Name: Unanalisi di poliacrilammide-basata di formato multi-pozzetto per studiare leffetto della matrice extracellulare rigidità sullinfezione batterica delle cellule aderenti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Scopri come analizzare l'effetto della rigidità della matrice extracellulare sull'infezione batterica delle cellule endoteliali usando idrogeli di poliacrilammide e Listeria monocytogenes. Questo metodo quantitativo consente screening ad alto rendimento.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

I nostri ringraziamenti a M. piè di pagina, R. Lamasón, M. Rengaranjan e membri del Theriot Lab per le loro discussioni e supporto sperimentale. Questo lavoro è stato supportato da NIH R01AI036929 (J.A.T.), HHMI (J.A.T.), la compagnia di Gilliam HHMI per Advanced Studio (PoE), la Stanford Graduate Fellowship (PoE) e l'American Heart Association (E.E.B.). Citometria a flusso è stata eseguita presso la Stanford Shared FACS Facility.

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Le cellule possono percepire una varietà di stimoli ambientali fisici, che possono influenzare non solo la morfologia delle cellule, ma anche la loro attività di espressione e proteina gene, influenzando così critico cella funzioni e comportamenti45,46. La rigidità della ECM delle cellule è sempre più apprezzata come un importante modulatore della motilità cellulare, differenziamento, proliferazione e in definitiva delle cellule destino47,48,49. Anche se ci sono stati molti gli avanzamenti recenti nella comprensione la complessa interazione biomeccanica tra cellule e loro ECM, piccolo è conosciuto circa come ambientale rigidità colpisce la suscettibilità delle cellule all'infezione batterica. Per facilitare tali studi, abbiamo sviluppato questa analisi multi-pozzetto Novella basata sulla fabbricazione consolidata di idrogel di poliacrilamide di rigidità sintonizzabile che è compatibile con infezione saggi50. Tradizionalmente, un'infezione batterica delle cellule nella coltura del tessuto è stata studiata su vetro o polistirolo superfici che sono circa 1-3 ordini di grandezza più rigidi di ECM naturale di più aderente celle8,51. Il test descritto qui apre nuove autostrade, consentendo lo studio delle interazioni batterio-ospite in un regime di rigidità ambientale fisiologicamente rilevanti.
Per la prova di concetto del saggio presentato, cellule HMEC-1 sono stati scelti come modello cellule dell'ospite aderente e Lm come un agente patogeno batterico di modello. Tuttavia, il dosaggio può essere esteso per ulteriori studi, se modificate in modo appropriato. Tali studi possono coinvolgere l'infezione di tipi cellulari diversi mammifero ospite aderente da ulteriori agenti patogeni, come batteri e virus. Per questo particolare test, gel erano proteine rivestite con collagene I, ma a seconda del tipo di cella di host, è possibile utilizzare un rivestimento-diverso ECM della proteina, come laminina o fibronectina, per facilitare l'attaccamento di cellule dell'ospite di interesse sull'idrogel 52. un'ulteriore considerazione che dipende dal tipo di cellula ospite è la gamma di rigidità di idrogel per essere studiato. La gamma di rigidità dovrebbe dipendere da ciò che è fisiologicamente rilevante per il tipo di cella di host specifico e quanto bene che ospitano si attacca formando uno strato monomolecolare ad un rigidità dato idrogel. Allo stesso modo, a seconda del patogeno di modello desiderato per essere esaminato, lievi modifiche potrebbe essere necessario essere implementato su infezione dosaggio descritto nel presente documento.
L'innovazione del dosaggio rispetto ai metodi precedenti per produzione poliacrilammide idrogeli24,50,53 si trova in determinate caratteristiche uniche integrato con il test proposto l'infezione. In primo luogo, nel caso degli idrogeli è costruite su piastre inferiori di vetro multi-pozzetto, che permette la proiezione di più condizioni contemporaneamente, nonché l'automazione di alcune procedure. Monitoraggio condizioni multiple allo stesso tempo o esaminando più repliche è cruciale poiché il risultato di tale approccio può essere influenzato da fattori quali il passaggio di cella di host e il numero preciso di batteri aggiunta per infettare i padroni di casa, che spesso cambiano tra esperimenti indipendenti. Un'ulteriore caratteristica unica di questo test è che nel caso degli idrogeli hanno un'altezza di circa 40 µm, che è abbastanza sottile per l'immagine utilizza la microscopia convenzionale. Abbiamo mostrato che possiamo eseguire con successo cellule vive microscopia e fissazione delle cellule sia immunostaining seguita da formazione immagine, senza introdurre la fluorescenza di fondo alto. Infine, nel caso degli idrogeli è costituiti da due strati, con quella superiore, avendo incorporato microsfere fluorescenti, confinati in un unico piano focale. Questo attributo assicura che non ci sarà nessuna luce di out-of-focus interferire durante l'imaging. La presenza delle perline consente sia l'esame della topografia superficiale dei gel per garantire che essi siano uniformi e migliora le prestazioni del TFM e MSM24,32,41. Con TFM e MSM, è possibile calcolare le forze cella-ECM e cellula-cellula rispettivamente delle cellule che si trovano in diverse matrici di rigidezza. Utilizzando questa analisi Novella, è possibile fare tali misurazioni di forze fisiche confrontando simultaneamente sia il contributo di rigidità dell'ambiente e dell'infezione. Seguendo tale approccio, l'infezione di effetto ha sulla cellula ospite meccanica durante tutto il corso può essere determinato. Inoltre, l'evoluzione delle sollecitazioni intracellulare delle cellule può essere calcolata usando MSM e può essere utilizzato come una misura dell'integrità barriera dello strato monomolecolare. Infine, data la natura multi-pozzetto del test, è possibile contemporaneamente introdurre perturbazioni farmacologiche e genetiche con un'infezione batterica, di indagare in modo più approfondito la complessa interazione tra host cella meccanica ed infezione.
Una limitazione intrinseca della tecnica si trova nella rigidità del substrato di effetto potrebbe avere il tasso di proliferazione delle cellule. In genere, nelle analisi di infezione, dobbiamo far sì che la densità delle cellule ospite in condizioni diverse è lo stesso. Ecco perché la densità delle cellule di per sé può avere un effetto sulla suscettibilità dei padroni di casa all'infezione. Le cellule HMEC-1 che sono state usate come cellule dell'ospite non mostrano una differenza significativa nel loro numero quando seminato per 24 h nel caso degli idrogeli. Tuttavia, diversi tipi di cellule potrebbero esibire proliferazione differenziale, in base alla rigidità di idrogel, che può influenzare gli studi di infezione. Allo stesso modo, bias di infezione possono sorgere quando le cellule non formano monostrati o non fissare bene su idrogeli, come si verifica quando alcuni tipi di cellule sono seminati su matrici molto morbidi (ad esempio, le cellule endoteliali del cordone ombelicale umano o rene canino Madin-Darby cellule epiteliali seminate su 0.6 kPa idrogeli54,55). Per quanto riguardano i patogeni, alcuni batteri (ad es., Borrelia burdgorferi) possono attaccarsi a ospitare le cellule e li invade, ma può anche trasmigrano attraverso di loro56. Non abbiamo ancora testato se questo test avrebbe funzionato per gli studi di trasmigrazione di agente patogeno, ma sembra possibile, poiché gli studi precedenti sui neutrofili trasmigra seminate su PA idrogeli le cellule endoteliali sono stati documentati per lavorare con successo57. Ci sono stati un sacco di studi condotti che Mostra come per la fabbricazione di idrogel di poliacrilamide di un determinato modulo di Young mescolando le concentrazioni adeguate di acrilammide e bis-acrilammide24,25,26 ,27. Tuttavia, soprattutto quando si desideri eseguire TFM esperimenti sulle cellule che risiedono su idrogeli di rigidità variabile, è fondamentale per confermare la rigidità prevista di idrogeli mediante AFM o altre tecniche di rientro58. Lievi scostamenti dal valore atteso possono verificarsi a causa di un diverso solvente utilizzato o una soluzione stock di acrilammide invecchiato, o dai modi AFM misure sono eseguite (ad esempio, la forma della punta dell'AFM). Infine, l'approccio presentato qui è basato sulla semina di cellule dell'ospite su matrici 2D, che possono differire da uno scenario 3D più realistico e fisiologicamente rilevante. Tuttavia, produzione gel 3D con rigidità sintonizzabile, li semina con cellule dell'ospite e quindi infettandoli con agenti patogeni, ancora comprende talune difficoltà tecniche. Tuttavia, prevediamo che nel prossimo futuro saremo in grado di estendere l'analisi corrente per lo studio di infezione in un ambiente 3D.
Per riassumere, il protocollo descritto unitamente ai risultati preliminari forniscono la prova che questa analisi novella può diventare uno strumento estremamente utile per studiare l'infezione della cellula ospite aderente con batteri patogeni in modo quantitativo e in modo molto più ambiente fisiologicamente rilevanti rispetto precedentemente esaminati. Il potere di fabbricare poliacrilammide idrogeli nell'impostazione proposta sta nel fatto che il dosaggio è compatibile con le prestazioni di più tecniche quali la citometria a flusso, immunostaining seguita da microscopia chiara e la microscopia di forza di trazione. Il dosaggio può essere utilizzato per gli studi che coinvolgono l'infezione di tipi cellulari diversi host aderente da agenti patogeni, che prevediamo avrà un impatto significativo in entrambi dipanando le strategie con cui gli agenti patogeni infettano padroni di casa e nel facilitare lo sviluppo di interventi terapeutici contro le infezioni.

