Rilevamento ad alta sensibilità dei Micrometastases generati da GFP trasdotte Lentivirus Organoids coltivate da un tumore del Colon paziente-derivato

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia dei tumori sulle micrometastasi riscontrate nei pazienti con cancro del colon. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente il rilevamento altamente sensibile di micrometastasi indotte da organoidi di cancro del colon marcati con GFP e derivati da pazienti nei topi. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché può essere difficile rilevare micrometastasi derivate da organoidi tumorali del colon in organi distanti nei topi.

A dimostrare la procedura con Yu Okazawa saranno Kosuke Mizukoshi e Yu Koyama, entrambi studenti di dottorato e chirurghi del mio gruppo. Per generare organoidi di cellule tumorali del colon-retto umano, aggiungere prima 150 microlitri di matrice extracellulare artificiale per pozzetto a una piastra a 12 pozzetti su ghiaccio. Quando tutti i pozzetti sono stati rivestiti, incubare la piastra per 30-60 minuti in un incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di CO2 per solidificare i gel.

Successivamente, risospendere un pellet di cellule di xenotrapianto tumorale derivato da un paziente in un terreno di coltura di organoidi di cancro colorettale fresco integrato con siero di vitello fetale al 5%, o FCS, per ottenere una concentrazione da tre volte 10 a cinque cellule per millilitro e seminare un millilitro di cellule su ciascuna matrice extracellulare artificiale. Quindi, rimettere le cellule nell'incubatore per colture cellulari. La mattina successiva, trasferire con cura i surnatanti di coltura, comprese le cellule galleggianti, in provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri per la loro centrifugazione e risospendere i pellet in 70 microlitri di matrice extracellulare artificiale fresca su ghiaccio.

Per aumentare la vitalità delle cellule tumorali del colon-retto, sovrapporre la cellula tumorale galleggiante contenente matrice extracellulare artificiale sui pozzetti rivestiti di matrice extracellulare artificiale e incubare le colture di cellule tumorali per 30 minuti nell'incubatore per colture cellulari. Quando il nuovo gel della matrice extracellulare si è solidificato, alimentare le colture con un millilitro di terreno di coltura cellulare organoide del cancro del colon-retto fresco integrato con l'1% di FCS e rimettere le cellule nell'incubatore di coltura cellulare. Dopo sette-10 giorni di coltura, staccare meccanicamente gli organoidi con un raschietto cellulare sterile e trasferire gli organoidi in provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri per la loro centrifugazione.

Quindi, risospendere i pellet in 500 microlitri di PBS picchiettando delicatamente per un'altra centrifugazione. Per dissociare gli organoidi del cancro del colon-retto, aggiungere 500 microlitri di soluzione enzimatica proteolitica e collagenolitica alle provette e mescolare picchiettando delicatamente. Dopo 10 minuti a temperatura ambiente, aggiungere 500 microlitri di terreno integrato con l'1% di FBS alle cellule e pipettare molto delicatamente la sospensione cellulare più volte per rompere gli organoidi.

Il pipettaggio delicato di organoidi di CRC umano durante la lavorazione è fondamentale per mantenere intatta la formazione di sferoidi in coltura. Centrifugare nuovamente le cellule e risospendere i pellet in 100 microlitri di stock di lentivirus 5X GFP e 400 microlitri di terreno di coltura di organoidi per il cancro del colon-retto fresco. È essenziale infettare gli organoidi umani di CRC con un alto titolo di lentivirus GFP, in particolare per ottenere un'infezione di CRC quasi del 100%.

Regolare il volume in ciascuna provetta per ottenere una cinque volte 10 a cinque cellule tumorali dissociate per 500 microlitri di media concentrazione e posizionare 500 microlitri di cellule in ciascun pozzetto di una piastra a 12 pozzetti rivestita di matrice extracellulare artificiale, come dimostrato. Dopo 18 ore nell'incubatore per colture cellulari, trasferire i surnatanti galleggianti contenenti cellule in singole provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri per la centrifugazione, seguite dalla risospensione dei pellet in 70 microlitri di matrice extracellulare artificiale per provetta su ghiaccio. Per migliorare la vitalità delle cellule tumorali del colon-retto, sovrapporre la matrice extracellulare artificiale contenente cellule tumorali sugli organoidi tumorali nella piastra a 12 pozzetti e posizionare la piastra nell'incubatore di coltura cellulare per 30 minuti.

