Name: Lisolamento e coltura di cellule primarie dellepicardio ricavate da campioni di cuore umano adulto e fetale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Scopri l'isolamento e la coltura di cellule primarie dell'epicardio da tessuto cardiaco umano. Questo metodo consente di studiare la transizione epitelio-mesenchimale e il comportamento cellulare per la ricerca cardiaca.

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Questa ricerca è sostenuta da l'organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO) (VENI 016.146.079) e un assegno di ricerca LUMC sia per AMS e Stichting Bontius LUMC (MJG).

Tutti gli esperimenti con campioni di tessuto umano sono stati approvati dal comitato etico del Leiden University Medical Center e conforme alla dichiarazione di Helsinki. Tutti i passaggi sono eseguiti con attrezzature sterili in un flusso di cultura cellulare mobile.
1. preparati
<ol><li>Preparare il supporto di EPDC mescolando di Dulbecco esente modificato Eagle (DMEM basso-glucosio) e Medium 199 (M199) in un rapporto 1:1. Aggiungere inattivato con calore 10% siero bovino fetale (FBS, calore inattivati per 25 min a 56 ° C) e completare con 100 U/mL di penicillina e 100 mg/mL di streptomicina. Pre-riscaldare il mezzo EPDC in bagnomaria a 37 ° C.</li>
	<li>Preriscaldare la tripsina 0.25%/EDTA (1:1) a bagnomaria a 37 ° C.</li>
	<li>Pozzi di cappotto con gelatina. Aggiungere 0,1% gelatina/PBS in ciascun pozzetto e incubare le piastre per almeno 15 min a 37 ° C. Linee guida per la piastra di coltura cellulare richiesto sono riassunti nella tabella 1. Rimuovere con attenzione tutto il liquido prima di placcatura di cellule.</li>
	<li>Preparare una soluzione stock di 10 mM SB431542 (SB), diluita in DMSO (attenzione). Rendere le aliquote di 50 µ l in provette in polipropilene fondo conico, come provette Eppendorf e conservarli a-20 ° C. Si noti che le aliquote SB possono essere scongelate solo una volta.</li>
</ol>2. recupero e conservazione degli esemplari adulti e fetale cuore
<ol><li>Memorizzare i auricles umano adulto direttamente alla rimozione durante l'intervento chirurgico in un tubo da 50 mL con 15 mL alto-glucosio DMEM contenente 10% FBS, 100 U/mL di penicillina e streptomicina 100 mg/mL a 4 ° C. I campioni sono generalmente 3-5 cm nel formato e possono essere memorizzati fino a 48 h dopo la dissezione.</li>
	<li>Conservare il cuore fetale ottenuto da materiale di aborto elettivo in mezzo EPDC a 4 ° C fino a 24 h dopo l'isolamento. Per questo protocollo, è possibile utilizzare campioni con un'età gestazionale tra 12-22 settimane. Notare che tutto il cuore può essere utilizzato per l'isolamento dell'epicardio.</li>
</ol>3. isolamento dello strato dell'epicardio
<ol><li>Nel flusso laminare, preparare un piatto di coltura cellulare di 100 mm con PBS e posizionare una goccia separata (~ 200 µ l) di PBS nel coperchio. Riempire una provetta da 15 mL con 5 mL di terreno pre-riscaldato di EPDC.</li>
	<li>Posizionare il tessuto in coltura cellulare piatto pieno di PBS. Assicurarsi che il tessuto è inumidito frequentemente durante la procedura.</li>
	<li>Utilizzando un microscopio stereoscopico, rimuovere tanto dello strato dell'epicardio dal campione di tessuto possibile staccando di usando il forcipe. Nota: L'epicardio può essere riconosciuto come uno strato molto sottile, trasparente aderito strettamente all'esterno del cuore (Figura 1A). Se si tenta di evitare la contaminazione con tessuto adiposo epicardico e vasi sanguigni poiché questo ostacolerà l'isolamento.</li>
	<li>Raccogliere i pezzi di tessuto dell'epicardio nella goccia di PBS sul coperchio.</li>
	<li>Tagliare il tessuto dell'epicardio in piccoli pezzi (0,5 mm3) usando un bisturi (Figura 1B), oppure usando le punte taglienti di piccola pinzetta. Si noti che i pezzi devono essere in grado di passare un P1, puntale 000 (punto 3.6).</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di tripsina al tessuto dell'epicardio e raccogliere i pezzi e la tripsina con una P1, 000 puntale. Trasferire il tessuto in una provetta conica per centrifuga da 1,5 mL (Figura 1).</li>
	<li>Incubare la provetta nel bagnomaria a 37 ° C per 10 minuti, agitando a ~ 60 giri/min.</li>
	<li>Rimuovere il tubo dal bagno di acqua e pulire la parte esterna del tubo con etanolo al 70%.</li>
	<li>Consentire al tessuto di depositarsi sul fondo del tubo (Figura 1) e trasferire con cautela il supernatante contenente cellule dell'epicardio nella provetta di 15 mL contenente 5 mL di terreno di EPDC per inattivare la tripsina.</li>
	<li>Ricostituire il tessuto restante nella provetta conica per centrifuga con tripsina 1 mL e Miscelare pipettando delicatamente su e giù.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 3,7 a 3.10 due volte. Nella fase finale, dopo un totale di 30 min di incubazione di tripsina, trasferire il surnatante e il tessuto restante dell'epicardio nella provetta contenente il mezzo EPDC.</li>
