High Throughput Screening SiRNA per lesione delle cellule epiteliali cloropicrina e Cornea indotta da acido fluoridrico

Questo video mostra i nostri metodi per lo screening di siRNA ad alto rendimento in un modello di cellule epiteliali corneali di danno tossico. Questo lavoro è importante, perché lo screening dei siRNA ad alto rendimento è un metodo efficiente in termini di costi e di tempo per chiarire i percorsi e i regolatori della risposta cellulare alle sostanze tossiche. Questo lavoro può aiutare a comprendere meglio come la cornea risponde agli insulti tossici.

Preparare una sospensione di cellule epiteliali corneali in terreno preriscaldato contenente 0,5 microgrammi per millilitro di idrocortisone in un flacone di terreno monouso. Agitare la bottiglia per sospendere uniformemente le cellule e versarla in un serbatoio sul nido dell'agitatore orbitale di un manipolatore di liquidi automatizzato. Mantenere la sospensione cellulare su una piastra riscaldante a 37 gradi durante il processo di placcatura delle celle.

Utilizzare un gestore di liquidi automatizzato per aggiungere celle alle piastre a una densità di mille celle per pozzetto in 70 microlitri di terreno per pozzetto su una piastra da 96 pozzetti. Seminare un minimo di 14 piastre da 96 pozzetti con cellule per ogni piastra della libreria di siRNA da studiare. Far funzionare l'agitatore orbitale a 100 cicli al minuto costantemente durante il processo di semina e utilizzare una velocità di pipettaggio di 50 microlitri al secondo per tutte le fasi.

Miscelare la sospensione cellulare utilizzando il manipolatore automatico di liquidi prima di seminare la prima piastra. Aspirare 140 microlitri di sospensione cellulare ed erogare 70 microlitri in ciascun pozzetto di due piastre di coltura cellulare. Ripetere la miscelazione e l'erogazione fino a quando tutte le piastre non sono state seminate con le cellule.

Riempire il serbatoio della sospensione della cella secondo necessità. Dopo che le piastre sono state seminate, rimuoverle dal manipolatore di liquidi e incubarle per 30 minuti a temperatura ambiente. Quindi, trasferiscili in un incubatore per colture cellulari.

Valutare la densità cellulare di tutte le piastre la mattina seguente utilizzando un sistema di imaging automatizzato, alloggiato nell'incubatore per colture cellulari. Escludere dallo studio le placche che hanno pozzetti interni che non sono tra il 15% e il 22% confluenti. Trasfettare le cellule 24 ore dopo la semina con quattro picomoli per pozzetto di siRNA e 0,3 microlitri per pozzetto di reagente di trasfezione, come segue.

Acquisisci le piastre della libreria siRNA dal fornitore, configurate per contenere 80 bersagli di siRNA per piastra con le colonne uno e dodici lasciate vuote. Ricostituire la piastra della libreria siRNA con tampone siRNA secondo le istruzioni del produttore a una concentrazione finale di due picomoli per microlitro per ciascun pozzetto di siRNA. Eseguite tutte le trasfezioni utilizzando un manipolatore automatico di liquidi e una velocità di pipettaggio di 25 microlitri al secondo per tutte le fasi.

Utilizzare scatole di puntali preconfigurate per indirizzare solo i pozzetti che verranno trasfettati. Utilizzare la metà superiore della piastra della libreria per trasfettare una serie di sei piastre replicate, denominata set di piastre superiori"Utilizzare la metà inferiore della piastra della libreria per trasfettare un diverso set di sei piastre di replica, denominato set di piastre inferiori"Insieme, le dodici piastre costituiscono un set completo di piastre, e ogni piastra cellulare contiene lo stesso set di controlli. Trasfettare i pozzetti da B2 a B6 di tutte le piastre con siRNA del pool negativo dopo che tutti i set di piastre superiore e inferiore sono stati trasfettati con siRNA della libreria.

Trasfettano anche i pozzetti da B2 a B6 di altre due piastre che non ricevono siRNA di libreria con siRNA del pool negativo. Questi serviranno come controlli non esposti. Incubare tutte le piastre cellulari in un incubatore per colture cellulari per quattro ore dopo l'aggiunta delle miscele di trasfezione e mescolare picchiettando delicatamente ogni ora.

Utilizzare un manipolatore di liquidi automatizzato per lavare le piastre due volte con terreno preriscaldato, diluito da uno a cinque in PBS e alimentato nuovamente con 100 microlitri per mezzo preriscaldato. Utilizzare una velocità di pipettaggio di 50 microlitri al secondo per tutte le fasi. Utilizzare i pozzetti da C2 a C6 come controlli non trasfettati.

Mantenere i pozzetti da B7 a B11 e da C7 a C11 non trasfettati, da utilizzare come controlli di farmaci e veicoli per l'esposizione a sostanze tossiche. 24 ore dopo la trasfezione, utilizzare un manipolatore automatico di liquidi per alimentare nuovamente le piastre. Utilizzare una velocità di pipettaggio di 50 microlitri al secondo per tutte le fasi.

