Name: Misura del consumo di ossigeno mitocondriale nelle fibre Permeabilized di Drosophila utilizzando la minima quantità di tessuto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 55 s
Description: Scopri la misura del consumo di ossigeno mitocondriale in fibre permeabilizzate di Drosophila utilizzando respirometria ad alta risoluzione. Questo metodo richiede minime quantità di tessuto e fornisce risultati fisiologicamente rilevanti per studi metabolici.

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Questo studio è stato finanziato da sovvenzioni dalla Nazionale Scienze e ingegneria Research Council (NSERC, scoperta grant) e Université de Moncton NP. LHB desidera ringraziare i finanziamenti a sostegno dell'Istituto canadese della Université de Moncton, Nuovo Brunswick Innovation Foundation (NBIF) e Health Research (CIHR). Il lavoro di EHC è supportato dall'Alzheimer Society of Canada, Canada di cervello, NSERC, Canadian Breast Cancer Foundation, New Brunswick Innovation Foundation, New Brunswick Health Research Foundation e Université de Moncton.

1. reagenti preparazione
<ol><li>Preparare le seguenti soluzioni per la dissezione e la permeabilizzazione del tessuto.<ol>
<li>Preparare la soluzione di conservazione: 2,77 CaK2EGTA, 7,23 mM K2EGTA, 5,77 mM Na2ATP, 6,56 mM MgCl2, 20mm della taurina, 15mm fosfocreatina di Na2, imidazolo di 20 mM, 0.5 mM dithiothreitol e 50 mM K-MES, pH 7.1 (possono essere memorizzati a-20 ° C).</li>
		<li>Preparare la soluzione di saponina: 5 mg di saponina in 1 mL di soluzione di conservazione (preparare freschi ogni giorno).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare le seguenti soluzioni per la misurazione della respirazione.<ol>
<li>Preparare il supporto di respirazione: 120 mM KCl, 5mm KH2PO4, 3 mM HEPES, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2e 0,2% di BSA (w/v), pH 7,2.</li>
		<li>Preparare i substrati, disaccoppiatore, inibitori. Sciogliere tutti i substrati in H2O e sciogliere il disaccoppiante FCCP, come pure gli inibitori in etanolo assoluto (tranne malonato che è diluito in H2O). Neutralizzare la maggior parte dei substrati le malonato (Vedi Tabella materiali). Tutte le concentrazioni, espresso nel protocollo sono concentrazioni finali all'interno di camere di 2 mL.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparazione e taratura del respirometro ad alta risoluzione.
<ol><li>Lavare il chambers, cappucci e tappi di respirometro tre volte con etanolo al 70% e tre volte con acqua distillata.</li>
	<li>Calibrare in concentrazione zero ossigeno: dispensare 2,3 mL di terreno di respirazione negli alloggiamenti e aggiungere 10 mg di sodio ditionito. Sebbene il volume massima della camera è di 2 mL, 2,3 mL vengono aggiunti per assicurare che nessuna bolla di aria rimane sotto il tappo durante la chiusura delle camere. Chiudere gli alloggiamenti con i tappi e misurare la concentrazione di ossigeno per un minimo di 10-20 Calibra gli elettrodi a concentrazione zero dell'ossigeno con il risultante tasso di consumo di ossigeno.</li>
	<li>Lavare gli alloggiamenti con acqua distillata, Incubare in etanolo assoluto per 10 minuti e poi sciacquare con acqua distillata.</li>
	<li>Calibrare in saturazione dell'aria: dispensare 2,3 mL di mezzo di respirazione negli alloggiamenti, di inserire i tappi, aspirare l'eccesso del prodotto sopra i tappi e poi sollevare i tappi con il distanziatore. Mezzo di respirazione in eccesso è dispensato negli alloggiamenti (volume di 2 mL in totale) per evitare la presenza di bolle d'aria dopo la chiusura delle camere.</li>