	<li>Quando tutte le celle sono raccolti in media EPDC, delicatamente passare la sospensione attraverso una siringa da 10 mL con un ago di calibro 19 in una provetta da 15 mL nuova meccanicamente dissociare le cellule (Figura 1E). Nota: Assicurarsi di omogeneizzare la sospensione pipettando su e giù prima di passare la soluzione attraverso l'ago per evitare che l'ago sempre ostruito.</li>
	<li>Per dissociare ulteriormente le cellule, ripetere il passaggio 3.12 con un ago da 21 gauge.</li>
	<li>Posizionare un colino di cella da 100 µm in cima a un tubo da 50 mL e trasferire il supporto che contiene le cellule dell'epicardio sul filtro utilizzando una pipetta di 10 mL per rimuovere tutti i restanti gruppi (Figura 1F).</li>
	<li>Lavare il filtro per raccogliere le cellule residue di pipettare 5 mL di terreno di EPDC sul filtro.</li>
	<li>Dispensare la sospensione cellulare dal tubo da 50 mL in una provetta da 15 mL. Poiché cellule depositano sul fondo della provetta, agitare delicatamente la soluzione prima di pipettaggio. Nota: Mentre questo passaggio non è necessario, un tubo più piccolo aiuta la visualizzazione del pellet dopo la centrifugazione.</li>
	<li>Centrifugare a 200 x g per 5 min a temperatura ambiente (Figura 1).</li>
	<li>Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet cellulare (Figura 1 H) nel volume richiesto di mezzo EPDC (tabella 1). Nota: Per EPDCs fetale, direttamente usare EPDC mezzo contenente 10 µM dell'inibitore della chinasi ALK5 (EPDC + SB). Le cellule adulte possono essere placcate senza SB durante il primo passaggio.</li>
	<li>Piastra di sospensione cellulare su piastre di coltura la gelatina rivestito (Figura 1I). Le dimensioni del pozzo dipende dalle dimensioni del campione del tessuto dell'epicardio (tabella 1). Nota che il confluency di bassa indurrà l'avvenimento di EMT.</li>
	<li>Posizionare le cellule nell'incubatore per almeno 48 h a 37 ° C, 5% CO2 per permettere alle cellule di fissare la piastra di coltura.</li>
</ol>4. la cultura di EPDCs
<ol><li>Ricostituire il mezzo EPDC + SB almeno ogni 3 giorni.</li>
	<li>Ispezionare le cellule almeno ogni 3 giorni con il microscopio. Quando le cellule raggiungono confluency, vale a dire, quando la piastra di coltura è completamente ricoperta di cellule, le cellule in un rapporto di superficie di 1:2 del passaggio. Si noti che arrivano fino a confluenza può prendere ~ 5-10 giorni.<ol>
<li>Aspirare il mezzo utilizzando una pipetta o un sistema di aspirazione con, per esempio, una pipetta di vetro.</li>
		<li>Lavare accuratamente le cellule aggiungendo PBS alle cellule. Delicatamente la piastra di turbinio e aspirare il PBS.</li>
		<li>Aggiungere tripsina alla piastra. Ruotare delicatamente la piastra per coprire tutte le cellule con tripsina e incubare la piastra per 1 min a 37 ° C. Nota: Utilizzare come tripsina piccolo come possibile (indicazione: 200 µ l di un 6 piastra bene)</li>
		<li>Toccare la piastra per scollegare meccanicamente le cellule dalla parte inferiore della piastra. Utilizzare il microscopio per controllare visivamente se cellule staccato. In caso contrario, incubare la piastra di coltura cellulare per un minuto in più.</li>
		<li>Aggiungere il volume richiesto di mezzo EPDC + SB alle cellule, risospendere pipettando su e giù e trasferire la sospensione cellulare per una nuova piastra di coltura di gelatina rivestito. Nota: In generale, le cellule possono essere mantenute in una morfologia di ciottoli fino al passaggio 8.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. l'induzione di EMT in EPDCs
<ol><li>Per indurre EMT, dissociare le cellule con tripsina e trasferimento alle cellule di nuova gelatina rivestito pozzi in un rapporto di superficie di 1:2 in mezzo EPDC + SB, come descritto in 4 e incubare per almeno 24 h a 37 ° C, 5% CO2.</li>
	<li>Verificare se confluenza è 50-70% e se EPDCs hanno una morfologia di ciottoli. Nota: Confluency riguarda la capacità di EPDCs di subire EMT.</li>
	<li>Aspirare il mezzo dalle cellule e lavare le cellule con attenzione con PBS (Vedi punto 4.2.1 - 4.2.2).</li>
	<li>Stimolare le cellule con 1 ng/mL TGFβ3 in mezzo EPDC e metterli in un incubatore a 37 ° C, 5% CO2 per 5 giorni. Si noti che durante la stimolazione, il supporto di EPDC contenente TGFβ3 non deve essere rifornito.</li>
	<li>Monitorare quotidianamente le cellule. Dopo 5 giorni, le cellule che hanno subito la EMT sono riconosciute da una morfologia fusiforme (Figura 2A).</li>
	<li>Cultura EPDCs fusiformi secondo il metodo designate in 4 senza aggiunta di SB o TGFβ al medium EPDC. Si noti che in generale, EPDCs fusiformi possono essere coltivate fino a passaggio 20.</li>
	<li>Convalidare l'avvenimento di EMT con macchiatura immunofluorescente usando gli anticorpi contro i marcatori mesenchymal αSMA o il Vimentin o da falloidina per rilevare la formazione di fibre di stress di F-actina (Figura 2B), o mediante qRT-PCR per geni correlati all'EMT ( ad esempio, WT1, Periostina, Col1A1, αSMA, N-caderina, MMP3, lumaca, lumaca) (Figura 2 e tabella 2).</li>
</ol>