Cellule in tessuti più animali sono in genere aderente, allegare sia di cellule vicine e alla loro matrice extracellulare (ECM). L'ancoraggio delle cellule alla loro ECM è fondamentale per molti processi cellulari che vanno da motilità cellulare a cellule di proliferazione e sopravvivenza1,2. Cellulare ancoraggio alla ECM dipende la composizione di ECM e la rigidità. Le cellule rispondono ai cambiamenti in quest'ultimo di riorganizzare in modo dinamico la loro citoscheletro, adesioni cellula-ECM e cellula-cellula, che a sua volta criticamente alterano cella biomeccanica e funzioni3,4,5,6 . Rigidità di ECM può variare nello spazio (cioè, posizione anatomica), nel tempo (cioè, invecchiamento) e in processi patofisiologici (ad es., arteriosclerosi, cancro, infezioni, ecc.). Per esempio, è ampiamente accettato che endoteliali cellule che risiedono su più rigido-rispetto al più morbido-matrici esercitano forze aumentate a loro ECM e a vicenda ed esibiscono aumentata motilità e proliferazione di7,8. Allo stesso modo, fibroblasti che risiedono su matrici più rigidi conferiscono elevata forza contrattile per loro ECM e visualizza aumentata proliferazione, motilità ed ECM produzione9,10,11. Anche se cella meccanica e risposta alla rigidità di ECM sono stati studiati estesamente per vari tipi di cellule, il rapporto tra cellule aderenti, la rigidità delle loro ECM e infezioni batteriche è ancora in gran parte sconosciuta.
Per studiare il ruolo della rigidità di ECM in interazioni delle cellule batteri-ospite, L. monocytogenes (Lm) è stato scelto come l'agente patogeno del modello. LM è un batterio ubiquista di tossinfezione alimentare che possa causare infezioni sistemiche in un'ampia varietà di mammiferi padroni di casa. Questo agente patogeno intracellulare facoltativo può spostare dall'epitelio intestinale in organi distanti passando attraverso diversi tipi di endotelio vascolare. Se si apre un varco la barriera emato - encefalica, Lm può causare la meningite, e quando attraversa la placenta, può causare aborto spontaneo12,13. LM può infettare tipi cellulari diversi host e può farlo utilizzando strategie patogene distinte. Infezione di LM è stato studiato principalmente nel contesto delle cellule epiteliali, mentre molto meno è conosciuto circa come Lm può infettare e bypass cellule endoteliali che allineano il lume dei vasi sanguigni14,15,16. Inoltre, è ancora in gran parte sconosciute come la rigidità del ECM dove risiedono le cellule endoteliali modula capacità di Lm di invadere queste cellule dell'ospite e per poi diffondersi. LM e diverse altre specie batteriche (cioè, Rickettsia parkeri) approfitta del citoscheletro dell'host cellule che infettano a entrambi invadono nel loro citoplasma e facilitano la diffusione della cellula--cellula17 , 18 , 19. che raggiungono attraverso l'espressione di proteine che permettono loro di interferire con le vie di polimerizzazione dell'actina host e di produrre code di cometa di actina che facilitano la loro propulsione16,20. Come conseguenza dell'infezione, il citoscheletro della cellula ospite ha bisogno di riorganizzare in modo dinamico in un modo che è ancora non completamente caratterizzato, potenzialmente influenzare la biomeccanica delle cellule dell'ospite, tra cui le forze fisiche che esercitano sul loro ECM e su ciascuna altri. Per esaminare questi processi, cellule endoteliali microvascolari umane (HMEC-1) sono stati scelti come cellule dell'ospite modello per tre motivi: 1. le cellule endoteliali sono noti per essere altamente mechanosensitive poiché sono sempre esposte a vari spunti fisici21; 2. le strategie che LM impiega per infettare le cellule endoteliali sono ancora in gran parte sconosciuto22; e 3. HMEC-1 sono una linea di cellule immortalizzate e possono, pertanto, essere facilmente coltivate e sottoposti a manipolazione genetica.
Infezione batterica delle cellule dell'ospite è stato studiato in vitro seminando cellule su vetro o polistirolo substrati che sono significativamente più rigidi di ECM fisiologico della maggior parte delle cellule12,14,23. Per esaminare l'infezione delle cellule seminate su una matrice la cui rigidità è fisiologicamente rilevanti e per delucidare il ruolo di rigidezza di ECM sull'infezione delle cellule di batteri patogeni, abbiamo seguito un approccio innovativo basato sulla fabbricazione di sottile poliacrilammide incorporato della microperla idrogeli di rigidezza sintonizzabile su piastre multi-pozzetto. La novità dell'approccio proposto risiede in quanto esso consente il monitoraggio più condizioni contemporaneamente grazie al suo formato multi-pozzetto e in quanto è compatibile con le tecniche multiple a causa di quella particolare che i substrati sono costruiti. Cellule HMEC-1 sono state seminate su questi idrogeli rivestite con proteine e poi infettate da diversi ceppi di Lm che diventano fluorescenti all'interiorizzazione o sono costitutivamente fluorescenti. Il ruolo della rigidità di ECM sulla suscettibilità di infezione delle cellule HMEC-1 ospite è stato valutato da citometria a flusso. Inoltre, microscopia di fluorescenza e di immunostaining sono stati utilizzati per distinguere tra batteri aderenti e interiorizzati. Infine, microscopia di forza di trazione (TFM) è stato effettuato con successo per caratterizzare l'effetto dell'infezione di Lm sulle sollecitazioni di trazione che cellule endoteliali dell'ospite esercitano il loro matrici durante l'infezione. Il saggio presentato può essere facilmente modificato per abilitare ulteriori studi sull'effetto di rigidità ECM sulla suscettibilità di infezione delle cellule aderenti utilizzando linee cellulari differenti o agenti patogeni.

