Il comportamento larvale della drosofila in risposta alla stimolazione optogenetica dei neuroni olfattivi di rilevamento
21 marzo 2018
Questo protocollo analizza il comportamento di navigazione di Drosophila larva in risposta alla stimolazione simultanea optogenetica dei suoi neuroni olfattivi. Luce di lunghezza d'onda di 630 nm viene utilizzata per attivare i singoli neuroni olfattivi, esprimendo una rodopsina canale rosso-spostato. Larvale movimento viene registrato contemporaneamente, registrato in digitale e analizzati utilizzando il software personalizzato.
L'obiettivo generale di questa metodologia è analizzare il comportamento di navigazione della larva di drosophila in risposta alla stimolazione optogenetica simultanea dei suoi neuroni olfattivi. Questo metodo consente la dissezione completa della funzione del circuito olfattivo e integra gli studi su come la funzione del circuito olfattivo si traduce in risposta al comportamento. Il vantaggio principale di questa tecnica è la sua specificità e il controllo temporale utilizzando una luce invece dei tradizionali gradienti olfattivi per attivare i singoli neuroni olfattivi.
Per iniziare l'esperimento, costruisci un'arena di comportamento con deprivazione della luce. Costruisci una scatola di 89 x 61 x 66 centimetri, fatta di lastre acriliche di plexiglass di colore nero, spesse tre millimetri. Posiziona la scatola su un tavolo nella stanza del comportamento.
Successivamente, monta una telecamera CCD USB 3.0 monocromatica dotata di un filtro IR Longpass 830 nanometri e di un obiettivo con attacco F 1.4 C da otto millimetri al centro del soffitto della scatola nera. Posiziona due strisce LED a infrarossi sul piano del tavolo per illuminare le larve nell'arena buia. Quindi, procurati una piastra quadrata di alluminio di 22 centimetri per 22 centimetri per costruire la piattaforma LED.
Al centro della piastra, utilizzare una taglierina metallica per praticare un foro sufficientemente grande da adattarsi alla telecamera CCD. Coprire la piastra metallica con strisce luminose a LED rosse. Saldare i fili della striscia luminosa a LED in serie e inserire i fili della striscia in un relè optoaccoppiatore controllato da un microprocessore Raspberry Pi 2B.
Quindi, montare la piattaforma LED attorno alla telecamera CCD. Quindi installa e configura un sistema operativo basato su Ubuntu MATE Raspbian Jessie Linux sul processore Raspberry Pi prima di collegare il relè dell'accoppiatore ottico alle strisce LED. Collegare un alimentatore per alimentare le strisce LED e l'accoppiatore ottico.
Assicurarsi che vi sia un'irradianza omogenea in vari punti intorno alla telecamera CCD nell'arena del comportamento. Garantire l'irraggiamento assoluto sulla superficie dell'arena con l'aiuto di uno spettrometro e determinarlo in circa 1,3 watt per metro quadrato su tutta la superficie dell'arena. Mantieni le mosche con cibo per mosche standard a 25 gradi Celsius, dal 50 al 60% di umidità relativa in un ciclo luce/buio di 12 ore, 12 ore.
Per esprimere CsChrimson in una singola coppia di ORN, incrociare le femmine vergini da una linea UAS-IVS-CsChrimson con i maschi da una linea ORX-GAL4. Dopo che i maschi e le femmine di mosca in un incrocio sono stati lasciati accoppiare e deporre le uova per 48 ore, trasferire gli adulti in una fiala fresca. Sulla superficie del flaconcino di cibo contenente uova, aggiungere 400 microlitri di una miscela contenente 400 micromolari all-trans-retinal, o ATR, disciolti in dimetilsolfossido, o DMSO, in 89 millimolari di saccarosio disciolto in acqua distillata.
Una volta aggiunto l'ATR alle fiale di cibo contenenti uova, incubare le fiale al buio per altre 72 ore. Dopo l'incubazione, estrarre le larve del terzo stadio dalla superficie del cibo per mosche facendole galleggiare utilizzando una soluzione di saccarosio al 15% ad alta densità. Utilizzando una micropipetta P1000, separare le larve che galleggiano sulla superficie della soluzione di saccarosio in un becher di vetro da 1.000 millilitri.