	<li>Monitorare il consumo di ossigeno per 45 minuti a un'ora, fino a quando la concentrazione di ossigeno (traccia blu) è stabile intorno a 250 nM a 24 ° C.</li>
</ol>3. dissezione di mosche e permeabilizzazione del tessuto
<ol><li>Assicurarsi che tutti i passaggi vengono eseguiti sul ghiaccio.</li>
	<li>Anestetizzare sei mosche maschi dello stesso ceppo, stessa età e ha sollevato la stessa dieta sul ghiaccio per facilitare la dissezione delle mosche (selvaggio-tipo w1118, 15 giorni di età, alimentati sul mezzo di farina di mais).</li>
	<li>Usando un bisturi e pinze a punta fine, sezionare le mosche (togliere le teste e addomi) per mantenere solo toraci contenente i muscoli di volo. Questo passaggio può essere fatto con l'occhio nudo. Gestire i toraci risultante con una pinza appuntita.</li>
	<li>Trasferire tre toraci dissecati in una capsula di Petri contenente 2 mL di soluzione di conservazione ghiacciata usando il forcipe di 25 mm.</li>
	<li>Con le pinze a punta fine, meccanicamente permeabilize toraci inserendo la punta della pinza toraci e ripetutamente lacerare il tessuto per ottenere una rete vagamente connessa.</li>
	<li>In una piastra a 24 pozzetti, riempire due pozzi con 12,5 µ l della soluzione di saponina e 1 mL di soluzione di conservazione per ottenere una concentrazione finale di 62,5 µ g/mL di saponina. Riempire i due pozzetti adiacenti con 1 mL di mezzo di respirazione.</li>
	<li>Con le pinze a punta fine, trasferire tre toraci permeabilized nella soluzione diluita saponina e incubare con lieve agitazione su un agitatore orbitale, il ghiaccio, per 20 min.</li>
	<li>Dopo l'incubazione di quest'ultima, è possibile trasferire le fibre nei pozzetti adiacenti riempiti con il mezzo di respirazione con lieve agitazione, sul ghiaccio, per 5 min lavare via la saponina.</li>
</ol>4. la determinazione del peso secco
<ol><li>Asciugare i toraci permeabilized su una superficie assorbente e flip 3 - 4 volte utilizzando le pinze a punta fine per assicurarsi che tutta l'umidità viene rimosso.</li>
	<li>Pesare i tre toraci insieme su una microbilancia. Si noti il peso ottenuto come verrà utilizzato per normalizzare i tassi di consumo di ossigeno mitocondriale.</li>
	<li>Trasferire i tessuti immediatamente in una goccia di mezzo di respirazione sul ghiaccio.</li>
</ol>5. ossigeno consumo tariffe determinazione
<ol><li>Aprire gli alloggiamenti del respirometro (rimuovere i tappi) e aggiungere 10 mM di piruvato e 2 mM di malate in ogni camera.</li>
	<li>Aggiungere i tessuti permeabilized direttamente nelle cavità riempita con il mezzo di respirazione.</li>
	<li>Sostituire i tappi utilizzando il distanziale.</li>
	<li>Con una siringa da 60 mL, raccogliere ossigeno direttamente da una bombola di ossigeno e iniettare 2-5 mL di ossigeno attraverso il capillare di tappo di ogni camera per assicurarsi che la diffusione dell'ossigeno attraverso il tessuto non limiterà il consumo di ossigeno.</li>
	<li>Inserire una siringa Hamilton il capillare di ogni tappo per assicurarsi che toraci rimangono nella camera.</li>
	<li>Chiudere completamente le camere quando la concentrazione di ossigeno è circa 400 nM, raggiungendo livelli di ossigeno sopra saturazione dell'aria (circa 160% saturazione dell'aria) all'interno delle camere.</li>
	<li>Arrestare e riavviare gli agitatori per controllare le bolle d'aria nelle camere.</li>