Aspirare 100 microlitri da ogni pozzetto e gettarli in un serbatoio di scarico. Rialimentare ogni pozzetto con 100 microlitri per pozzetto H-Cort.medium preriscaldato. Svuotare il serbatoio dei rifiuti secondo necessità.

Riempire il serbatoio con fluido secondo necessità. Due giorni dopo la trasfezione e due ore prima dell'esposizione, preparare una soluzione 62,5 micromolare del controllo positivo Cardamonina in H-Cort. e aggiungere alla riga B del serbatoio di diluizione a 8 file.

Preparare una soluzione allo 06,25% di DMSO in H-Cort. meduim e aggiungerla alla riga C dello stesso serbatoio. Il DMSO viene utilizzato come controllo del veicolo.

Utilizzare il manipolatore automatico di liquidi per rimuovere 10 microlitri di terreno dai pozzetti da B7 a B11 e da C7 a C11 di ciascuna piastra cellulare e scartarlo nelle file G e H del serbatoio. Assicurarsi di utilizzare scatole di puntali preconfigurate per indirizzare solo i pozzetti che riceveranno i controlli positivi e del veicolo e utilizzare una velocità di pipettaggio di 50 microlitri al secondo per tutte le fasi. Trasferire 10 microlitri di positivo e di controllo del veicolo in quei pozzetti e mescolare tre volte.

Rimetti queste piastre cellulari nell'incubatore. Ripetere questi passaggi per tutte le piastre cellulari aggiuntive. Eseguire tutte le operazioni di esposizione chimica in una cappa chimica, indossando doppi guanti in nitrile, un camice da laboratorio, protezioni monouso in polietilene e occhiali di sicurezza.

Decontaminare i puntali delle pipette e i serbatoi che sono entrati in contatto con l'acido fluoridrico e qualsiasi acido fluoridrico liquido con gluconato di calcio al 2,5% prima dello smaltimento nel flusso dei rifiuti pericolosi. Per ogni piastra della libreria in esame, preparare una soluzione di acido fluoridrico allo 0,0036% aggiungendo 288 microlitri di acido fluoridrico all'uno per cento a 80 millilitri di H-Cort preriscaldato. medio in una bottiglia da 150 millilitri.

Agitare la bottiglia e incubare l'acido fluoridrico diluito in un'incubatrice a 37 gradi nella cappa chimica per dieci minuti. Aggiungere la soluzione di terreno di acido fluoridrico in un serbatoio di reagenti su uno scaldapiatti. Eseguire l'esposizione con due tecnici che lavorano in tandem.

Chiedere al tecnico a destra di rimuovere il terreno di coltura cellulare dalla piastra cellulare utilizzando un pipettatore a dodici canali, quindi passare la piastra al tecnico a sinistra. Chiedere al tecnico a sinistra di aggiungere 100 microlitri per pozzetto della soluzione di acido fluoridrico. Ripetere questo processo per tutte le piastre cellulari che devono essere esposte a sostanze tossiche.

Inoltre, ripetere questo processo per le piastre di controllo non esposte, utilizzando un terreno fresco invece della soluzione di acido fluoridrico. Posizionare le piastre in un incubatore con cappa chimica per 20 minuti, quindi rimetterle nell'incubatore per colture cellulari. Ripetere la fase di aggiunta del controllo positivo come mostrato in precedenza, una volta che tutte le piastre sono state esposte e rimesse nell'incubatore per colture cellulari.

Raccogliere il surnatante della coltura cellulare e valutare la vitalità cellulare utilizzando un test MTT 24 ore dopo l'esposizione. Preparare una soluzione di 0,5 milligrammi per millilitro di substrato MTT in PBS contenente 10 grammi per litro di glucosio e scaldare a 37 gradi. Aggiungere la soluzione di substrato MTT a un serbatoio su un movimentatore di liquidi automatizzato.

Utilizzare una velocità di pipettaggio di 50 microlitri al secondo per tutte le fasi. Preconfigura le scatole dei puntali per indirizzare solo i pozzetti da analizzare. Utilizzare il manipolatore automatico di liquidi per aspirare 95 microlitri di terreno dai 60 pozzetti interni della piastra cellulare e depositare 42,5 microlitri in ciascuna delle due piastre di conservazione da 384 pozzetti.

Aggiungere immediatamente 100 microlitri per pozzetto della soluzione di substrato MTT alle piastre cellulari e incubarle a 37 gradi in un incubatore per colture cellulari per un'ora. Sigillare le piastre di conservazione a 384 pozzetti e conservarle a meno 80 per le analisi successive. Ripetere questa procedura per tutti i set di piastre superiore e inferiore e per i relativi controlli non esposti.

Riempire il serbatoio del substrato MTT secondo necessità. Se lo si desidera, riutilizzare le punte tra le repliche, ma lavarle quando si aggiunge la soluzione di substrato MTT e quando si passa da un set di piastre all'altro. Dopo un'ora di incubazione, utilizzare il gestore automatico di liquidi per rimuovere la soluzione del substrato MTT dai 60 pozzetti interni di ciascuna piastra di coltura cellulare e sostituirla con 100 microlitri per pozzetto di DMSO.