Lavare le larve quattro volte scambiando ogni volta 800 millilitri di acqua distillata fresca nel becher di vetro. Dopo il lavaggio finale, lasciare riposare le larve per 10 minuti prima di sottoporle al test comportamentale. Per il test del comportamento, mantenere una temperatura e un'umidità costanti nella stanza comportamentale.
Preparare il terreno strisciante larvale versando 150 millilitri di agarosio fuso all'1,5% in una capsula di Petri quadrata di 22 centimetri per 22 centimetri. Lasciare solidificare e raffreddare l'agarosio per una o due ore nelle piastre di Petri prima di utilizzarle nel test del comportamento. Dopo che l'agarosio si è solidificato, trasferire non più di 20 delle larve di terzo stadio preparate al centro della capsula di Petri e coprire la capsula di Petri con il coperchio.
Posizionare la capsula di Petri nell'arena del comportamento sotto la telecamera CCD. Accendi la sorgente luminosa LED a infrarossi da 850 nanometri per visualizzare le larve nel video. Avviare la telecamera CCD per registrare il movimento larvale.
Infine, passa all'elaborazione e all'analisi dei dati. Quando ORN 7a che esprime CsChrimson è stato stimolato dalla luce, c'è stata una significativa diminuzione della lunghezza della corsa rispetto agli animali di controllo. Al contrario, quando ORN 42a che esprime CsChrimson è stato stimolato dalla luce, c'è stato un aumento significativo della lunghezza della corsa rispetto agli animali di controllo.
Abbiamo scoperto che per ORN 42a, diversi modelli temporali di stimolazione luminosa hanno suscitato diverse risposte comportamentali. Mentre abbiamo dimostrato questo metodo per i neuroni dei recettori olfattivi di primo ordine, il nostro metodo consente anche una varietà di applicazioni future, come la misurazione dell'impatto dei neuroni a valle come i neuroni di proiezione e i neuroni locali sul comportamento larvale. Ci aspettiamo che questa tecnica apra la strada a una dissezione completa della funzione del circuito olfattivo larvale.
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Panoramica
Questo protocollo analizza il comportamento di navigazione della larva di Drosophila in risposta a una stimolazione optogenetica simultanea dei suoi neuroni olfattivi. Utilizza una luce di lunghezza d'onda 630 nm per attivare specifici neuroni olfattivi che esprimono una rodopsina canale spostata verso il rosso, consentendo studi dettagliati della funzione del circuito olfattivo e della risposta comportamentale.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze comportamentali
- Optogenetica
- Genetica di Drosophila
Sfondo
- Questa metodologia consente di esplorare in che modo la funzione del circuito olfattivo si correla con le risposte comportamentali.
- Offre un controllo temporale sull'attivazione mediante luce, anziché gradienti tradizionali di odore.
- L'approccio facilita l'esame di neuroni specifici nel sistema olfattivo di Drosophila.
Scopo dello studio
- Dissezionare con precisione la funzione dei circuiti olfattivi.
- Osservare le risposte comportamentali delle larve alla stimolazione neuronale mirata.
- Fornire informazioni su come singoli neuroni olfattivi influenzino le scelte di navigazione.
Metodi Utilizzati
- Lo studio utilizza un'arena comportamentale appositamente progettata per l'analisi del movimento delle larve.
- Le larve di Drosophila che esprimono CsChrimson nei neuroni recettori olfattivi (ORNs) sono state stimolate con luce.
- Il saggio comportamentale prevede la preparazione di un mezzo di strisciamento a base di agarosio e la registrazione video dei movimenti larvali.
- I passaggi principali includono la costruzione dell'arena, il montaggio dell'apparecchiatura e la preparazione delle larve in condizioni specifiche.
Risultati principali
- La stimolazione luminosa di specifici neuroni recettoriali olfattivi ha determinato variazioni significative nella lunghezza della corsa delle larve, indicando risposte comportamentali distinte.
- Diversi schemi temporali di stimolazione hanno indotto effetti differenti sul comportamento di navigazione.
- Questo metodo è destinato a facilitare future indagini sugli effetti neuronali a valle sul comportamento larvale.
Conclusioni
- Lo studio illustra un approccio innovativo per analizzare i circuiti olfattivi e le loro implicazioni comportamentali.
- Permette ai ricercatori di indagare i ruoli specifici di neuroni mirati in un contesto di organismo vivente.
