Un'analisi di poliacrilammide-basata di formato multi-pozzetto per studiare l'effetto della matrice extracellulare rigidità sull'infezione batterica delle cellule aderenti

L'obiettivo generale di questa metodologia è quello di consentire la caratterizzazione dell'effetto della rigidità della matrice extracellulare sull'infezione batterica delle cellule aderenti in modo altamente quantitativo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo emergente della biomeccanica ospite-patogeno, come ad esempio qual è il ruolo delle forze meccaniche nella modulazione della suscettibilità alle infezioni batteriche delle cellule ospiti. Questa tecnica aiuta a creare sequenze video time lapse ad alta risoluzione, visualizzando contemporaneamente più condizioni e automatizzando determinate procedure.

Per eseguire l'attivazione in vetro di piastre a 24 pozzetti, aggiungere 500 microlitri di idrossido di sodio tumalo per pozzetto di 13 millimetri di diametro e incubare le piastre a temperatura ambiente per un'ora. Scartare l'idrossido di sodio e utilizzare acqua ultrapura per sciacquare i pozzetti una volta. Quindi aggiungere 500 microlitri di trietossisilano al due percento in etanolo al 95% in ciascun pozzetto e incubarli per cinque minuti.

Con acqua, sciacquare i pozzetti una volta. Quindi aggiungere 500 microlitri di glutaraldeide allo 0,5% in ciascun pozzetto e incubare le piastre per 30 minuti. Dopo aver risciacquato una volta con acqua, asciugare i piatti a 60 gradi Celsius senza coperchio.

Per produrre idrogel con rigidità regolabile, preparare soluzioni acquose che contengano dal tre al 10% di una soluzione di acrilammide stock al 40% e dal 06 al 6% di una soluzione di bis-acrilammide al due percento, a seconda della rigidità desiderata dell'idrogel. Dopodiché, aggiungere l'acqua. Per ogni rigidità, la soluzione uno è priva di microsfere, mentre la soluzione due contiene microsfere fluorescenti allo 03% da 0,1 micrometri.

Degassare le soluzioni One e Two sottovuoto per 15 minuti per eliminare l'ossigeno che inibirà la polimerizzazione. Quindi, agendo rapidamente, aggiungere lo 0,43% di TEMED e lo 0,6% della soluzione APS stock da 10 grammi per millilitro alla Soluzione One. Aggiungere 3,6 microlitri di soluzione al centro di ciascun pozzetto del piatto a 24 pozzetti.

Utilizzare immediatamente vetrini coprioggetti circolari da 12 millimetri per coprire i pozzetti e lasciare riposare la soluzione per 20 minuti in modo che polimerizzi completamente. Picchiettare delicatamente l'ago di una siringa su una superficie dura per creare un piccolo gancio sulla punta per facilitare la rimozione dei vetrini coprioggetti, quindi utilizzare l'ago per sollevare i vetrini coprioggetti. Quindi, aggiungere lo 0,43% di TEMED e lo 0,6% della soluzione APS stock da 10 grammi per millilitro alla Soluzione Due.

Quindi depositare 2,4 microlitri di miscela sopra i vetrini coprioggetti circolari da 12 millimetri. Posizionare i vetrini coprioggetti circolari con una goccia di Soluzione Due sopra il primo strato di poliacrilammide e utilizzare una pinza per premere delicatamente verso il basso per garantire che lo spessore del secondo strato sia minimo. Quindi lasciare polimerizzare la Soluzione Due per 20 minuti.

Aggiungere 500 microlitri di HEPES pH 7,5 da 50 millimolari a ciascuno dei pozzetti e utilizzare l'ago della siringa e la pinza per rimuovere i vetrini di copertura. Per sterilizzare gli idrogel, metterli in una cappa di coltura tissutale ed esporli ai raggi UV per un'ora. Ora, preparare una miscela di 0,5% in peso per volume di Sulfo-SANPAH e uno per cento di DMSO e 50 millimolari HEPES pH 7,5.

Aggiungere 200 microlitri di soluzione sulla superficie superiore degli idrogel. Quindi, lavorando velocemente, esponili a 302 nanometri UV per 10 minuti per attivarli. Utilizzare un millilitro di HEPES pH 7,5 da 50 millimolari per lavare gli idrogel due volte, ripetendo se necessario per rimuovere l'eventuale reticolante in eccesso.

Rivestire gli idrogel con 200 microlitri di collagene di coda di ratto I da 0,25 milligrammi per millilitro e HEPES da 50 millimolari. Incubare gli idrogel con il collagene a temperatura ambiente per una notte. Prima di seminare le cellule di interesse sugli idrogel, aggiungere un millilitro di terreno ed equilibrarle a 37 gradi Celsius per un'ora.

Per seminare le cellule endoteliali microvascolari umane, dopo aver coltivato e preparato una sospensione cellulare secondo il protocollo di testo, rimuovere il terreno dagli idrogel, quindi aggiungere un millilitro di sospensione cellulare a ciascun pozzetto. Dopo aver preparato una coltura notturna di L. monocytogenes secondo il protocollo di testo, trasferire un millilitro di coltura in una provetta da microcentrifuga e centrifugarla a 2.000 volte g a temperatura ambiente per quattro minuti. Dopo aver utilizzato il PBS per colture tissutali per lavare due volte il pellet, utilizzare un millilitro di PBS per risospendere il pellet.