<table><tbody><tr><td><forte>Reagenti</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pellet di idrossido di sodio</td><td>Fisher</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>(3-Aminopropil)trietossisilano</td><td>Sigma</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>25% gluteraldeide</td><td>Sigma</td><td>G6257-100ML</td><td></td></tr><tr><td>40% acrilammide</td><td>Sigma</td><td>A4058-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di bis-acrilammide (2%p/v)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1404-250</td><td></td></tr><tr><td>Fluorosfere modificate con carbossilato, 0,1 &mu; m, fluorescente giallo-verde (505/515)</td><td>Invitrogen</td><td>F8803</td><td></td></tr><tr><td>Persolfato di ammonio</td><td>Fisher</td><td>BP17925</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma</td><td>T9281-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH</td><td>Proteochem</td><td>c1111-100mg</td><td></td></tr><tr><td>Collagene, soluzione di tipo I da ratto</td><td>Sigma</td><td>C3867-1VL</td><td></td></tr><tr><td>dimetil solfossido (DMSO)</td><td>J.T. Baker</td><td>9224-01</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, acido libero</td><td>J.T. Baker</td><td>4018-04</td><td></td></tr><tr><td>Terreno L-15 di Leibovitz, senza rosso fenolo</td><td>Thermofischer</td><td>21083027</td><td></td></tr><tr><td>MCDB 131 Medium, senza glutammina</td><td>Life technologies</td><td>10372019</td><td></td></tr><tr><td>Foundation Siero fetale bovino, lotto: A37C48A</td><td>Gemini Bio-Prod</td><td>900108 500ml</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di crescita epidermico, EGF</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>Idrocortisone</td><td>Sigma</td><td>H0888</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina 200mM</td><td>Fisher</td><td>SH3003401</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 1X</td><td>Fisher</td><td>SH30028FS</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina solfato</td><td>MP biomedicals</td><td>194530</td><td></td></tr><tr><td>Cloramfenicolo</td><td>Sigma</td><td>C0378-5G</td><td></td></tr><tr><td>DifcoTM Agar, BD granulato</td><td></td><td>214530</td><td></td></tr><tr><td>BBL TM Infusione cervello-cuore</td><td>BD</td><td>211059</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342, tricloridrato, triidrato - 10 mg/ul soluzione in acqua</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeide 16% grado EM</td><td>Microscopia elettronica</td><td>15710-S</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Listeria monocytogenes</td><td>Abcam</td><td>ab35132</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secondario IgG (H+L) anti-coniglio di capra, Alexa Fluor&reg; 546 coniugato</td><td>Thermofischer</td><td>A-11035</td><td></td></tr><tr><td>0,25% tripsina-EDTA, rosso fenolo</td><td>Thermofischer</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>COLLAGENASI DA CLOSTRIDIUM ISTOLITICO</td><td>Sigma</td><td>C8051</td><td></td></tr><tr><td>Streptomicina solfato</td><td>Fisher Scientific</td><td>3810-74-0</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Calbiochem</td><td>8510</td><td></td></tr><tr><td>Sodio dodecil solfato</td><td>Thermofischer</td><td>28364</td><td></td></tr><tr><td>MES polvere</td><td>Sigma</td><td>M3885</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>J.T. Baker</td><td>3040-05</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>J.T. Baker</td><td>2444-1</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Acros</td><td>40991</td><td></td></tr><tr><td>Attrezzatura da laboratorio monouso</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12 mm vetro circolare vetrini coprioggetti</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-81</td><td>No. 1.5 Vetrino coprioggetti | 10 mm Diametro vetro | Piastre da</td></tr><tr><td>24 pozzetti con fondo in vetro</td> non rivestito <td>Mattek</td><td>P24G-1.5-13-F</td><td></td></tr><tr><td>Provette in polistirene da 5 ml con un 35 &mu; tappo del filtro della cella m&nbsp;</td><td>Fiasche Falcon</td><td>352235</td> T-25 Falcon 353118 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>provette coniche da 50 ml</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>provette coniche da 15 ml</td><td>Pipette</td><td></td> sierologiche monouso Falcon 352196 <td></td></tr><tr><td>(1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml)</td><td>Pipette in vetro Falcon</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur</td><td>VWR</td><td>14672-380</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette (1-200 &mu; l, 101-1000 &mu; l)</td><td>Denville</td><td>P1122, P1126</td><td></td></tr><tr><td>Guanti da esplorazione senza polvere</td><td>Microflex</td><td>XC-310</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette batteri</td><td>Sarstedt</td><td>67.746</td><td></td></tr><tr><td>Rasoi</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Ago per siringa</td><td>BD</td><td>305167</td><td></td></tr><tr><td>0,2 um flaconi sterilizzanti</td><td>Thermo Scientific</td><td>566-0020</td><td></td></tr><tr><td>20 siringhe ml</td><td>BD</td><td>302830</td><td></td></tr><tr><td>filtri da 0,2 um</td><td>Thermo Scientific</td><td>723-2520</td><td></td></tr><tr><td>bastoncini di legno</td><td>Grainger</td><td>42181501</td><td></td></tr><tr><td>Saran wrap</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-3687</td><td></td></tr><tr><td>Piastre batteri</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Large/non monouso attrezzature da laboratorio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cappa per colture tissutali Baker</td><td></td><td>SG504</td><td></td></tr><tr><td>Ematocitometro</td><td>Sigma</td><td></td> Z359629 <td></td></tr><tr><td>Incubatore per batteri</td><td>Thermo Scientific</td><td>IGS180</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore per colture tissutali</td><td>NuAire</td><td>NU-8700</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio per epifluorescenza Nikon Diaphot 200 invertito</td><td>Nikon</td><td>NIKON-DIAPHOT-200</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore a gabbia</td><td>Haison</td><td>Custom</td><td></td></tr><tr><td>Scanford FACScan analyzer&nbsp;</td><td>Stanford e Cytek hanno aggiornato FACScan</td><td>Custom</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Aid</td><td>Drummond</td><td>4-000-110</td><td></td></tr><tr><td>Pipettatori (10 &mu; l, 200 &mu; l, 1000ul)</td><td>Gilson</td><td>F144802, F123601, F123602</td><td></td></tr><tr><td>pHmetro</td><td>Mettler Toledo</td><td>30019028</td><td></td></tr><tr><td>pinza</td><td>FST</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>1 L pallone</td><td>Fisherbrand</td><td>FB5011000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Macchina per autoclave</td><td>Amsco</td><td>3021</td><td></td></tr><tr><td>Piastra magnetica di agitazione</td><td>Bellco</td><td>7760-06000</td><td></td></tr><tr><td>Barre di agitazione magnetiche</td><td>Bellco</td><td>1975-00100</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro</td><td>Beckman</td><td>DU 640</td><td></td></tr><tr><td>Scanford Analizzatore FACScan</td><td>Cytek Biosciences</td><td>Custom Stanford e Cytek FACScan</td><td></td> aggiornato</tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope Software (&mu; Manager)</td><td>Open Imaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Matlab Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flowjo</td><td>FlowJo, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software di analisi automatizzata delle immagini, CellC</td><td>https://sites.google.com/site/cellcsoftware/</td><td></td> <td>Il software è disponibile gratuitamente. I file eseguibili e i codici sorgente MATLAB possono essere ottenuti all https://sites.google.com/site/cellcsoftware/</td></tr></tbody></table>