Utilizzare una velocità di pipettaggio di 50 microlitri al secondo per tutte le fasi e preconfigurare le scatole dei puntali in modo che si indirizzino solo ai pozzetti da analizzare. Svuotare il serbatoio dei rifiuti e riempire il serbatoio del DMSO secondo necessità. Agitare le piastre su uno shaker per tre minuti.

Misurare l'assorbanza a 570 e 690 nanometri, utilizzando uno spettrofotometro a piastre. Sottrarre l'assorbanza di fondo a 690 nanometri dall'assorbanza a 570 nanometri e fare la media dei valori per ciascun gruppo di controllo sulla piastra non esposta. Calcolare la percentuale di vitalità dividendo i valori di assorbanza per ciascun bersaglio per il valore medio di assorbanza dei controlli non esposti.

Utilizzare il pool negativo medio non esposto per calcolare la percentuale di vitalità delle celle per tutti i target. Misurare la concentrazione di IL-8 nei surnatanti di coltura cellulare utilizzando un test basato su microsfere no-wash, secondo le istruzioni del produttore. È possibile creare un layout della piastra di analisi per adattarsi a campioni e standard.

Rimuovere le piastre di conservazione a 384 pozzetti dal congelatore a meno 80 e scongelarle a temperatura ambiente. Centrifugare brevemente le piastre per raccogliere il campione sul fondo dei pozzetti. Aggiungere le perle accettori anti-IL-8 e l'anticorpo biotinilato a una piastra di conservazione nera a 384 pozzetti.

Aggiungere la miscela di anticorpi a perlina nei pozzetti designati per l'uso per i campioni e la curva standard, secondo la disposizione della piastra del saggio. Ricostituire lo standard in un terreno contenente 354 micromolari di cloruro di sodio. Effettuare due diluizioni seriali della curva standard e aggiungere in triplicato a una diversa piastra di conservazione nera a 384 pozzetti.

Utilizzare un manipolatore di liquidi automatizzato per eseguire il saggio. Utilizzare scatole di puntali preconfigurate per indirizzare i pozzetti in base al layout della piastra del saggio. Utilizzare una velocità di pipettaggio di 50 microlitri al secondo per tutte le fasi.

Trasferire 8 microlitri della miscela di anticorpi della perlina accettrice su piastre di saggiatura bianche a 384 pozzetti poco profondi. Aggiungere la miscela di anticorpi a perline nei pozzetti designati per l'uso per i campioni e la curva standard in base al layout della piastra del saggio. Quindi, trasferire la curva standard nei pozzetti appropriati sulle piastre di saggio per pozzetti poco profondi.

Quindi, preparare una soluzione di cloruro di sodio a 3,54 molari in un serbatoio poco profondo. Regolare la concentrazione salina dei campioni in modo che corrisponda a quella della curva standard trasferendo 4,5 microlitri della soluzione di cloruro di sodio ai campioni nelle piastre di conservazione nere a 384 pozzetti. Mescolare i campioni tre volte utilizzando un volume di miscela di 30 microlitri, quindi trasferire due microlitri di campioni nelle piastre di saggio bianche a pozzetti poco profondi secondo il layout della piastra di analisi.

Incubare per un'ora al buio a temperatura ambiente. Aggiungere le perle secondarie a una piastra di conservazione nera a 384 pozzetti. Aggiungere le perle ai pozzetti designati per l'uso per i campioni e la curva standard in base al layout della piastra del saggio.

Trasferire 10 microlitri di perle secondarie nei pozzetti della piastra bianca a 384 pozzetti per pozzetti poco profondi che riceverà la curva standard o i campioni in base al layout della piastra del saggio. Lavare le punte tra ogni piatto. Incubare per un'altra ora al buio a temperatura ambiente.

Sigillare le piastre di analisi con sigilli trasparenti ed eseguire la scansione utilizzando un lettore di piastre compatibile con il test basato su microsfere. Utilizzare una distanza di 0,2 millimetri tra la lastra e il rivelatore, un tempo di eccitazione di 180 millisecondi per la scansione e un tempo di misurazione di 550 millisecondi. Importa i dati grezzi dai dosaggi IL-8 in un foglio di calcolo.

Utilizzare l'adattamento automatico della curva per la curva standard dei saggi IL-8, quindi convertire i dati grezzi in picogrammi per millilitro per ciascun campione. Calcola la media delle sei repliche per ogni target. Quindi, calcolare i valori SSMD e la variazione di riduzione rispetto ai controlli negativi esposti.

Visualizza i dati in un grafico a doppia torcia, che mostra la variazione di piega lungo l'asse x e SSMD lungo l'asse y, per ogni target. In conclusione, abbiamo sviluppato metodi e condizioni di coltura adatti per lo studio di screening ad alto rendimento del danno oculare da sostanze tossiche. Abbiamo dimostrato l'utilità di questi metodi completando lo screening primario di una libreria di siRNA in un modello di danno da acido fluoridrico.

I set di dati genomici ad alto rendimento possono contribuire notevolmente alla comprensione del ruolo svolto da geni specifici in lesioni o malattie, il che può aiutare a concentrare in modo più efficiente gli studi di follow-on in vitro o in vivo.