	<li>Immettere la massa di tessuto precedentemente pesato per normalizzare i tassi di respirazione di massa di tessuto (mg), visualizzazione consumo di ossigeno del Massachussets-specifico (pmol O2 consumed.s-1. mg-1 del tessuto).</li>
	<li>Una volta che il consumo di ossigeno è stabilizzato (traccia rossa), aggiungere 5 mM ADP con una siringa di Hamilton.</li>
	<li>Dopo ogni iniezione, sciacquare le siringhe con acqua distillata, etanolo al 70% e nuovamente di acqua distillata.</li>
	<li>Una volta che il consumo di ossigeno è di nuovo stabile, iniettare 5 µ l di una 4 mM del citocromo c.</li>
	<li>Procedere alle iniezioni sequenziale dei substrati seguenti per valutare il consumo di ossigeno mitocondriale in fasi diverse dell'ETS:<ol>
<li>Aggiungere 5 µ l di una prolina di 2 M.</li>
		<li>Aggiungere 10 µ l di un succinato di 1m.</li>
		<li>Aggiungere 30 µ l di un 1m glicerolo-3-fosfato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Iniettare il disaccoppiante FCCP in maniera titolazione a passi di 0,5-1 µM (2 µ l di una soluzione di 1 mM) fino a quando la concentrazione ottimale è raggiunta, cioè, la concentrazione per raggiungere il più alto consumo di ossigeno possibile senza inibizione (attenzione: vedere tabella di materiali).</li>
	<li>Iniettare i seguenti inibitori in sequenza per inibire completamente il flusso di elettroni nel sistema ETS al fine di misurare il consumo di ossigeno residuo (ROX) cioè non respiratori reazioni quali reazioni ossigenasi tra gli altri:<ol>
<li>Aggiungere 1 µ l di una rotenone di 1 mM (attenzione: vedere Tabella materiali).</li>
		<li>Aggiungere 5 µ l di una malonato di 2m (attenzione: vedere Tabella materiali).</li>
		<li>Aggiungere 1 µ l di una 5 mM antimycin A (attenzione: vedere Tabella materiali).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aggiungere ascorbato di 0,2 mM e 0,5 mM TMPD in sequenza negli alloggiamenti, iniziando con l'ascorbato per misurare il consumo di ossigeno di complesso IV.</li>
	<li>Aggiungere 20 mM di sodio azide per inibire il complesso IV (attenzione: vedere Tabella materiali).</li>
	<li>Una volta che il segnale è stabile, aprire gli alloggiamenti con il distanziale, ri-ossigenare gli alloggiamenti con l'iniezione di 2 mL di ossigeno puro e chiudere le camere quando la concentrazione è di circa 250-300 nmol.mL-1.</li>
	<li>Misurare il segnale per 10-15 min e calcolare lo sfondo chimico, vale a dire, il consumo di ossigeno a causa di autossidazione di TMPD.</li>
</ol>6. pulizia del respirometro
<ol><li>Dopo le misurazioni, sciacquare una volta gli alloggiamenti con acqua distillata e sciacquare gli alloggiamenti tre volte in etanolo al 70%.</li>
	<li>Incubare in etanolo assoluto per 10 min inattivare gli inibitori.</li>
	<li>Lavare tre volte con acqua distillata, riempire gli alloggiamenti con etanolo al 70% e sostituire i tappi e i tappi fino al prossimo utilizzo.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

In questo studio, è descritto un metodo per la preparazione del campione prima le misure del consumo di ossigeno mitocondriale in drosofila. Questo metodo è stato sviluppato per risolvere diversi problemi relazionati ai protocolli utilizzando isolamenti mitocondriali, in particolare in termini di durata e numero di esemplari richiesto. Invece di lavorare con isolamenti mitocondriali solitamente che richiedono grandi quantità di tessuti ottenuti da individui diversi, questo esperimento viene eseguito sulle fibre muscolari...

