla stimolazione optogenetica dei neuroni olfattivi di rilevamento
March 21st, 2018
Questo protocollo analizza il comportamento di navigazione di Drosophila larva in risposta alla stimolazione simultanea optogenetica dei suoi neuroni olfattivi. Luce di lunghezza d'onda di 630 nm viene utilizzata per attivare i singoli neuroni olfattivi, esprimendo una rodopsina canale rosso-spostato. Larvale movimento viene registrato contemporaneamente, registrato in digitale e analizzati utilizzando il software personalizzato.
L'obiettivo generale di questa metodologia è analizzare il comportamento di navigazione della larva di drosophila in risposta alla stimolazione optogenetica simultanea dei suoi neuroni olfattivi. Questo metodo consente la dissezione completa della funzione del circuito olfattivo e integra gli studi su come la funzione del circuito olfattivo si traduce in risposta al comportamento. Il vantaggio principale di questa tecnica è la sua specificità e il controllo temporale utilizzando una luce invece dei tradizionali gradienti olfattivi per attivare i singoli neuroni olfattivi.
Per iniziare l'esperimento, costruisci un'arena di comportamento con deprivazione della luce. Costruisci una scatola di 89 x 61 x 66 centimetri, fatta di lastre acriliche di plexiglass di colore nero, spesse tre millimetri. Posiziona la scatola su un tavolo nella stanza del comportamento.
Successivamente, monta una telecamera CCD USB 3.0 monocromatica dotata di un filtro IR Longpass 830 nanometri e di un obiettivo con attacco F 1.4 C da otto millimetri al centro del soffitto della scatola nera. Posiziona due strisce LED a infrarossi sul piano del tavolo per illuminare le larve nell'arena buia. Quindi, procurati una piastra quadrata di alluminio di 22 centimetri per 22 centimetri per costruire la piattaforma LED.
Al centro della piastra, utilizzare una taglierina metallica per praticare un foro sufficientemente grande da adattarsi alla telecamera CCD. Coprire la piastra metallica con strisce luminose a LED rosse. Saldare i fili della striscia luminosa a LED in serie e inserire i fili della striscia in un relè optoaccoppiatore controllato da un microprocessore Raspberry Pi 2B.
Quindi, montare la piattaforma LED attorno alla telecamera CCD. Quindi installa e configura un sistema operativo basato su Ubuntu MATE Raspbian Jessie Linux sul processore Raspberry Pi prima di collegare il relè dell'accoppiatore ottico alle strisce LED. Collegare un alimentatore per alimentare le strisce LED e l'accoppiatore ottico.
Assicurarsi che vi sia un'irradianza omogenea in vari punti intorno alla telecamera CCD nell'arena del comportamento. Garantire l'irraggiamento assoluto sulla superficie dell'arena con l'aiuto di uno spettrometro e determinarlo in circa 1,3 watt per metro quadrato su tutta la superficie dell'arena. Mantieni le mosche con cibo per mosche standard a 25 gradi Celsius, dal 50 al 60% di umidità relativa in un ciclo luce/buio di 12 ore, 12 ore.
Per esprimere CsChrimson in una singola coppia di ORN, incrociare le femmine vergini da una linea UAS-IVS-CsChrimson con i maschi da una linea ORX-GAL4. Dopo che i maschi e le femmine di mosca in un incrocio sono stati lasciati accoppiare e deporre le uova per 48 ore, trasferire gli adulti in una fiala fresca. Sulla superficie del flaconcino di cibo contenente uova, aggiungere 400 microlitri di una miscela contenente 400 micromolari all-trans-retinal, o ATR, disciolti in dimetilsolfossido, o DMSO, in 89 millimolari di saccarosio disciolto in acqua distillata.
Una volta aggiunto l'ATR alle fiale di cibo contenenti uova, incubare le fiale al buio per altre 72 ore. Dopo l'incubazione, estrarre le larve del terzo stadio dalla superficie del cibo per mosche facendole galleggiare utilizzando una soluzione di saccarosio al 15% ad alta densità. Utilizzando una micropipetta P1000, separare le larve che galleggiano sulla superficie della soluzione di saccarosio in un becher di vetro da 1.000 millilitri.
Lavare le larve quattro volte scambiando ogni volta 800 millilitri di acqua distillata fresca nel becher di vetro. Dopo il lavaggio finale, lasciare riposare le larve per 10 minuti prima di sottoporle al test comportamentale. Per il test del comportamento, mantenere una temperatura e un'umidità costanti nella stanza comportamentale.
Preparare il terreno strisciante larvale versando 150 millilitri di agarosio fuso all'1,5% in una capsula di Petri quadrata di 22 centimetri per 22 centimetri. Lasciare solidificare e raffreddare l'agarosio per una o due ore nelle piastre di Petri prima di utilizzarle nel test del comportamento. Dopo che l'agarosio si è solidificato, trasferire non più di 20 delle larve di terzo stadio preparate al centro della capsula di Petri e coprire la capsula di Petri con il coperchio.
Posizionare la capsula di Petri nell'arena del comportamento sotto la telecamera CCD. Accendi la sorgente luminosa LED a infrarossi da 850 nanometri per visualizzare le larve nel video. Avviare la telecamera CCD per registrare il movimento larvale.
Infine, passa all'elaborazione e all'analisi dei dati. Quando ORN 7a che esprime CsChrimson è stato stimolato dalla luce, c'è stata una significativa diminuzione della lunghezza della corsa rispetto agli animali di controllo. Al contrario, quando ORN 42a che esprime CsChrimson è stato stimolato dalla luce, c'è stato un aumento significativo della lunghezza della corsa rispetto agli animali di controllo.