un'analisi di poliacrilammide-basata di formato multi-pozzetto per studiare l'effetto della matrice extracellulare rigidità sull'infezione batterica delle cellule aderenti

A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells

Rigidità di matrice extracellulare comprende uno degli stimoli meccanici ambientali multipli che sono ben noti per influenzare il comportamento cellulare, funzione e destino in generale. Anche se le risposte dei sempre più più tipi di cellule aderenti alla rigidità di matrice sono state caratterizzate, come aderente suscettibilità delle cellule all'infezione batterica dipende dalla rigidità della matrice è in gran parte sconosciuta, come è l'effetto dell'infezione batterica sul biomeccanica della cellula ospite. Supponiamo che la suscettibilità delle cellule endoteliali dell'ospite ad un'infezione batterica dipende dalla rigidità della matrice in cui queste cellule risiedono, e che l'infezione dell'ospite le cellule con i batteri cambierà loro biomeccanica. Per verificare queste due ipotesi, le cellule endoteliali sono state utilizzate come modello host e Listeria monocytogenes come agente patogeno di modello. Lo sviluppo di un'analisi del romanzo formato multi-pozzetto, indichiamo che l'effetto di rigidità di matrice sull'infezione di cellule endoteliali da L. monocytogenes può essere valutata quantitativamente mediante citometria a flusso e immunostaining seguita da microscopia. Inoltre, utilizzando la microscopia a forza della trazione, l'effetto dell'infezione di L. monocytogenes biomeccanica delle cellule endoteliali host possa essere studiato. Il metodo proposto permette l'analisi dell'effetto della meccanica del tessuto-rilevanti sull'infezione batterica delle cellule aderenti, che è un passo fondamentale verso la comprensione delle interazioni biomeccaniche tra cellule, loro matrice extracellulare, e batteri patogeni. Questo metodo è anche applicabile a una vasta gamma di altri tipi di studi sulla biomeccanica di cella e la risposta alla rigidità del substrato dove è importante essere in grado di eseguire molte repliche in parallelo in ogni esperimento.