Moscerino della frutta, Drosophila melanogaster, è stato utilizzato come organismo modello per la ricerca genetica per sopra un secolo1. Lo studio di questo organismo non ha solo portato a significative conoscenze fondamentali sull'ereditarietà legata al sesso2, mutazione tasso3, lo sviluppo del sistema neurale e la determinazione di destino cella4, ma anche recentemente è emerso come un strumento prezioso per studiare i meccanismi inerenti alle diverse malattie come Alzheimer e Parkinson5,6. Inoltre, è un modello popolare per studiare il processo di invecchiamento, in quanto può essere sollevate in gran numero per un breve periodo di tempo e hanno una durata breve. Inoltre possiedono strutture omologhe degli organi umani, come un cuore, corpi grassi (funziona allo stesso modo come il tessuto adiposo bianco e fegato), oenocytes (hepatocyte-come le cellule), insulina producendo le cellule (equivalente a cellule β-pancreatiche), nonché la emolinfa trasporta metaboliti (analogo al sangue dei vertebrati)7. Inoltre, le vie centrali del metabolismo intermedio (tra cui la via di segnalazione dell'insulina/insulina-come il fattore di crescita e i percorsi del bersaglio della rapamicina-TOR) sono altamente conservato7. Per questi motivi, Drosophila recentemente sono state sfruttate per descrivere i meccanismi fondamentali che controllano il metabolismo, soprattutto in condizioni patologiche inerenti umani malattie metaboliche come il diabete8. Una componente importante del metabolismo è il mitocondrio che integra le vie multiple ed esegue una delle più importanti funzioni biologiche della vita, produzione di ATP, tramite il processo di fosforilazione ossidativa (OXPHOS). Considerando il loro ruolo centrale nel metabolismo dell'organismo, non è sorprendente che le disfunzioni mitocondriali sono coinvolti in molte malattie come il morbo di Parkinson9 e morbo di Alzheimer malattie10, così come nella sclerosi laterale amiotrofica 11 , 12. sono anche determinanti fondamentali del processo di invecchiamento. Infatti, sono i principali produttori di specie reattive dell'ossigeno (ROS) nella cellula, che può essere dannosa per la cella ad alta concentrazione a danni ossidativi11. Invecchiamento inoltre è stata associata all'accumulo di DNA danneggiato o mutato mitocondriale13, mitophagy disfunzioni14,15 , così come danno della biogenesi mitocondriale16. I mitocondri sono anche determinanti dell'omeostasi della cella come possono utilizzare diversi substrati per regolare diverse funzioni cellulari secondo l'abbondanza o la scarsità di macronutrienti17,18.
Infatti, le diverse sostanze nutritive nella dieta (carboidrati, lipidi e proteine) sono digerite, assorbite e trasportate nelle cellule. Vengono poi trasformati nel citosol, e i substrati derivati vengono trasportati nella matrice mitocondriale dove si producono equivalenti riducenti, quali NADH e FADH219. Questi equivalenti riducenti sono quindi ossidati dai diversi complessi enzimatici del sistema di trasporto dell'elettrone (ETS). Questi complessi vengono incorporati nella membrana mitocondriale interna, come complesso I e II complesso. Inoltre, altri complessi enzimatici come il glicerolo-3-fosfato deidrogenasi mitocondriale e la deidrogenasi di prolina rappresentano percorsi alternativi per la voce di elettroni in ETS20,21. Questi complessi 'alternativi' sono particolarmente importanti in insetti, come secondo le specie, possono partecipare attivamente per aumentare la respirazione20,22,23,21. Elettroni da questi sistemi di alimentazione di ETS sono trasferiti ad l'ubiquinone e successivamente al complesso III e quindi al complesso IV, fino al ricettore finale, ossigeno molecolare. Questo trasferimento di elettroni genera una Forza Protonomotrice attraverso la membrana mitocondriale interna guida la fosforilazione di ADP in ATP al complesso V (Figura 1). Considerando il ruolo centrale dei mitocondri nell'omeostasi della cella, studiando il metabolismo mitocondriale utilizzando il relativo modello d. melanogaster rappresenta un potente strumento per delineare i meccanismi di fondo di varie fisiopatologico condizioni o sotto stress cellulare e ambientale. Sorprendentemente però, solo una manciata di studi effettivamente misurati la respirazione mitocondriale in Drosophila24,25,26. Infatti, gli esperimenti con l'obiettivo di valutare il consumo di ossigeno mitocondriale richiedono l'isolamento dei mitocondri. Anche se vantaggioso per la misurazione delle diverse funzioni mitocondriali (ad esempio produzione di ROS o rapporto di P/O come indicatore di efficienza mitocondriale27,28), questi isolamenti richiedono generalmente piuttosto grandi quantità del tessuto da diversi individui24,29. Questo requisito per elevate quantità di tessuto e di individui è un importante fattore limitante, soprattutto se si considera che tutti gli individui dovrebbero essere della stessa età e preferibilmente dello stesso sesso per gli esperimenti, rendendo la misura della respirazione in tempi diversi punti laborioso nella migliore delle ipotesi. Inoltre, mentre gli isolamenti mitocondriali possono fornire significativi comprensione dei meccanismi fondamentali che regolano il metabolismo mitocondriale, i metodi utilizzati per isolare i mitocondri hanno diversi inconvenienti come la difficoltà di ottenere risultati replicabili , la rottura della rete mitocondriale e alterazione di mitocondriale struttura e funzione29,30,31.