<ol><li>Smits, A. M., Dronkers, E., Goumans, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epicardium+as+a+source+of+multipotent+adult+cardiac+progenitor+cells%3A+Their+origin%2C+role+and+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+research%22%5BJournal%5D)">The epicardium as a source of multipotent adult cardiac progenitor cells: Their origin, role and fate.</a> Pharmacological research. 127, 129-140 (2017).</li>
<li>Risebro, C. A., Vieira, J. M., Klotz, L., Riley, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+the+human+embryonic+and+foetal+epicardium+during+heart+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Characterisation of the human embryonic and foetal epicardium during heart development.</a> Development. 142 (21), 3630-3636 (2015).</li>
<li>Zhou, B., Ma, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epicardial+progenitors+contribute+to+the+cardiomyocyte+lineage+in+the+developing+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epicardial progenitors contribute to the cardiomyocyte lineage in the developing heart.</a> Nature. 454 (7200), 109-113 (2008).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Qui descriviamo un protocollo dettagliato per isolare e cultura primaria dell'epicardio cellule derivata da cuori umani adulti e fetali. Ampia caratterizzazione di queste cellule è stato precedentemente pubblicato il17. Abbiamo dimostrato che entrambi i tipi cellulari possono essere mantenuti come cellule epiteliali di ciottoli-come una volta coltivate con l'inibitore della chinasi di ALK5 SB431542. EMT è parte integrante di attivazione dell'epicardio in vivo durante sia lo sviluppo e la ...