Sensibilità di rigidità-dipendente di ECM delle cellule HMEC-1 all'infezione di Lm: PA idrogeli di rigidità variabile, tutti superficie-rivestito con collagene I, sono stati costruiti sulle piastre di vetro multi-pozzetto inferiore come descritto nella fase 1 del protocollo (Vedi Figura 1). AFM sono state effettuate per confermare la rigidezza esatta degli idrogeli, come descritto in precedenza26,27 (Vedi Figura 2). Studi precedenti hanno mostrato che la conformità locale della membrana basale delle cellule endoteliali può variare da 1 kPa (ad es., tessuto cerebrale) a 70 kPa (ad es., aorta)36,37,38, 39 , 40. Pertanto, abbiamo scelto di testare l'infezione delle cellule HMEC-1 che risiedono su matrici con la rigidità seguente: 0,6 kPa, 3 kPa, kPa 20 e 70 kPa. Per ogni rigidità di idrogel, sei idrogeli furono fabbricati per valutare la riproducibilità dei risultati.
Citometria a flusso è stato utilizzato per valutare la suscettibilità di rigidità-dipendente di ECM di cellule HMEC-1 all'infezione Lm (Vedi Figura 3). Cellule HMEC-1 sono state infettate con un ceppo di Lm (JAT985) che esprime un marcatore fluorescente dopo internalizzazione (actAp::mTagRFP), che permette la rilevazione di batteri intracellulari soltanto (Vedi figure 1 L - 1N). JAT985 manca anche ActA, disabilitando i batteri da diffusione da cella a cella, poiché ActA è necessario per la formazione di code di cometa di actina e successiva diffusione batterica. 7 - post-l'infezione 8 h, l'infezione delle cellule HMEC-1 è stato valutato mediante citometria a flusso. Per garantire l'analisi delle singole cellule, la maggior parte della distribuzione dei conteggi delle cellule era stata eliminata utilizzando l'in avanti rispetto al grafico a dispersione laterale, e poi una seconda fase di gating è stata effettuata per escludere le celle che presentano autofluorescenza (Vedi figure 3A - 3C ). I risultati preliminari, raffigurati in Figura 3 dimostrano che l'infezione di HMEC-1 con Lm è circa due volte maggiore per cellule HMEC-1 che risiedono sul rigida 70 kPa idrogeli rispetto alle cellule che risiedono sui morbido idrogeli kPa 0,6 (vedere figure 3B - 3D). la suscettibilità di infezione Lm aumentata delle cellule HMEC-1 che risiedono su rigida rispetto alle matrici morbidi potrebbe essere dovuto a: 1. aumentata aderenza Lm HMEC-1; 2. maggiore invasione di Lm in HMEC-1; o 3. entrambi il co-avvenimento sopra. Per verificare quale ipotesi detiene, cellule HMEC-1 sono state seminate su soft (3 kPa) e rigida (70 kPa) idrogeli e infettate con costitutivamente GFP esprimendo Lm (Vedi figure 4A - 4C). I campioni sono stati risolti poco dopo l'infezione ed i batteri esterni (aderenti) erano macchiati con gli anticorpi. Usando la microscopia quantitativa, abbiamo scoperto che ci sono significativamente più batteri aderendo al HMEC-1 quando le cellule ospiti risiedono sul rigido rispetto al gel molli (Vedi Figura 4D). Coerenti con i dati di citometria a flusso, ci sono significativamente più batteri interiorizzate di HMEC-1 quando le cellule ospiti risiedono sul rigido rispetto al gel molli (Vedi Figura 4E). Tuttavia, l'efficienza di invasione (batteri interiorizzato/numero totale di batteri) di Lm in cellule HMEC-1 è simile, indipendentemente dalla rigidità del substrato (Vedi Figura 4F).
Microscopia di forza di trazione delle cellule HMEC-1 Lm-infettati: L'infezione delle cellule HMEC-1 LM potrebbe alterare la biomeccanica delle cellule ospiti infetti, tra cui la forza di attaccamento alla loro ECM o di ogni altro, che interessano l'integrità della barriera. Abbiamo cercato di valutare se questo potrebbe essere il caso mediante microscopia a forza trazione32 per calcolare le forze di trazione di cella-ECM e monostrato Stress microscopia41 per calcolare le forze tensionale intracellulare. Figura 5 raffigura mappe del campo di deformazione, campo di sforzo di trazione e campo di tensione intracellulare delle cellule HMEC-1 residente su 20-kPa idrogeli a tempi diversi punti post-infezione. Figure 5A - 5D fanno riferimento a celle di controllo non infetto HMEC-1 mentre figure 5E - 5h consultare HMEC-1 cellule infettate con Lm ad una molteplicità di infezione pari a 300/cellula dei batteri. Questo lavoro preliminare suggerisce che infettate cellule HMEC-1 riducono la grandezza della loro cella-ECM e sottolinea intracellulare nel corso di un'infezione con Lm, considerando che non è osservato per le cellule di controllo non infetto.
Diffusione a ECM rigidità-dipendente Lm attraverso strati monomolecolari HMEC-1: Time-lapse microscopia è stata usata per studiare l'effetto rigidità matrice ha sulla diffusione di Lm attraverso strati monomolecolari HMEC-1. Come Lm si diffonde attraverso il monostrato, i batteri creano un focus di infezione che cresce in funzione del tempo (Vedi Figura 6A e Video figure 1 e 2). L'area di messa a fuoco l'infezione è stata misurata tracciando un guscio convesso, il più piccolo poligono convesso che racchiude un insieme di punti, intorno i batteri42. Non esiste alcuna metrica standard nel settore per misurare l'efficienza della diffusione di cellula--cellula di L. monocytogenes attraverso un monostrato di cellule dell'ospite. Per valutare l'efficienza di diffusione, alcuni hanno contato il numero di cellule dell'ospite in un focus di