Lo scopo di questo studio è di presentare un protocollo robusto per misurare il consumo di ossigeno mitocondriale in Drosophila usando solo una minima quantità di tessuto da pochissimi individui. Questo protocollo consiste nel misurare ossigeno mitocondriale consumo in situ utilizzando fibre muscolari permeabilized29 da toraci di Drosophila in combinazione con alta risoluzione respirometry32,33, 34 , 35. questo metodo ha anche altri vantaggi rispetto al metodo classico isolamento mitocondriale poiché le interazioni con gli altri componenti della cellula come bene come mitocondriale struttura e funzione sono più conservati in permeabilizzate fibre29,31,36, che rende questo approccio più fisiologicamente rilevanti. Con questo protocollo, funzioni mitocondriali possono essere accuratamente valutate utilizzando manometrica ad alta risoluzione in solo tre toraci di Drosophila, con substrati permettendo la determinazione del consumo di ossigeno alle diverse fasi dell'ETS. Di conseguenza, questo protocollo potrebbe aiutare rispondere alle domande fondamentali circa i meccanismi fondamentali che controllano il metabolismo nel contesto delle diverse condizioni ambientali o patofisiologiche sfruttando il modello di Drosophila.
Per misurare il consumo di ossigeno alle diverse fasi dell'ETS e valutare come i diversi substrati contribuiscono alla respirazione, diversi substrati (Figura 1), disaccoppiatore, e inibitori sono usati30 dopo permeabilizzazione della tessuto. In particolare, aggiunte sequenziale di diversi substrati vengono eseguite per stimolare l'entrata di elettroni attraverso diversi complessi dell'ETS. Un disaccoppiatore, Carbonil cianuro 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP), viene quindi aggiunto a concentrazione ottimale per misurare la respirazione non accoppiati, cioè, la respirazione non fosforilante stimolata al massimo consumo di ossigeno. Inibizioni sequenziale dei complessi che i, II e III stiamo quindi eseguita per monitorare il consumo di ossigeno residuo che è a causa di reazioni di ossidazione del non-ETS. Infine, capacità di respirazione massima complesso IV può essere valutata tramite l'iniezione di N, N, N', N, - tetrametil - p-fenilendiammina (TMPD), un elettrone artificiale provider e ascorbato. È importante notare che gli esperimenti sono condotti a 24 °C, dal momento che è la temperatura alla quale vengono generati i mosche.