L'epicardio, uno strato epiteliale unicellulare che buste il cuore, è di vitale importanza per lo sviluppo cardiaco e riparazione (rivisto in Smits et al. 1). inerente allo sviluppo, l'epicardio nasce dall'organo proepicardial, una piccola struttura situata alla base del cuore in via di sviluppo. Intorno giorno dello sviluppo E9.5 in mouse e post-concezione 4 settimane in umani, cellule iniziano a migrare da questa struttura di cavolfiore e coprire il miocardio in via di sviluppo2. Una volta che si forma uno strato di singola cellula epiteliale, una parte delle cellule dell'epicardio subisce epiteliale di transizione mesenchimale (EMT). Durante EMT, le cellule perdono le loro caratteristiche epiteliali, quali adesioni cellula-cellula e ottenere un fenotipo mesenchimale che dà loro la capacità di migrare nel miocardio in via di sviluppo. Le cellule derivate dell'epicardio formate (EPDCs) possono differenziarsi in diversi tipi di cellule cardiache tra cui fibroblasti, cellule muscolari lisce e potenzialmente cardiomiociti e cellule endoteliali3, anche se la differenziazione di questi ultimi due cellulari resti di popolazioni oggetto di dibattito (rivisto in Smits et al. 4). Inoltre, l'epicardio fornisce segnali paracrini istruttivo al miocardio a regolare la crescita e la vascolarizzazione5,6,7,8. Diversi studi hanno dimostrato che alterata formazione dell'epicardio conduce ai difetti inerenti allo sviluppo in muscolo cardiaco9,10, sistema vascolare11e conduzione sistema12, sottolineando l'essenziale contributo dell'epicardio per la formazione del cuore.
Anche se nel cuore adulto epicardio è presente come uno strato dormiente, esso diventa riattivato su ischemia13. Alberino-ferita di riattivazione dell'epicardio ricapitola molti dei processi descritti per sviluppo cardiaco, tra cui proliferazione ed EMT14, seppur meno efficientemente. È interessante notare che, sebbene l'esatto meccanismo completamente non è capito, il contributo dell'epicardio di riparazione può essere migliorato dal trattamento con, per esempio, Thymosin β415 o modifica mRNA di VEGF-A16, con conseguente migliorato cardiaco funzione dopo infarto miocardico. L'epicardio è quindi considerato un'interessante fonte di cellule per migliorare la riparazione endogena del cuore ferito.
Meccanismi di sviluppo cardiaco sono spesso ricapitolate durante la lesione, anche se in modo meno efficiente. In cerca di attivatori dell'epicardio, è fondamentale che possiamo determinare e confrontare l'intera capacità dell'epicardio feto ed adulto. Inoltre, da un punto di vista terapeutico, è importante che, oltre a esperimenti sugli animali, estendiamo conoscenza per quanto riguarda la risposta dell'epicardio umano. Qui, descriviamo un metodo per isolare e adulte e fetale dell'epicardio derivate cellule umane (EPDCs) in una morfologia epiteliale-cell-like della coltura e di indurre EMT. Con questo modello, ci proponiamo di esplorare e confrontare il comportamento delle cellule dell'epicardio adulto e fetale.
Il vantaggio principale di questo protocollo è l'utilizzo di materiale umano dell'epicardio, che non è stato studiato accuratamente. D'importanza, il protocollo di coltura delle cellule e isolamento descritto fornisce un singolo metodo uniforme per derivare entrambi EPDCs di cobble fetali ed adulti, consentendo un confronto diretto tra queste fonti di due cellule. Inoltre, poiché l'epicardio è isolato basato sulla sua posizione, è accertato che le cellule sono in realtà epicardially derivata17.
Mentre metodi di isolamento EPDC umani sono state stabilite in precedenza, queste si basano principalmente su protocolli di conseguenza dove pezzi di tessuto cardiaco o dell'epicardio sono piastrate su un cellulare cultura piatto18,19. Questo approccio quindi seleziona specificamente per le cellule che perdere parzialmente il loro fenotipo epiteliale al fine di migrare, e che sono più inclini a subire EMT spontanea. Nel protocollo attuale, l'epicardio è prima trasformato in una soluzione di singola cellula che permette il EPDCs isolato per preservarne lo stato epiteliale. Questo metodo fornisce quindi un modello solido in vitro per lo studio dell'epicardio EMT.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s Eagle modificato' s medium + GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>21885-025</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>31150-022</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina 0,25%</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina G sale sodico</td><td>Roth</td><td>HP48</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di streptomicina</td><td>Roth</td><td>HP66</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina 1:250 da pancreas bovino</td><td>Serva</td><td>37289</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E4884</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina da pelle suina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di coltura a 6 pozzetti</td><td>Greiner bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di coltura a 12 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di coltura a 24 pozzetti</td><td>Greiner bio-one</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>SB 431542</td><td>Tocris</td><td>1614</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Merck</td><td>102931</td><td></td></tr><tr><td>100-1000&micro; L Puntali per pipette filtrati</td><td>Corning</td><td>4809</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta da 10 ml</td><td>Greiner bio-one</td><td>607180</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta da 5 ml</td><td>Greiner bio-one</td><td>606180</td><td></td></tr><tr><td>Piatto per colture cellulari 100/20 mm</td><td>Greiner bio-one</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010056</td> O provette Eppendorf <td>fatte in casa e sterilizzate</td></tr><tr><td>1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td>0030120086</tr><tr><td>Provette da centrifuga da 15 ml</td><td>Greiner bio-one</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga da 50 ml</td><td>Siringa Greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>10 mL</td><td>Becton Dickinson</td><td>305959</td><td></td></tr><tr><td>aghi 19 gauge</td><td>Becton Dickinson</td><td>301700</td><td></td></tr><tr><td>aghi 21 gauge</td><td>Becton Dickinson</td><td>304432</td><td></td></tr><tr><td>Setacci per celle EASYstrainer, 100 & micro; m</td><td>Greiner bio-one</td><td>542000</td><td></td></tr><tr><td>TGF&beta; 3&nbsp;</td><td>R& D systems</td><td>243-B3</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonale Anti-Actina, &alfa;-Muscolo liscio</td><td>Sigma</td><td>A2547&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A31570</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Falloidina</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments </td></tr><tr><td>Pipet P1.000</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>Controller per pipette</td><td>Integra</td><td>155 015</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a luce invertita</td><td>Centrifuga Olympus</td><td>CK2</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf</td><td></td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>GFL</td><td>1083</td><td></td></tr></tbody></table>