infezione41, e altri hanno confini disegnati manualmente intorno al gruppo di infezione host cellule43. Abbiamo scelto disegnare un poligono convesso intorno i batteri, perché è un processo automatizzato, coerente e computazionalmente economico per misurare l'efficienza della diffusione di L. monocytogenes . Così facendo, abbiamo trovato una lieve diminuzione dell'area focus di infezione nelle cellule HMEC-1 seminate su 70 kPa idrogel rispetto a quelle seminate su 3 matrici di kPa (Vedi Figura 6B e Video figure 1 e 2). Per determinare il tasso di crescita del focus di infezione, la distanza radiale è stata tracciata come funzione del tempo prendendo la radice quadrata dell'area di messa a fuoco l'infezione e questo dividendo da pi. Questa trasformazione matematica presuppone che la forma della messa a fuoco infezione è approssimativamente circolare44. Per misurare la velocità della crescita messa a fuoco, è stato misurato il tasso di cambiamento (cioè, la pendenza) della distanza radiale per entrambi matrici 3 e 70 kPa. Questo approccio chiarito che il focus di infezione è cresciuto più velocemente e monotona in cellule HMEC-1 seminate su matrici 3-kPa. Tuttavia, la messa a fuoco è cresciuto significativamente più lento (primo 200 min) e leggermente più lento (200-600 min) in cellule seminate su matrici 70-kPa (Vedi Figura 6C). Infatti, l'analisi di ulteriori dati ha confermato che il focus di infezione è cresciuto, in media, due volte più lento in matrici 70-kPa, soprattutto durante il primo min 200 (Vedi Figura 6D).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57361/57361fig3.jpg"> Figura 3 : ECM rigidità-dipendente suscettibilità delle cellule HMEC-1 per invasione di Lm misurata mediante citometria a flusso .  Cellule HMEC-1 sono state infettate con Lm (JAT985) e l'infezione è stata analizzata tramite flusso cytometry. A. questo pannello mostra un lato contro dispersione avanti per rappresentante cellule HMEC-1 provenienti da un singolo pozzo. La distribuzione di massa delle cellule è stata selezionata tramite gating per escludere detriti (a sinistra) e delle cellule doppiette o triplette (a destra). B. questo grafico mostra un istogramma del logaritmo dell'intensità di fluorescenza Lm per cella per HMEC-1 ha placcato il morbido 0,6 kPa. C. questo grafico mostra un istogramma del logaritmo dell'intensità di fluorescenza Lm per cella per HMEC-1 placcato sulla rigida 70 kPa idrogeli. Gli istogrammi per N = 4-6 ripetizioni sono mostrati in diversi colori. Istogramma delle cellule controllo non infetto è viola. La porta utilizzata per definire che cosa è infetto è mostrata in rosso. Il MOI è 100 e l'infezione è stata valutata 8 h post-infezione. D. dati mostrano la percentuale delle cellule infettate HMEC-1 versus idrogel rigidità (N = 5). Le barre orizzontali raffigurano media dei dati. Il P-value è stato calcolato con il test di Wilcoxon Rank Sum non parametrica. <a href="/files/ftp_upload/57361/57361fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Video Figure 1" src="/files/ftp_upload/57361/57361mov1.jpg"> Video Figura 1: diffusione intracellulare LM (canale rosso) attraverso un monostrato di cellule HMEC-1 (fase) seminate su un substrato di 3-kPa. Le cellule erano imaged in media L-15 di Leibovitz (10% FBS, 20 µ g/mL di gentamicina) dentro una camera ambientale equilibrata a 37 ˚ c. Le immagini sono stati raccolti ogni 5 min. La velocità è 15 fotogrammi/s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57361/Video_Figure_1.mov" target="_blank">per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)</a>
<img alt="Video Figure 2" src="/files/ftp_upload/57361/57361mov2.jpg"> Video Figura 2: diffusione di Lm intracellulare (canale rosso) attraverso un monostrato di cellule HMEC-1 (fase) seminate su un substrato di 70-kPa. Le cellule erano imaged in media L-15 di Leibovitz (10% FBS, 20 µ g/mL di gentamicina) dentro una camera ambientale equilibrata a 37 ° C. Le immagini sono stati raccolti ogni 5 min. La velocità è 15 fotogrammi/s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57361/Video_Figure_2.mov" target="_blank">per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Modulo di Young (E, kPa)</td>
			<td>% Di acrilammide (dal 40% delle scorte)</td>
			<td>Bisacrylamide % (dal 2% delle scorte)</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.6</td>
			<td>3</td>
			<td>0,045</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>5</td>
			<td>0,075</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>0,075</td>
		</tr>
<tr>
<td>20</td>
			<td>8</td>
			<td>0,195</td>
		</tr>
<tr>
<td>70</td>
			<td>10</td>
			<td>0.45</td>
		</tr>
</tbody></table> Tabella 1. Composizione di idrogel di poliacrilamide (PA) di diversa rigidezza. In questa tabella, la percentuale di soluzione stock 40% di acrilammide e la percentuale di stock 2% bis-acrilammide soluzione per raggiungere un determinato rigidità (modulo di Young, E) sono indicati in colonne diverse.
<img alt="Supplemental Material" src="/files/ftp_upload/57361/57361supfig1.jpg"> Materiale supplementare 1. Calcolo della tensione intracellulare da sollecitazioni di trazione calcolata. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57361/Supplemental_Material_1.docx" target="_blank">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>

