Costruzione di peptidi elicoidale Via foto-indotta del tiolo-ene/yne Hydrothiolation Thioether/vinile solfuro-tethered

Questi metodi semplificano la generazione di peptidi ciclici legati al tioetere grazie all'uso della chimica a clic del tio-ene o del tio-ene che possiede una tolleranza superiore al gruppo funzionale e una buona resa. Il vantaggio principale di questa tecnica è che un cavo tioetere fornisce un sito di modifica senza tracce, che espande significativamente lo spazio chimico dei peptidi stabili in seguito alla modifica della sintesi peptidica. Per iniziare la procedura, collegare una colonna riempita con 50 milligrammi di resina Rink Amide MBHA sia a un collettore del vuoto da banco che a una linea di azoto o gas argon tramite un rubinetto a tre vie.

Aggiungere uno o due millilitri di diclorometano al letto di resina e gonfiare la resina agitando delicatamente la miscela con un flusso di bolle di gas inerte per 10 minuti. Al termine, scolare la resina con un bulbo di pipetta di gomma. Quindi, aggiungere uno o due millilitri di soluzione di deprotezione Fmoc N-terminale alla resina.

Agitare delicatamente la miscela facendo gorgogliare con gas inerte per 10 minuti, quindi scolare la resina con un bulbo di pipetta di gomma. Lavare la colonna con uno o due millilitri di DMF allo stesso modo, seguiti da uno o due millilitri di DCM. Ripetere una volta la sequenza di deprotezione.

Successivamente, combinare 0,125 millimoli di un amminoacido protetto da Fmoc e 50,5 milligrammi di HCTU con 0,5 millilitri di DMF in un contenitore di polipropilene. Agitare il composto per un minuto per sciogliere i solidi. Quindi, aggiungere 43,5 microlitri di DIPEA e agitare il contenitore per un altro minuto per ottenere una soluzione di aminoacidi attivati 0,25 molari.

Aggiungere questa soluzione alla resina lavata e far bollire il gas inerte attraverso la miscela per una o due ore. Successivamente, deproteggere e lavare i residui di aminoacidi legati. Continuare ad accoppiare gli amminoacidi alla catena peptidica in questo modo per formare il peptide lineare.

Utilizzare la sintesi peptidica in fase solida per preparare la resina che supporta un peptide lineare che include un residuo di cisteina protetto dal tritile separato da tre unità da un residuo mono-S-cinque. Aggiungere uno o due millilitri di soluzione di deprotezione tritile a 50 milligrammi di resina contenente peptidi. Far bollire l'azoto gassoso attraverso la miscela per 10 minuti.

Scolare la soluzione di deprotezione e lavare la resina con porzioni da uno a due millilitri di DCM tre volte. Ripetere la procedura di deprotezione sei volte o fino a quando la soluzione non appare più gialla per deproteggere completamente la cisteina. La completa deprotezione del gruppo Trt della cisteina è molto importante per la successiva fase di fotoreazione.

Lavare la resina con porzioni da uno a due millilitri di DMF e DCM in sequenza. Quindi, immergere la resina in uno o due millilitri di metanolo per due minuti per restringere la resina. Scolare il metanolo e asciugare la resina con azoto gassoso per cinque minuti.

Trasferire la resina secca in un pallone da 10 millilitri a fondo tondo con carta per pesare. Sospendi la resina in due millilitri di DMF sparso di azoto. Quindi, aggiungere 5,6 milligrammi di MMP e 38 milligrammi di MAP come fotoiniziatori.

Mettere una barra di agitazione nel pallone e tappare il pallone con un setto di gomma. Spurgare l'atmosfera del pallone con azoto gassoso tre volte, per un tempo di spurgo totale di circa cinque minuti. Fissare il pallone di reazione in un fotoreattore dotato di lampade UVA, un ingresso di azoto gassoso inerte e una piastra di agitazione.

Iniziare a mescolare il composto e chiudere il fotoreattore. Spurgare il fotoreattore con argon per 10 minuti. Quindi, impostare la portata di argon su un litro al minuto e irradiare la miscela con luce UVA per un'ora a temperatura ambiente.