l'isolamento e coltura di cellule primarie dell'epicardio ricavate da campioni di cuore umano adulto e fetale

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

L'epicardio, uno strato di cellule epiteliali che copre il miocardio, ha un ruolo essenziale durante sviluppo cardiaco e la risposta di riparazione del cuore dopo lesione ischemica. Quando attivato, le cellule dell'epicardio subiscono un processo noto come epiteliale di transizione mesenchimale (EMT) per fornire le cellule del miocardio. Inoltre, l'epicardio contribuisce via la secrezione di fattori paracrini essenziale. Per apprezzare appieno il potenziale rigenerativo dell'epicardio, è necessario un modello di cellula umana. Qui abbiamo delineare un modello di coltura cellulare romanzo per derivare cellule derivate dell'epicardio primarie (EPDCs) da tessuto cardiaco umano adulto e fetale. Per isolare EPDCs, l'epicardio è dissecato dall'esterno dell'esemplare cuore e trasformato in una sospensione unicellulare. Successivamente, EPDCs sono placcati e coltivate in medium EPDC contenente l'inibitore della 5-chinasi ALK SB431542 per mantenere il loro fenotipo epiteliale. EMT è indotta dalla stimolazione con TGFβ. Questo metodo consente, per la prima volta, lo studio del processo di EMT dell'epicardio umano in un ambiente controllato e agevola guadagnando più comprensione nel secretoma di EPDCs che può aiutare la rigenerazione del cuore. Inoltre, questo approccio uniforme consente un confronto diretto del comportamento umano adulto e fetale dell'epicardio.

Qui, descriviamo un protocollo semplice per isolare EPDCs da tessuto cardiaco umano adulto e fetale (Figura 1). Questo protocollo sfrutta la posizione facilmente raggiungibile dell'epicardio sulla parte esterna del cuore (Figura 1A). Macchiatura del auricle cuore dopo dissezione dimostra che l'epicardio WT1 + viene rimosso mentre il sottostante subepicardial matrice extracellulare e tessuto miocardico rimangono intatti (<strong c...

