Base di un semplice flusso Cytometry Assay per determinare In Vitro dell'anticorpo dipendente valorizzazione del Virus di febbre rompiossa utilizzando siero convalescente Zika Virus

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare la capacità dei sieri raccolti dai macachi rhesus infettati dal virus Zika di mediare l'aumento anticorpale dipendente dell'infezione da virus dengue in vitro. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave relative al potenziamento anticorpale dipendente dell'infezione da dengue causato da anticorpi cross-reattivi indotti dal virus Zika. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è alta, semplice e facile da eseguire.

A dimostrare questa procedura sarà William Valiant, uno studente laureato in malattie infettive emergente, nel mio laboratorio. Iniziare scongelando i campioni di siero a temperatura ambiente. Una volta scongelato, trasferire 100 microlitri di ciascun campione di siero in una provetta sterile, scaldare e attivare per 30 minuti a 56 gradi Celsius.

Successivamente, effettuare diluizioni seriali di 10 volte del campione di siero che vanno da uno a uno a uno, a uno-mille in RPMI 10 freddo. Quindi trasferire 10 microlitri di ciascun campione di siero diluito nei pozzetti di una piastra sterile con fondo a V a 96 pozzetti. Successivamente, scongelare le particelle virali di dengue una, due, tre e quattro particelle virali proporzionate in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius, garantendo un volume di circa 170 microlitri di ciascun RVP per campione di siero.

Una volta scongelati, trasferire immediatamente i tubi di RVP nel ghiaccio. Quindi pipettare 10 microlitri di RVP nei pozzetti contenenti le diluizioni del campione di siero nei pozzetti di controllo senza siero. Miscelare accuratamente pipettando su e giù da cinque a dieci volte.

Trasferire la piastra con fondo a V a 96 pozzetti in un incubatore e incubare per un'ora a 37 gradi Celsius, in presenza del 5% di anidride carbonica. Mentre la piastra con fondo a V a 96 pozzetti è in incubazione, pulire la superficie della cappa di biosicurezza con etanolo al 70% e far funzionare la luce UV per 15 minuti. Quindi rimuovere un pallone T-75 completamente confluente di cellule K562 dall'incubatore.

Mescolare bene le cellule utilizzando una pipetta sterile da cinque millimetri e trasferire cinque millilitri in una provetta conica sterile da 15 millilitri. Quindi, rimuovere 10 microlitri di cellule dalla provetta, mescolare con 10 microlitri di blu di tripano e caricare in un emocitometro. Conta le celle e calcola il numero totale di celle.

Dopo aver centrifugato le cellule a 12 cento volte G per 10 minuti, decantare il surnatante e risospendere le cellule in RPMI 10 caldo a una concentrazione di 80 mila cellule per 30 microlitri di terreno. Dopo aver rimosso la piastra con fondo a V a 96 pozzetti dall'incubatore, trasferire 30 microlitri di cellule K562 su ciascuna parete della piastra con fondo a V a 96 pozzetti. E mescolate accuratamente pipettando su e giù da cinque a dieci volte.

Quindi rimettere la piastra nell'incubatrice per un'ora. Dopo l'incubazione, centrifugare la piastra a 12 volte G per cinque minuti. Dopo la centrifugazione, decantare il terreno dai pozzetti capovolgendo la piastra in un contenitore contenente il 10% di candeggina.

Quindi lavare le celle in ogni parete rimettendole in 125 microlitri di RPMI 10 caldo e centrifugando come prima. Dopo aver travasato l'ultimo lavaggio, aggiungere 100 microlitri di RPMI 10 caldo in ogni pozzetto. Mescolare su e giù con la pipetta e incubare la piastra per 48 ore a 37 gradi Celsius in presenza del 5% di anidride carbonica.

Due giorni dopo, rimuovere la piastra dall'incubatrice e trasferirla in una cappa di biosicurezza. Utilizzando una pipetta multicanale, miscelare il contenuto di ciascun pozzetto e trasferire su una piastra con fondo a U a 96 pozzetti. Sciacquare ogni pozzetto della piastra con fondo a V a 96 pozzetti con 100 microlitri di paraformaldeide all'1% e PBS e trasferire le cellule rimanenti e il PBS nei rispettivi pozzetti nella piastra con fondo a U a 96 pozzetti.

Miscelare accuratamente utilizzando una pipetta multicanale. Copri la piastra con un foglio di alluminio e lasciala riposare nell'incubatrice per 30 minuti per fissare le cellule. Preparare il citometro a flusso facendo scorrere le cellule K562 non colorate per calibrare le impostazioni di dispersione laterale e diretta utilizzando il canale etil-one per la florescenza GFP.

Quindi acquisire da 30 mila a 50 mila cellule da ogni campione. Utilizzando il software di analisi della citometria a flusso, è possibile impostare il primo gate in base all'area di diffusione diretta rispetto all'altezza di diffusione in avanti per includere singole cellule ed escludere i dublet autofluorescenti dall'analisi. Calcolare la percentuale media di cellule GFP positive per ciascuna condizione e quindi calcolare l'aumento della piega dell'infezione per ogni diluizione del siero.

Miglioramento della piegatura del grafico sull'asse y rispetto alla diluizione sull'asse x ed esecuzione di analisi statistiche utilizzando ANOVA seguita dal test post-hoc di Tukey per confronti multipli. Qui sono mostrati i dati di un animale rappresentativo che utilizza il virus della dengue e le particelle virali reporter. La percentuale di cellule GFP positive per il campione di controllo senza siero è stata dello 0,253%Il campione di siero non diluito è stato del 2,58% GFP positivo.

La percentuale di cellule GFP positive ha raggiunto un massimo del 12,8% con una diluizione sierica da uno a dieci, seguito da 0,735% con una diluizione da uno a cento e 0,022% con una diluizione da uno a mille. L'enhancement anticorp-dipendente dell'infezione da dengue è stato esaminato per i quattro tipi di sieri del virus della dengue. I dati mostrano che il siero raccolto 16 settimane dopo l'infezione ha aumentato significativamente l'infezione delle cellule K562 da parte di tutti i tipi di sieri del virus dengue con una diluizione da uno a dieci.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 48 ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di acquisire i dati entro una o due ore dal completamento della fase finale di fissazione di 30 minuti. Non dimenticare che lavorare con il siero infetto può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario adottare sempre precauzioni come DPI e pratiche di livello BSL2.