<table><tbody><tr><td>Respirometro ad alta risoluzione Oxygraph O2K</td><td>Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria</td><td>10022-02</td><td>Kit respirometro Startup O2K &nbsp;</td></tr><tr><td>Set di titolazione O2K&nbsp;</td><td>Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria</td><td>20820-03</td><td>Siringhe Hamilton con diversi volumi &nbsp;</td></tr><tr><td>Software Datlab</td><td>Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria</td><td>20700</td><td>Software per l'acquisizione e l'analisi dei dati &nbsp;</td></tr><tr><td>Pinza antimagnetica a punta fine</td><td>VWR</td><td>82027-400</td><td> &nbsp;</td></tr><tr><td>Secura225D-1S-DQE</td><td>Sartorius AG, Goettingen, Germania</td><td></td><td>Bilancia semi-micro (distribuita da diverse aziende)&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Drosophila melanogaster wild-type w1118</td><td>Bloomington Drosophila stock Center, IN, USA</td><td></td><<td>br/> Condizioni di conservazione: 24 &deg; C</td></tr><tr><td>Glicole etilenico-bis(2-amminoetiletere)-N,N,N&prime;,N&prime;-acido tetraacetico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td>EGTA Condizioni di conservazione: RT</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1767</td><td>ATTENZIONE: corrosivo per i metalli, tossicità acuta, corrosione della pelle, gravi lesioni oculari, tossicità acquatica acuta. Condizioni di conservazione: RT</td></tr><tr><td>CaCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4830</td><td> Condizioni di conservazione: RT</td></tr><tr><td>Na2ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td> Condizioni di conservazione: -20 &deg; C</td></tr><tr><td>MgCl2.6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td> Stato di conservazione: RT</td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625</td><td> Stato di conservazione: RT</td></tr><tr><td>Na2Phosphocreatine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7936</td><td> Stato di conservazione: -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td> Stato di conservazione: RT</td></tr><tr><td>Ditiotreitolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td> Stato di conservazione: 2-8 gradi; C</td></tr><tr><td>MES idrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td> Condizioni di conservazione: RT</td></tr><tr><td>Saponina da corteccia di quillaja</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7900</td><td>Saponina Condizioni di conservazione: RT Preparazione della soluzione: 5 mg in 1 mL di soluzione di conservazione. Preparare fresco ogni giorno.</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td> Condizioni di conservazione: RT</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td> Condizioni di conservazione: RT</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td> Condizioni di conservazione: RT</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>05470</td><td> Condizioni di conservazione: 2-8 &deg; C</td></tr><tr><td>Na2S2O4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>157953</td><td>Ditionito di sodio. ATTENZIONE: sostanze e miscele autoriscaldanti, tossicità acuta, tossicità acquatica acuta tossicità acquatica cronica. Condizioni di conservazione: RT</td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td>Piruvato Condizioni di conservazione: 2-8 gradi; C Preparazione della soluzione: In acqua MilliQ. Preparare fresco ogni giorno.</td></tr><tr><td>Acido L-(-)-malico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1000</td><td>Malato Condizioni di conservazione: RT Preparazione della soluzione: In acqua MilliQ. Neutralizzare con KOH e conservare a -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>Adenosina 5'-difosfato sale monopotassico idrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5285</td><td>ADP Condizioni di conservazione: -20 C Preparazione della soluzione: In acqua MilliQ. Neutralizzare con KOH e conservare a -80 &deg;C.</td></tr><tr><td>Citocromo c da cuore equino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7752</td><td>Citocromo c Condizioni di conservazione: -20 &deg; C Preparazione della soluzione: In acqua MilliQ. Conservare a -20 °C.</td></tr><tr><td>L-Prolina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0380</td><td>Proline Condizioni di conservazione: RT Preparazione della soluzione: In acqua MilliQ. Conservare a -20 °C.</td></tr><tr><td>Succinato di sodio bibasico esaidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2378</td><td>Succinato Condizioni di conservazione: RT Preparazione della soluzione: In acqua MilliQ. Neutralizzare con HCl e conservare a -20 °C.</td></tr><tr><td>sn-glicerolo 3-fosfato bis(cicloesilammonio) sale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7886</td><td>glicerolo-3-fosfato Condizioni di conservazione: -20 &deg; C Preparazione della soluzione: In acqua MilliQ. Neutralizzare con HCl e conservare a -80 °C.