Quando il rivestimento della matrice extracellulare artificiale si è solidificato, alimentare le colture con un millilitro di terreno di coltura di organoidi di CRC fresco integrato con l'1% di FCS e rimettere le cellule nell'incubatore di coltura cellulare per tre giorni. Quindi, osservare le cellule infette mediante microscopia a fluorescenza per confermare una positività alla GFP quasi del 100% e riportare le cellule nell'incubatore per altri quattro o sei giorni. Per stabilire un modello murino di metastasi spontanee di xenotrapianti tumorali derivati da pazienti con CRC, dissociare gli organoidi marcati con GFP come dimostrato e diluire le sospensioni di singole cellule tumorali a cinque volte 10 per 50 microlitri di PBS integrati con una concentrazione di matrice extracellulare artificiale del 50%.

Caricare 50 microlitri di cellule per topo in una siringa dotata di ago calibro 22 e posizionare le cellule tumorali sul ghiaccio. Successivamente, confermare la mancanza di risposta al pizzicamento delle dita dei piedi e posizionare il primo topo NOG anestetizzato in posizione supina sul banco del laboratorio. Usando una pinzetta sterile, estrarre delicatamente la mucosa rettale dall'ano e iniettare immediatamente le cellule tumorali nella sottomucosa rettale.

Per stabilire un modello sperimentale di metastasi di xenotrapianti tumorali derivati da pazienti con CRC, diluire le sospensioni di singole cellule tumorali a una concentrazione di quattro volte 10 su quattro per 50 microlitri e caricare 50 microlitri di cellule per topo in una siringa dotata di un ago calibro 22. Posizionare il primo topo NOG anestetizzato in posizione prona sulla panca e praticare una piccola incisione nella regione inferiore del fianco sinistro. Usa forbici e pinzette sterili per tagliare con cura il peritoneo ed esporre la milza, e usa le pinzette per afferrare il grasso attaccato alla milza.

Quindi, iniettare lentamente 50 microlitri della sospensione di cellule tumorali nella milza, facendo attenzione che non si osservino perdite. Dopo che tutti i topi sono stati iniettati e suturati secondo necessità, riportare gli animali nelle loro gabbie domestiche e verificare la perdita e la vitalità della sutura un giorno dopo la consegna delle cellule tumorali. Utilizzare calibri per misurare i tumori settimanalmente, raccogliendo i tumori primari e i tessuti rilevanti fino agli endpoint sperimentali appropriati.

Trasferire i tumori e gli organi sezionati in cinque millilitri di PBS ghiacciato in una capsula di Petri di 10 centimetri su ghiaccio e osservare i tessuti sezionati al microscopio a stereofluorescenza per valutare la loro espressione di GFP. L'infezione da organoidi CRC con lentivirus GFP, come dimostrato, provoca quasi tutti gli organoidi che esprimono GFP molto brillante. L'iniezione ortotopica e intrasplenica di organoidi marcati con GFP in topi NOG riceventi secondari rivela la formazione di tumori primari GFP-positivi nel sito ortotopico, così come nei polmoni della maggior parte dei topi esaminati a 2,5 mesi dopo l'iniezione.

Inoltre, le metastasi epatiche sono state osservate negli animali NOG riceventi un mese dopo l'iniezione intrasplenica. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come rilevare le micrometastasi degli organoidi delle cellule tumorali del colon-retto umane marcate con GFP dopo la loro introduzione nei topi riceventi. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che l'efficienza di homing del tumore e delle metastasi degli organoidi delle cellule tumorali del colon umano nei topi dipende in gran parte dalla variabilità interpaziente delle cellule tumorali originali.