L'epicardio svolge un ruolo cruciale nello sviluppo e nella riparazione del cuore fornendo le cellule e fattori di crescita per la parete del miocardio. Qui, descriviamo un metodo alle cellule dell'epicardio primarie umane di cultura che consente lo studio e il confronto delle loro caratteristiche inerenti allo sviluppo e adulti.

L'isolamento e coltura di cellule primarie dell'epicardio ricavate da campioni di cuore umano adulto e fetale

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare e coltivare cellule umane di derivazione epicardica al fine di studiare il comportamento delle cellule epicardiche. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della ricerca cardiaca, come ad esempio come viene attivato l'epicardio durante lo sviluppo cardiaco e la malattia. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere applicata a campioni di tessuto cardiaco umano, il che può aiutare a tradurre i risultati in un contesto clinico.Il nostro protocollo descrive lo studio della transizione epiteliale a mesenchimale di cellule di derivazione epicardica. Tuttavia, può anche essere utilizzato per studiare la proliferazione o la secrezione di fattori. Per iniziare, riempire un piatto di coltura cellulare da 100 millimetri con PBS all'interno della cappa a flusso laminare.Mettere circa 200 microlitri di PBS nel coperchio, quindi aggiungere 5 millilitri di terreno EPDC preriscaldato in una provetta da 15 millilitri. Mettere il tessuto cardiaco, isolato da un cuore umano adulto, nel piatto. Sotto uno stereomicroscopio, usa una pinza per rimuovere con cura lo strato epicardico.Quindi, raccogli i pezzi di tessuto epicardico nel coperchio e usa un bisturi per tagliarli in pezzi di 0,5 millimetri cubi. Aggiungere un millilitro di tripsina ai pezzi di tessuto. Utilizzando un puntale per pipetta P1000, trasferirli in una provetta da centrifuga conica da 1,5 millilitri.Quindi, incubare la provetta per 10 minuti a 37 gradi Celsius all'interno di un bagno d'acqua con agitazione costante a 60 giri/min. Dopo l'incubazione, pulire la provetta con etanolo al 70% e lasciare che il tessuto si depositi sul fondo. Quindi, trasferire con cura il surnatante che contiene cellule epicardiche in una provetta da 15 millilitri con 5 millilitri di terreno EPDC per inattivare la tripsina.Aggiungere un millilitro di tripsina al tessuto rimanente nella provetta da centrifuga e mescolare con un pipettaggio delicato. Quindi, ripetere la fase di incubazione della tripsina altre due volte. Dopo il prelievo finale, trasferire il tessuto epicardico rimanente nella provetta contenente la sospensione cellulare.Omogeneizzare accuratamente la sospensione cellulare mediante pipettaggio delicato, quindi utilizzare una siringa da 10 millilitri con un ago calibro 19 per dissociare meccanicamente le cellule nella sospensione e trasferire la sospensione in una provetta fresca da 15 millilitri. Per dissociare ulteriormente le cellule, passare la sospensione cellulare attraverso una siringa da 10 millilitri con un ago calibro 21. Quindi, utilizzare una pipetta da 10 millilitri per trasferire la sospensione cellulare su un colino cellulare da 100 micrometri sopra una provetta da 50 millilitri.Lasciare che la sospensione passi attraverso il colino per rimuovere tutti i grumi rimanenti. Aggiungere 5 millilitri di terreno EPDC sul filtro per raccogliere le cellule residue. Dopo una breve miscelazione delicata, trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 millilitri e centrifugare a 200 g per cinque minuti a temperatura ambiente.Quindi, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in terreno EPDC. Rimuovere il mezzo di rivestimento dalla piastra gelatinicolata e aggiungere