- Questi risultati migliorano la nostra comprensione dei meccanismi neuronali coinvolti nell'elaborazione sensoriale e nel comportamento.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo consente una dissezione precisa della funzione del circuito olfattivo sostituendo gli stimoli odorosi con un controllo optogenetico, affrontando una sfida chiave nella validazione degli obiettivi, in cui gli esiti comportamentali devono essere associati a specifiche attività neuronali. Supporta la riduzione del rischio meccanicistica nella fase iniziale della scoperta isolando il contributo di singoli neuroni recettori olfattivi al comportamento di navigazione, migliorando la fiducia predittiva nella selezione degli obiettivi. L'approccio potenzia la continuità traslazionale dal bersaglio molecolare al fenotipo a livello di circuito, elemento rilevante per la riduzione del rischio nei programmi di scoperta incentrati sulle neuroscienze.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche collegando l'attivazione specifica di neuroni olfattivi a output comportamentali definiti.
- Valore operativo: Fornisce un sistema riproducibile per la validazione funzionale di bersagli neuronali mediante stimolazione basata sulla luce.
- Valore scientifico: Supporta la riduzione del rischio biologico attraverso la manipolazione isolata di singoli ORN per chiarirne il ruolo nel comportamento di navigazione delle larve.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera parametri comportamentali quantitativi (ad esempio, variazioni della lunghezza della corsa) che consentono una valutazione standardizzata degli effetti della modulazione neuronale.
- Valore operativo: Stabilisce una piattaforma sperimentale scalabile per lo screening di modulatori genetici o farmacologici della funzione del circuito olfattivo.
- Valore scientifico: Facilita la standardizzazione del saggio eliminando la volatilità degli odoranti e le variabilità nella somministrazione mediante stimolazione optogenetica.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Supporta la modellizzazione di sistemi rilevanti per le malattie consentendo l'analisi della traslazione da stimolo sensoriale a comportamento in un organismo geneticamente manipolabile.
- Valore operativo: Fornisce un flusso di lavoro compatibile con la fase preclinica per valutare gli effetti dei target neuronali sul comportamento prima della validazione nei mammiferi.
- Valore scientifico: Permette una riduzione del rischio di natura meccanicistica chiarificando come l'attività neuronale a monte si traduca in fenotipi comportamentali a valle.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso della scoperta precoce, supportando la validazione del bersaglio attraverso il fenotipaggio comportamentale e contribuendo all'identificazione dei composti promettenti chiarificando i bersagli neuronali responsabili di output misurabili.
- Biologia della scoperta: Consente la verifica di ipotesi sulla funzione individuale dei neuroni olfattivi nel guidare il comportamento di navigazione nei larvi.
- Screening: Fornisce metriche comportamentali quantitative e riproducibili (lunghezza della corsa) adatte alla valutazione di composti o modulatori genetici.
- Analisi: Offre output comportamentali tracciabili e confronti statistici tra condizioni stimolate e condizioni di controllo.
- Ricerca traslazionale: Collega l'attività dei circuiti neuronali alle risposte comportamentali, favorendo l'estrapolazione a modelli di ordine superiore.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per l'interrogazione sistematica di bersagli neuronali nei circuiti olfattivi e in altri circuiti sensoriali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva riducendo l'ambiguità nell'associazione tra l'attivazione neuronale e gli esiti comportamentali.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la standardizzazione grazie al controllo optogenetico, che sostituisce stimoli odorosi variabili.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di tipo go/no-go fornendo collegamenti meccanicistici più chiari tra target e fenotipi comportamentali.
- Impatto sul portafoglio: Consente la priorizzazione dei target in base all'impatto comportamentale validato in un sistema rilevante per la scoperta, adeguata al livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in genetica di Drosophila, optogenetica e progettazione di saggi comportamentali.
- È dipendente da strumentazione specializzata, inclusi arena comportamentale, illuminazione a infrarossi, telecamera CCD e controllo della stimolazione basato su Raspberry Pi.
- Necessita di standardizzazione tra gruppi diversi per la preparazione delle larve, la preparazione del mezzo in agarosio e i protocolli di tracciamento video.
- Comporta considerazioni di adattamento quando si estende a diversi tipi neuronali (ad esempio, neuroni di proiezione, neuroni locali) o a diverse fasi di sviluppo.
- È limitato dalla necessità di accessibilità genetica e dall'alimentazione con retinale nel sistema modello, il che potrebbe limitare la scalabilità a sistemi non-Drosophila.