Monitorare la reazione con HPLC. Lavare, scindere e purificare il peptide ciclico al termine. Preparare 50 milligrammi di resina contenente un peptide lineare che include un residuo mono-S-5 gamma-sostituito.

Lavare la resina con DMF e DCM in sequenza. Restringere la resina con metanolo e asciugarla con azoto gassoso. Quindi, in un pallone da 10 millilitri a fondo tondo, sospendere la resina in due millilitri di DMF spruzzato di azoto.

Aggiungere alla miscela 5,6 milligrammi di MMP, 3,8 milligrammi di MAP e 25,7 milligrammi di cisteina protetta da Fmoc. Aggiungere un'ancoretta al pallone, sigillarlo con un setto di gomma e spurgare l'atmosfera del pallone con azoto gassoso. Quindi, irradiare la miscela con luce UVA in un fotoreattore inerte riempito di azoto gassoso mescolando a temperatura ambiente per una o due ore.

Monitorare la reazione con LC-MS. Quando la fotoreazione è completa, lavare il peptide legato ed eseguire la reazione di macrolattamma. Successivamente, riprendere ad accoppiare gli amminoacidi al peptide ciclico per formare la struttura desiderata.

Tagliare e purificare il peptide al termine. Preparare 50 milligrammi di resina contenente un peptide lineare che include un residuo con un alchino terminale separato da tre unità da un residuo con un tiolo terminale. Scindere il peptide dalla resina e farlo precipitare con un millilitro di etere etilico freddo.

Centrifugare la miscela di peptidi a 12.000 volte g per due minuti. Decantare delicatamente il surnatante e aggiungere un altro millilitro di etere etilico freddo. Ripetere il lavaggio altre due volte, quindi asciugare il residuo di peptide sotto vuoto.

Sciogliere il residuo in 50 millilitri di DMF sparso di azoto in un pallone a fondo tondo. Aggiungere 3,2 milligrammi di DMPA alla soluzione peptidica e far bollire l'azoto attraverso la miscela di reazione per 10 minuti. Un'atmosfera inerte è strettamente necessaria per un'efficace fotoreazione tio-ina in una fase di soluzione.

In caso contrario, abbiamo osservato l'ossidazione dello zolfo durante l'irradiazione UV. Quindi, irradiare la miscela con luce UVA senza agitare in un fotoreattore inerte riempito di azoto gassoso a temperatura ambiente per 30 minuti a un'ora. Isolare e purificare il peptide ciclico al termine.

La ciclizzazione su resina di questo peptide ha prodotto un peptide ciclico legato al tioetere e cinque con un peso molecolare identico al peptide lineare. Il tempo di ritenzione HPLC del prodotto ciclico era di due minuti più breve di quello del peptide lineare. Una buona conversione è stata osservata anche per la ciclizzazione su resina di diversi altri peptidi corti.

I peptidi lineari sono stati sottoposti a screening per verificarne la capacità di sottoporsi a pinzatura peptidica tramite idrotiolazione tioli-indotta fotoindotta. La bassa resa di due c è stata attribuita a una preferenza conformazionale per intrappolare il radicale tiile all'N-terminale durante la contrazione di un macrociclo a 20 membri. I peptidi uno a e uno b hanno entrambi generato due isomeri con un reticolo di solfuro di vinile a otto membri.

I peptidi del prodotto due a-A e due a-B avevano tempi di ritenzione distinti e sono stati prodotti in rapporti diversi a tempi di irradiazione diversi. La spettroscopia NMR protonica ha indicato che due a-A era l'isomero E del solfuro di vinile e due a-B era l'isomero Z. L'isomero Z è stato il prodotto principale nella formazione dei peptidi due d, due e e due f, il che è stato attribuito alla preferenza conformazionale durante la formazione del reticolo del solfuro di vinile a sette membri.

La spettroscopia di dicroismo circolare ha mostrato una bobina casuale per tutte le forme di peptidi due a e due b e una conformazione elicoidale per il peptide due d. Abbiamo sviluppato una serie di protocolli chimici per la costruzione di peptidi legati al tioetere e al solfuro di vinile utilizzando la chimica a scatto fotoindotta del tioene e del tio-ene. Crediamo che sarà utile per la comunità di ricerca.