una quantità adeguata di sospensione cellulare. Incubare le cellule per almeno 48 ore a 37 gradi Celsius in CO2 al 5%.Per coltivare cellule epicardiche, reintegrare il terreno ogni tre giorni. Utilizzare il terreno EPDC integrato con 10 inibitori micromolari della ALK 5-chinasi SB431542. Utilizzare un microscopio per ispezionare le cellule durante il periodo di coltura.Al raggiungimento della confluenza, far passare le celle in un rapporto di superficie 1:2. Per far passare le cellule, utilizzare una pipetta o un aspiratore per rimuovere il terreno e aggiungere con cura PBS alle cellule. Ruotare delicatamente la piastra e aspirare il PBS.Aggiungere la tripsina e ruotare delicatamente la piastra per distribuirla sulle cellule. Incubare la piastra per un minuto a 37 gradi Celsius. Quindi, picchiettare la piastra per staccare meccanicamente le cellule e utilizzare un microscopio per confermare il distacco delle cellule.Aggiungere alla piastra il volume richiesto di terreno EPDC integrato con SB431542 da 10 micromolari. Miscelare mediante pipettaggio delicato e trasferire la sospensione in una nuova piastra ricoperta di gelatina. Per indurre l'EMT, far passare le cellule utilizzando il protocollo precedentemente descritto e incubare per almeno 24 ore a 37 gradi Celsius in CO2 al 5%.Dopo aver raggiunto il 50-70% di confluenza, aspirare il terreno e lavare le cellule con PBS. Successivamente, stimolare le cellule con un nanogrammo per millilitro di terreno EPDC integrato con TGF beta-3 e incubare per cinque giorni a 37 gradi Celsius in 5% di CO2 e monitorare le cellule quotidianamente. Dopo cinque giorni, le cellule sottoposte a EMT dovrebbero acquisire una morfologia a forma di fuso.Coltura di queste cellule utilizzando il protocollo precedentemente descritto utilizzando terreno EPDC senza alcuna integrazione. Per convalidare la corretta dissezione dello strato epicardico, il tessuto cardiaco umano adulto viene immunocolorato con anticorpi WT1 e cTnI prima e dopo la dissezione. L'assenza del marcatore epicardico WT1 dopo la dissezione indica la completa rimozione dello strato epicardico.La presenza del marcatore del tessuto miocardico cTnI indica che la matrice extracellulare subepicardica e il tessuto miocardico sono intatti dopo la dissezione. Le EPDC adulte coltivate in presenza di inibitore della ALK 5-chinasi dovrebbero mantenere la morfologia dei ciottoli. La transizione dalla morfologia dei ciottoli a una morfologia a forma di fuso delle EPDC dopo il trattamento con TGF beta-3 indica una transizione da epiteliale a mesenchimale.Per confermare ulteriormente l'EMT, le EPDC vengono immunocolorate con un marcatore mesenchimale alfa Smooth Muscle Actin prima e dopo il trattamento con TGF beta-3. La presenza di un marcatore mesenchimale nelle cellule trattate con TGF beta-3 assicura l'induzione di EMT. Qui sono rappresentati i livelli di mRNA dei geni correlati all'EMT nelle EPDC adulte.La sottoregolazione indotta dal TGF beta-3 del marcatore epicardico WT1 e la sovraregolazione dei marcatori mesenchimali MMP3, N-caderina, periostina, alfa-SMA e collagene 1A1 confermano l'induzione di EMT. Mentre si tenta questa tecnica, è importante ricordarsi di eseguirla nel modo più efficiente possibile. Un tempo di isolamento più breve migliorerà la sopravvivenza cellulare.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa 60 minuti. Poiché questo metodo si basa su cellule primarie, ogni isolamento può comportarsi in modo diverso. Pertanto, è importante monitorare la morfologia e la densità cellulare prima di iniziare un esperimento.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come gestire le cellule primarie umane di derivazione epicardica.