Preparare la miscela per l'infezione combinando 10 o 50 microlitri di sospensione batterica con un millilitro di terreno pieno MCDB 131 per una molteplicità di infezioni, o MOI, di circa 50 batteri per cellula ospite o 10 batteri per cellula ospite. Rimuovere il terreno dai pozzetti delle piastre a 24 pozzetti, facendo attenzione a non distruggere gli idrogel o le cellule. Utilizzare un millilitro di terreno pieno MCDB 131 per lavare le cellule una volta, quindi aggiungere un millilitro di batteri a ciascun pozzetto.

Posizionare il coperchio sui piatti e avvolgerli con pellicola per alimenti in polietilene per evitare perdite. Centrifugare le piastre a 2.000 volte g per 10 minuti per sincronizzare l'invasione, quindi incubare le colture a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Con MCDB 131 full medium, lavare i campioni quattro volte e rimetterli nell'incubatore per colture tissutali.

Dopo altri 30 minuti, sostituire il terreno con MCDB 131 full medium integrato con 20 microgrammi per millilitro di gentamicina. Per eseguire la citometria a flusso, otto ore dopo l'infezione, rimuovere il terreno dai pozzetti della piastra a 24 pozzetti e utilizzare la coltura tissutale PBS per lavare i pozzetti una volta. Dopo la rimozione del PBS, aggiungere 200 microlitri di tripsina EDTA collagenasi miscela in ciascun pozzetto.

Posizionare la piastra nell'incubatore per colture tissutali per 10 minuti per consentire il completo distacco delle cellule. Dopo aver pipettato delicatamente ogni pozzetto otto volte, aggiungere 200 microlitri di terreno pieno per neutralizzare la tripsina. Trasferire i 400 microlitri di soluzione cellulare da ciascun pozzetto in una provetta di polistirene da cinque millilitri con un tappo filtrante da 35 micrometri.

Analizzare i campioni mediante citometria a flusso. Dopo aver seminato le cellule HMEC-1 su idrogel di Pa e aver trattato con gentamicina secondo il protocollo di testo, incubare la piastra per cinque ore per consentire al promotore di ActA di accendersi e guidare l'espressione del frame di lettura aperto mTagRFP. Quattro ore dopo l'infezione, mescolare un microlitro di un milligrammo per millilitro di colorante Hoechst con un millilitro di terreno pieno L-15 e aggiungerlo a ciascun pozzetto per colorare i nuclei.

Dopo aver incubato le cellule per 10 minuti, sostituire il terreno con un millilitro di terreno pieno L-15 integrato con 20 microgrammi per millilitro di gentamicina. Immagini di più posizioni ogni cinque minuti utilizzando una funzione di messa a fuoco automatica per monitorare il modo in cui i batteri LM si diffondono attraverso i monostrati HMEC-1 seminati su idrogel a rigidità variabile. Come riportato in questo grafico, le misurazioni AFM sono state eseguite per confermare l'esatta rigidità degli idrogel di Pa preparati utilizzando il protocollo in questo video.

Qui, le cellule HMEC-1 su matricie di diversa rigidità sono state infettate con un ceppo LM che esprime un marcatore fluorescente dopo l'internalizzazione che consente solo la rilevazione di batteri intracellulari. Le cellule sono state gated utilizzando il grafico di dispersione in avanti rispetto al lato e una seconda fase di gating ha escluso le cellule che mostravano autofluorescenza. L'analisi della citometria a flusso ha rivelato che l'infezione da LM era circa due volte maggiore con idrogel rigidi da 70 kilopascal rispetto a 0,6 kilopascal.

Per verificare se l'aumento dell'adesione di LM su HMEC-1 e l'aumento dell'invasione di LM in HMEC-1, o entrambi, fossero responsabili dell'aumentata suscettibilità all'infezione poco dopo l'infezione con LM che esprime costitutivamente GFP, le cellule HMEC-1 sono state fissate e i batteri aderenti sono stati colorati con anticorpi. Come mostrato qui, c'erano significativamente più batteri che aderivano a HMEC-1 quando le cellule ospiti risiedono su gel rigidi rispetto ai gel molli. Coerentemente con i dati della citometria a flusso, ci sono significativamente più batteri internalizzati da HMEC-1 quando le cellule ospiti risiedono su gel rigidi rispetto ai gel molli.

Una volta padroneggiato, questo test può essere eseguito in circa tre giorni, poiché sono necessarie lunghe fasi di incubazione intermedie. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di essere il più sterili possibile per garantire che gli idrogel e le cellule ospiti siano privi di contaminazioni. Seguendo questa procedura, possono essere incorporati anche altri metodi come la microscopia a forza atomica per rispondere a domande come come cambia la rigidità delle cellule ospiti in seguito all'infezione e se questo effetto dipende dalla rigidità della matrice.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della meccanobiologia per esplorare il ruolo delle interazioni biomeccaniche dei patogeni delle cellule ospiti utilizzando diverse cellule ospiti, come le cellule epiteliali, e diversi patogeni batterici, come la Rickettsia parkeri. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come produrre idrogel di rigidità sintonizzabile su piastre a più pozzetti e come eseguire il test di infezione. Non dimenticare che lavorare con batteri patogeni può essere pericoloso.

Pertanto, durante l'esecuzione di questa procedura è necessario adottare sempre precauzioni, come l'inserimento di barriere tra il sito di ingresso e l'agente patogeno, nonché prevenire la generazione di aerosol.