Abbiamo sviluppato un test multi-pozzetto formato poliacrilammide per sondare l'effetto di rigidità di matrice extracellulare sull'infezione batterica delle cellule aderenti. Questo test è compatibile con citometria a flusso, immunostaining e microscopia di forza di trazione, permettendo per la misurazione quantitativa delle interazioni biomeccaniche tra cellule, loro matrice extracellulare e batteri patogeni.

Un'analisi di poliacrilammide-basata di formato multi-pozzetto per studiare l'effetto della matrice extracellulare rigidità sull'infezione batterica delle cellule aderenti

Extracellular matrix stiffness comprises one of the multiple environmental mechanical stimuli that are well known to influence cellular behavior, ...

L'obiettivo generale di questa metodologia è quello di consentire la caratterizzazione dell'effetto della rigidità della matrice extracellulare sull'infezione batterica delle cellule aderenti in modo altamente quantitativo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo emergente della biomeccanica ospite-patogeno, come ad esempio qual è il ruolo delle forze meccaniche nella modulazione della suscettibilità alle infezioni batteriche delle cellule ospiti. Questa tecnica aiuta a creare sequenze video time lapse ad alta risoluzione, visualizzando contemporaneamente più condizioni e automatizzando determinate procedure.Per eseguire l'attivazione in vetro di piastre a 24 pozzetti, aggiungere 500 microlitri di idrossido di sodio tumalo per pozzetto di 13 millimetri di diametro e incubare le piastre a temperatura ambiente per un'ora. Scartare l'idrossido di sodio e utilizzare acqua ultrapura per sciacquare i pozzetti una volta. Quindi aggiungere 500 microlitri di trietossisilano al due percento in etanolo al 95% in ciascun pozzetto e incubarli per cinque minuti.Con acqua, sciacquare i pozzetti una volta. Quindi aggiungere 500 microlitri di glutaraldeide allo 0,5% in ciascun pozzetto e incubare le piastre per 30 minuti. Dopo aver risciacquato una volta con acqua, asciugare i piatti a 60 gradi Celsius senza coperchio.Per produrre idrogel con rigidità regolabile, preparare soluzioni acquose che contengano dal tre al 10% di una soluzione di acrilammide stock al 40% e dal 06 al 6% di una soluzione di bis-acrilammide al due percento, a seconda della rigidità desiderata dell'idrogel. Dopodiché, aggiungere l'acqua. Per ogni rigidità, la soluzione uno è priva di microsfere, mentre la soluzione due contiene microsfere fluorescenti allo 03% da 0,1 micrometri.Degassare le soluzioni One e Two sottovuoto per 15 minuti per eliminare l'ossigeno che inibirà la polimerizzazione. Quindi, agendo rapidamente, aggiungere lo 0,43% di TEMED e lo 0,6% della soluzione APS stock da 10 grammi per millilitro alla Soluzione One. Aggiungere 3,6 microlitri di soluzione al centro di ciascun pozzetto del piatto a 24 pozzetti.Utilizzare immediatamente vetrini coprioggetti circolari da 12 millimetri per coprire i pozzetti e lasciare riposare la soluzione per 20 minuti in modo che polimerizzi completamente. Picchiettare delicatamente l'ago di una siringa su una superficie dura per creare un piccolo gancio sulla punta per facilitare la rimozione dei vetrini coprioggetti, quindi utilizzare l'ago per sollevare i vetrini coprioggetti. Quindi, aggiungere lo 0,43% di TEMED e lo 0,6% della soluzione APS stock da 10 grammi per millilitro alla Soluzione Due.Quindi depositare 2,4 microlitri di miscela sopra i vetrini coprioggetti circolari da 12 millimetri. Posizionare i vetrini coprioggetti circolari con una goccia di Soluzione Due sopra il primo strato di poliacrilammide e utilizzare una pinza per premere delicatamente verso il basso per garantire che lo spessore del secondo strato sia minimo. Quindi lasciare polimerizzare la Soluzione Due per 20 minuti.Aggiungere 500 microlitri di HEPES pH 7,5 da 50 millimolari a ciascuno dei pozzetti e utilizzare l'ago della siringa e la pinza per rimuovere i vetrini di copertura. Per sterilizzare gli idrogel, metterli in una cappa di coltura tissutale ed esporli ai raggi UV per un'ora. Ora, preparare una miscela di 0,5% in peso per volume di Sulfo-SANPAH e uno per cento di DMSO e 50 millimolari HEPES pH 7,5.Aggiungere 200 microlitri di soluzione sulla superficie superiore degli idrogel. Quindi, lavorando velocemente, esponili a 302 nanometri UV per 10 minuti per attivarli. Utilizzare un millilitro di HEPES pH 7,5 da 50 millimolari per lavare gli idrogel due volte, ripetendo se necessario per rimuovere l'eventuale reticolante in eccesso.Rivestire gli idrogel con 200 microlitri di collagene di coda di ratto I da 0,25 milligrammi per millilitro e HEPES da 50 millimolari. Incubare gli idrogel con il collagene a temperatura ambiente per una notte. Prima di seminare le cellule di interesse sugli idrogel, aggiungere un millilitro di terreno ed equilibrarle a 37 gradi Celsius per un'ora.Per seminare le cellule endoteliali microvascolari umane, dopo aver coltivato e preparato una sospensione cellulare secondo il protocollo di testo, rimuovere il terreno dagli idrogel, quindi aggiungere un millilitro di sospensione cellulare a ciascun pozzetto. Dopo aver preparato una coltura notturna di L. monocytogenes secondo il protocollo di testo, trasferire un millilitro di coltura in una provetta da microcentrifuga e centrifugarla a 2.000 volte g a temperatura ambiente per quattro minuti. Dopo aver utilizzato il PBS per colture tissutali per lavare due volte il pellet, utilizzare un millilitro di PBS per risospendere il pellet.Preparare la miscela per l'infezione combinando 10 o 50 microlitri di sospensione batterica con un millilitro di terreno pieno MCDB 131 per una molteplicità di infezioni, o MOI, di circa 50 batteri per cellula ospite o 10 batteri per cellula ospite. Rimuovere il terreno dai pozzetti delle piastre a 24 pozzetti, facendo attenzione a non distruggere gli idrogel o le cellule. Utilizzare un millilitro di terreno pieno MCDB 131 per lavare le cellule una volta, quindi aggiungere un millilitro di batteri a ciascun pozzetto.Posizionare il coperchio sui piatti e avvolgerli con pellicola per alimenti in polietilene per evitare perdite. Centrifugare le piastre a 2.000 volte g per 10 minuti per sincronizzare l'invasione, quindi incubare le colture a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Con MCDB 131 full medium, lavare i campioni quattro volte e rimetterli nell'incubatore per colture tissutali.Dopo altri 30 minuti, sostituire il terreno con MCDB 131 full medium integrato con 20 microgrammi per millilitro di gentamicina. Per eseguire la citometria a flusso, otto ore dopo l'infezione, rimuovere il terreno dai pozzetti della piastra a 24 pozzetti e utilizzare la coltura tissutale PBS per lavare i pozzetti una volta. Dopo la rimozione del PBS, aggiungere 200 microlitri di tripsina EDTA collagenasi miscela in ciascun pozzetto.Posizionare la piastra nell'incubatore per colture tissutali per 10 minuti per consentire il completo distacco delle cellule. Dopo aver pipettato delicatamente ogni pozzetto otto volte, aggiungere 200 microlitri di terreno pieno per neutralizzare la tripsina. Trasferire i 400 microlitri di soluzione cellulare da ciascun pozzetto in una provetta di polistirene da cinque millilitri con un tappo filtrante da 35 micrometri.Analizzare i campioni mediante citometria a flusso. Dopo aver seminato le cellule HMEC-1 su idrogel di Pa e aver trattato con gentamicina secondo il protocollo di testo, incubare la piastra per cinque ore per consentire al promotore di ActA di accendersi e guidare l'espressione del frame di lettura aperto mTagRFP. Quattro ore dopo l'infezione, mescolare un microlitro di un milligrammo per millilitro di colorante Hoechst con un millilitro di terreno pieno L-15 e aggiungerlo a ciascun pozzetto per colorare i nuclei.Dopo aver incubato le cellule per 10 minuti, sostituire il terreno con un millilitro di terreno pieno L-15 integrato con 20 microgrammi per millilitro di gentamicina. Immagini di più posizioni ogni cinque minuti utilizzando una funzione di messa a fuoco automatica per monitorare il modo in cui i batteri LM si diffondono attraverso i monostrati HMEC-1 seminati su idrogel a rigidità variabile. Come riportato in questo grafico, le misurazioni AFM sono state eseguite per confermare l'esatta rigidità degli idrogel di Pa preparati utilizzando il protocollo in questo video.Qui, le cellule HMEC-1 su matricie di diversa rigidità sono state infettate con un ceppo LM che esprime un marcatore fluorescente dopo l'internalizzazione che consente solo la rilevazione di batteri intracellulari. Le cellule sono state gated utilizzando il grafico di dispersione in avanti rispetto al lato e una seconda fase di gating ha escluso le cellule che mostravano autofluorescenza. L'analisi della citometria a flusso ha rivelato che l'infezione da LM era circa due volte maggiore con idrogel rigidi da 70 kilopascal rispetto a 0,6 kilopascal.Per verificare se l'aumento dell'adesione di LM su HMEC-1 e l'aumento dell'invasione di LM in HMEC-1, o entrambi, fossero responsabili dell'aumentata suscettibilità all'infezione poco dopo l'infezione con LM che esprime costitutivamente GFP, le cellule HMEC-1 sono state fissate e i batteri aderenti sono stati colorati con anticorpi. Come mostrato qui, c'erano significativamente più batteri che aderivano a HMEC-1 quando le cellule ospiti risiedono su gel rigidi rispetto ai gel molli. Coerentemente con i dati della citometria a flusso, ci sono significativamente più batteri internalizzati da HMEC-1 quando le cellule ospiti risiedono su gel rigidi rispetto ai gel molli.Una volta padroneggiato, questo test può essere eseguito in circa tre giorni, poiché sono necessarie lunghe fasi di incubazione intermedie. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di essere il più sterili possibile per garantire che gli idrogel e le cellule ospiti siano privi di contaminazioni. Seguendo questa procedura, possono essere incorporati anche altri metodi come la microscopia a forza atomica per rispondere a domande come come cambia la rigidità delle cellule ospiti in seguito all'infezione e se questo effetto dipende dalla rigidità della matrice.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della meccanobiologia per esplorare il ruolo delle interazioni biomeccaniche dei patogeni delle cellule ospiti utilizzando diverse cellule ospiti, come le cellule epiteliali, e diversi patogeni batterici, come la Rickettsia parkeri. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come produrre idrogel di rigidità sintonizzabile su piastre a più pozzetti e come eseguire il test di infezione. Non dimenticare che lavorare con batteri patogeni può essere pericoloso.Pertanto, durante l'esecuzione di questa procedura è necessario adottare sempre precauzioni, come l'inserimento di barriere tra il sito di ingresso e l'agente patogeno, nonché prevenire la generazione di aerosol.