Abbiamo scoperto che per ORN 42a, diversi modelli temporali di stimolazione luminosa hanno suscitato diverse risposte comportamentali. Mentre abbiamo dimostrato questo metodo per i neuroni dei recettori olfattivi di primo ordine, il nostro metodo consente anche una varietà di applicazioni future, come la misurazione dell'impatto dei neuroni a valle come i neuroni di proiezione e i neuroni locali sul comportamento larvale. Ci aspettiamo che questa tecnica apra la strada a una dissezione completa della funzione del circuito olfattivo larvale.
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Panoramica
Questo protocollo analizza il comportamento navigativo della larva di Drosophila in risposta alla stimolazione optogenetica simultanea dei suoi neuroni olfattivi. Utilizza una luce di lunghezza d'onda di 630 nm per attivare specifici neuroni olfattivi che esprimono una rodopsina spostata verso il rosso, permettendo studi dettagliati della funzione del circuito olfattivo e della risposta comportamentale.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Neuroscienze comportamentali
- Optogenetica
- Genetica della Drosophila
Contesto
- Questa metodologia permette di esplorare come la funzione del circuito olfattivo si correla con le risposte comportamentali.
- Offre un controllo temporale sull'attivazione utilizzando la luce invece dei tradizionali gradienti di odori.
- L'approccio facilita l'esame di neuroni specifici nel sistema olfattivo della Drosophila.
Scopo dello studio
- Disseccare la funzione dei circuiti olfattivi con precisione.
- Osservare le risposte comportamentali larvali alla stimolazione neuronale mirata.
- Fornire informazioni su come singoli neuroni olfattivi influenzano le scelte di navigazione.
Metodi utilizzati
- Lo studio utilizza un'arena di comportamento personalizzata per l'analisi del movimento larvale.
- Le larve di Drosophila che esprimono CsChrimson nei neuroni recettori olfattivi (ORN) sono state stimolate con luce.
- Il test comportamentale prevede la preparazione di un mezzo di arrampicata in agarosa e la registrazione video dei movimenti larvali.
- I passaggi significativi includono la costruzione dell'arena, il montaggio dell'attrezzatura e la preparazione delle larve con condizioni specifiche.
Principali risultati
- La stimolazione luminosa di specifici neuroni recettori olfattivi ha portato a significative variazioni nella lunghezza della corsa larvale, indicando distinte risposte comportamentali.
- Diversi modelli temporali di stimolazione hanno elicitato effetti diversi sul comportamento di navigazione.
- Questo metodo è pronto per facilitare l'esplorazione futura degli impatti neuronali a valle sul comportamento larvale.
Conclusioni
- Lo studio esemplifica un approccio innovativo per analizzare i circuiti olfattivi e le loro implicazioni comportamentali.
- Permette ai ricercatori di indagare i ruoli specifici di neuroni mirati in un contesto di organismo vivente.
- Queste scoperte migliorano la nostra comprensione dei meccanismi neuronali nel processo sensoriale e nel comportamento.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This method enables precise dissection of olfactory circuit function by replacing odor stimuli with optogenetic control, addressing a key challenge in target validation where behavioral readouts must be linked to specific neuronal activity. It supports mechanistic de-risking in early discovery by isolating the contribution of individual olfactory receptor neurons to navigational behavior, improving predictive confidence in target selection. The approach enhances translational continuity from molecular target to circuit-level phenotype, relevant for de-risking targets in neuroscience-focused discovery programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking specific olfactory neuron activation to defined behavioral outputs.
- Operational Value: Provides a reproducible system for functional validation of neuronal targets using light-based stimulation.
- Scientific Value: Supports biological de-risking through isolated manipulation of individual ORNs to clarify their role in larval navigational behavior.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative behavioral readouts (e.g., run length changes) that enable standardized assessment of neuronal modulation effects.
- Operational Value: Establishes a scalable assay platform for screening genetic or pharmacological modulators of olfactory circuit function.
- Scientific Value: Facilitates assay standardization by eliminating odorant volatility and delivery variability through optogenetic stimulation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system modeling by enabling dissection of sensory-to-behavior translation in a genetically tractable organism.
- Operational Value: Provides a preclinical-compatible workflow for evaluating neuronal target effects on behavior prior to mammalian validation.
- Scientific Value: Enables mechanistic de-risking by clarifying how upstream neuronal activity translates to downstream behavioral phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting target validation through behavioral phenotyping and informing lead identification by clarifying neuronal targets that drive measurable outputs.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of individual olfactory neuron function in driving larval navigational behavior.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible behavioral metrics (run length) suitable for compound or genetic modulator evaluation.
- Analytics: Provides trackable behavioral outputs and statistical comparisons between stimulated and control conditions.
- Translational Research: Connects neuronal circuit activity to behavioral responses, supporting extrapolation to higher-order models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for systematic interrogation of neuronal targets across olfactory and other sensory circuits.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing ambiguity in linking neuronal activation to behavioral outcomes.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through optogenetic control replacing variable odor stimuli.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing clearer mechanistic links between targets and behavioral phenotypes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated behavioral impact in a discovery-relevant system.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila genetics, optogenetics, and behavioral assay design.
- Dependent on specialized instrumentation including behavior arena, IR lighting, CCD camera, and Raspberry Pi-based stimulation control.
- Necessitates cross-team standardization for larval preparation, agarose medium preparation, and video tracking protocols.
- Involves adaptation considerations when extending to different neuronal types (e.g., projection neurons, local neurons) or developmental stages.
- Limited by the need for genetic accessibility and retinal feeding in the model system, which may constrain scalability to non-Drosophila systems.