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

In questo protocollo, w e identificato una popolazione romanzo di cellule melanociti-simile (anche conosciuto come melanociti cardiaci) nel cuore dei topi e gli esseri umani che contribuiscono ad aritmia atriale provoca nei topi.

Isolamento di cellule melanociti-come primario dal Cuore del mouse

Coltura cellulare primaria è una tecnica utile per analizzare specifiche popolazioni di cellule, particolarmente da embrioni di topo transgenico a stadi specifici dello sviluppo. Qui, ventricoli embrionali vengono sezionati e dissociato, e perle di anticorpi coniugati riconoscere e separare le cellule endoteliali per ulteriori analisi.

Isolamento della embrionali ventricolari cellule endoteliali

Le attuali conoscenze sulla base cellulare di malattie cardiache si basa principalmente su studi su modelli animali. Qui descriviamo e validare un nuovo metodo per ottenere singoli cardiomiociti vitali da piccoli campioni chirurgici di miocardio ventricolare umana. Miociti ventricolari umani possono essere utilizzati per studi elettrofisiologici e test della droga.

Isolamento e caratterizzazione funzionale di Human ventricolare Cardiomyocytes da campioni freschi chirurgici

Qui, descriviamo i metodi per isolare le cellule epicardiche primarie di topo mediante un saggio di coltura in outgrowth e valutare la migrazione funzionale delle cellule derivate dall'epicardio (EPDC) utilizzando un sistema di coltura cardiaca ex vivo. Questi protocolli sono adatti per identificare modulatori genetici e chimici della transizione epiteliale a mesenchimale (EMT) epicardica e della motilità.

Epicardico escrescenza Cultura Assay e<em&gt; Ex Vivo</em&gt; La valutazione della migrazione delle cellule di derivazione epicardico

L'epicardio è una fonte essenziale di cellule progenitrici cardiovascolari multipotenti e di fattori paracrini necessari per lo sviluppo e la rigenerazione cardiovascolare. Descriviamo qui un metodo per coltivare cellule epicardiche embrionali di topo.

Coltura in vitro di cellule provenienti da epicardici Cuore embrionali di topo

tessuto cardiaco umano alberga popolazioni di cellule precursore perivascolari multipotenti che possono essere adatti per la rigenerazione del miocardio. La tecnica qui descritta permette l'isolamento e la purificazione simultanea di due popolazioni di cellule stromali multipotenti associati con i vasi sanguigni nativi, cioè CD146 + CD34 - periciti e CD34 + CD146 - cellule avventiziale, dal miocardio umano.

Isolamento di perivascolare Multipotent precursori delle cellule popolazioni dal cardiache umane Tissue

Sono stati sviluppati e descritti diversi protocolli per l'isolamento di diversi tipi di cellule cardiache da un cuore del topo. Qui viene descritto un protocollo ottimizzato che consente l'isolamento di tipi di cellule cardiache di elevata qualità (cardiomiociti, cellule endoteliali e fibroblasti) da una singola preparazione, riducendo i costi sperimentali.

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L'obiettivo di questo lavoro è quello di sviluppare un metodo per isolare in modo riproducibile i cardiomiociti dal cuore adulto e misurare il contenuto di DNA e la nucleazione.

Isolamento dei cardiomiociti da cuori fissi per l'immunocitochimica e l'analisi dello ploidy

Vi presentiamo un protocollo per l'isolamento delle cellule endocardiali e coronariche dai cuori dei ratti attraverso la digestione sequenziale dei tessuti in un buffer di digestione, la raccolta cellulare da cicli di centrifuga ricorrenti e la purificazione cellulare utilizzando microsfere CD31 anti-rat.

Isolamento delle cellule endocartali e coronarie dal muro libero ventricolare del cuore di ratto

Presentato è un protocollo per l'isolamento dei cardiomiociti ventricolari umani e animali da fette miocardici tagliate con vibratome. È possibile ottenere rese elevate di cellule tolleranti al calcio (fino a 200 cellule/mg) da piccole quantità di tessuto (&lt;50 mg). Il protocollo è applicabile al miocardio esposto all'ischemia fredda fino a 36 h.

Isolamento dei cardiomiociti ventricolari umani dalle fette miocardici Vibratome-Cut

Un metodo è descritto per l'isolamento simultaneo di miociti e non miociti sia dagli atri che dai ventricoli di un singolo cuore adulto di topo. Questo protocollo si traduce in rese costanti di miociti cardiaci altamente vitali e non miociti e descrive in dettaglio le condizioni ottimali di coltura specifica delle cellule per la fenotipizzazione e l'analisi in vitro.

Isolamento simultaneo e cultura di miociti atriali, miociti ventricolari e non miociti da un cuore di topo adulto

Scopri l'isolamento e la coltura di cellule primarie dell'epicardio da tessuto cardiaco umano. Questo metodo consente di studiare la transizione epitelio-mesenchimale e il comportamento cellulare per la ricerca cardiaca.

L'isolamento e coltura di cellule primarie dell'epicardio ricavate da campioni di cuore umano adulto e fetale

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