a-multi-well-format-polyacrylamide-based-assay-for-studying-effect

Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

L'effetto di rigidità substrati sulla funzione cellulare può essere...

Studiare gli effetti di rigidità Matrix sulla funzione cellulare utilizzando acrilamide a base di idrogeli

Questo video mostra un test per studiare l'effetto della rigidità della matrice extracellulare (ECM) sull'infezione batterica delle cellule aderenti. Gli idrogel di poliacrilammide di rigidità variabile, ricoperti di collagene, sono stratificati in una piastra a più pozzetti per imitare la rigidità della ECM fisiologica. Dopo aver sovrapposto cellule endoteliali umane sugli idrogel e aver infettato le cellule con batteri Listeria monocytogenes ingegnerizzati per esprimere una proteina...

Un test per studiare l'impatto della rigidità della matrice extracellulare sull'infezione batterica

Questo video mostra la microscopia time-lapse quantitativa per valutare la disseminazione di Listeria monocytogenes dipendente dalla rigidità della matrice extracellulare attraverso le cellule endoteliali. Un idrogel più morbido facilita una più rapida diffusione batterica attraverso le cellule endoteliali rispetto alle controparti più rigide, evidenziando l'influenza della rigidità della matrice sulla disseminazione batterica.

Microscopia quantitativa time-lapse per la valutazione della disseminazione batterica dipendente dalla rigidità della matrice extracellulare

Rigidità meccanica nel microambiente tumorale gioca un ruolo cruciale nel guidare il comportamento maligno aumentando l'attività Invadopodi e actomiosina contrattilità. Utilizzando gel di poliacrilammide (PaaS), Invadopodi e forza di trazione test possono essere utilizzati per studiare le proprietà invasive e contrattili delle cellule tumorali in risposta alla matrice rigidità.

Gel di poliacrilammide per Invadopodi e trazione Forza saggi sulle cellule tumorali

Qui viene descritto un metodo che consente una preparazione rapida, efficiente ed economica di gel di poliacrilammide in un formato di piastra multipozzetto. Il metodo non richiede alcuna attrezzatura specializzata e potrebbe essere facilmente adottato da qualsiasi laboratorio di ricerca. Sarebbe particolarmente utile nella ricerca incentrata sulla comprensione delle risposte cellulari dipendenti dalla rigidità.

Semplice Poliacrilammide-based a più pozzetti Rigidità Assay per lo Studio della rigidezza-dipendenti le risposte delle cellule

Durante il processo di infezione, un passo fondamentale è l'adesione di patogeni con cellule ospiti. Nella maggior parte dei casi questo passo adesione avviene in presenza di sollecitazioni meccaniche generate dal flusso liquido. Descriviamo una tecnica che introduce sforzo di taglio come un parametro importante nello studio della adesione batterica.

L&#39;introduzione di shear stress nello studio di adesione batterica

Descriviamo un dosaggio qualitativo per monitorare la concorrenza batterica mediata...

Un test per il monitoraggio visivo T6SS-mediata Concorso batterica

Questo metodo descrive l'uso di chimica di clic per misurare le variazioni di trascrizione della cellula ospite dopo l'infezione con il virus della febbre della valle del Rift (RVFV) ceppo MP-12. I risultati possono essere visualizzati qualitativamente tramite microscopia a fluorescenza o ottenuti quantitativamente mediante citometria a flusso. Questo metodo è adattabile per l'uso con altri virus.

Utilizzando Clicca Chimica per misurare l&#39;effetto dell&#39;infezione virale sulla cellula ospite RNA Sintesi

In vitro aderenza possono essere utilizzati per studiare l'attaccamento di Streptococcus pneumoniae di monostrati di cellule epiteliali e di indagare potenziali interventi quali l'uso di probiotici per inibire la colonizzazione pneumococcica.

Indagare gli effetti dei probiotici sul pneumococcico colonizzazione utilizzo di un<em&gt; In Vitro</em&gt; Aderenza Assay

La capacità di endotelio infiammato per reclutare leucociti dal flusso è regolato da cellule stromali mesenchimali. Descriviamo due modelli in vitro che incorporano cellule umane primarie che possono essere utilizzati per valutare il reclutamento di neutrofili dal flusso e esaminare il ruolo che le cellule stromali mesenchimali svolgono nel regolare questo processo.

Analizzando gli effetti delle cellule stromali per il reclutamento dei leucociti da portata

Scopri come analizzare l'effetto della rigidità della matrice extracellulare sull'infezione batterica delle cellule endoteliali usando idrogeli di poliacrilammide e Listeria monocytogenes. Questo metodo quantitativo consente screening ad alto rendimento.

Unanalisi di poliacrilammide-basata di formato multi-pozzetto per studiare leffetto della matrice extracellulare rigidità sullinfezione batterica delle cellule aderenti (Video) | JoVE Journal

Un'analisi di poliacrilammide-basata di formato multi-pozzetto per studiare l'effetto della matrice extracellulare rigidità sull'infezione batterica delle cellule aderenti

Esplora altri video