</td></tr><tr><td>Cianuro di carbonile 4-(trifluorometossi)fenilidrazone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td>FCCP. ATTENZIONE: tossicità acuta, sensibilizzazione cutanea, tossicità acquatica cronica. Condizioni di conservazione: RT Soluzione Preparazione: In etanolo assoluto. Conservare in fiale di vetro a -20 °C.</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td>ATTENZIONE: tossicità acuta, irritazione cutanea, irritazione oculare, tossicità specifica per organi bersaglio (sistema respir), tossicità acquatica acuta, tossicità acquatica cronica. Soluzione Preparazione: In etanolo assoluto. Conservare in fiale scure a -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>Acido malonico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1296</td><td>Malonato. ATTENZIONE: tossicità acuta, gravi lesioni oculari. Condizioni di conservazione: RT Preparazione della soluzione: In acqua MilliQ. Neutralizzare con KOH. Preparare fresco ogni giorno.</td></tr><tr><td>Antimicina A da Streptomyces sp.</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td>Antimicina A. ATTENZIONE: tossicità acuta, tossicità acquatica acuta, tossicità acquatica cronica. Condizioni di conservazione: -20 &deg; Soluzione C Preparazione: In etanolo assoluto. Conservare a -20 °C.</td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;-Tetrametil-p-fenilendiammina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7394</td><td>TMPD Condizioni di conservazione: RT Preparazione della soluzione: In acqua MilliQ. Conservare in fiale scure a -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>(+)-L-ascorbato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4034</td><td>Ascorbato Condizioni di conservazione: RT Preparazione della soluzione: In acqua MilliQ. Conservare in fiale scure a -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>Azide di sodio. ATTENZIONE: tossicità acuta (orale e cutanea), tossicità specifica per organi bersaglio (cervello), tossicità acquatica, tossicità acquatica cronica. Preparazione della soluzione: In acqua MilliQ. Conservare a -20 °C.</td></tr></tbody></table>

misura del consumo di ossigeno mitocondriale nelle fibre permeabilized di drosophila utilizzando la minima quantità di tessuto

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

Moscerino della frutta, Drosophila melanogaster, rappresenta un modello emergente per lo studio del metabolismo. Infatti, drosophila hanno strutture omologhe a organi umani, possiedono vie metaboliche altamente conservate e hanno una durata relativamente breve che consente lo studio dei meccanismi fondamentali differenti in un breve periodo di tempo. Sorprende, tuttavia, che uno dei meccanismi essenziali per il metabolismo cellulare, la respirazione mitocondriale, non è stato accuratamente studiato in questo modello. È probabile che la misura della respirazione mitocondriale in drosofila richiede solitamente un numero molto grande di individui e i risultati ottenuti non sono altamente riproducibili. Qui, è descritto un metodo che permette la misurazione precisa del consumo di ossigeno mitocondriale utilizzando la minima quantità di tessuto dalla drosofila. In questo metodo, toraci sono sezionati e permeabilizzate sia meccanicamente con una pinza tagliente e chimicamente con saponina, permettendo diversi composti di attraversare la membrana cellulare e modulano la respirazione mitocondriale. Dopo il permeabilization, un protocollo viene eseguito per valutare la capacità dei diversi complessi del sistema di trasporto dell'elettrone (ETS) di ossidare substrati diversi, così come la loro risposta per un disaccoppiatore e parecchi inibitori. Questo metodo presenta molti vantaggi rispetto ai metodi utilizzando isolamenti mitocondriali, in quanto è più fisiologicamente rilevante perché i mitocondri sono ancora interagendo con le altre componenti cellulari e la morfologia mitocondriale è conservata. Inoltre, la preparazione del campione sono più veloci, e i risultati ottenuti sono altamente riproducibili. Combinando i vantaggi della drosofila come un modello per lo studio del metabolismo con la valutazione della respirazione mitocondriale, importanti nuove intuizioni possono essere svelati, soprattutto quando le mosche sono sperimentando diversi ambientale o fisiopatologico condizioni.

Una traccia di rappresentante del consumo di ossigeno mitocondriale mediante il protocollo descritto sopra è fornita nella Figura 2. Il piruvato e malate iniettato nelle camere insieme con le fibre muscolari permeabilized si riferiscono alla respirazione CI-perdita, vale a dire, quando il complesso I di ETS è stimolato dal NADH prodotte attraverso l'ossidazione del piruvato e malate tramite il ciclo dell'acido tricarbossilico (CI). Durante questo tas...

In questa carta, è descritto un metodo per misurare il consumo di ossigeno utilizzando ad alta risoluzione manometrica in permeabilized toraci di Drosophila. Questa tecnica richiede una minima quantità di tessuto rispetto alla tecnica classica isolamento mitocondriale e i risultati ottenuti sono più fisiologicamente rilevanti.

Misura del consumo di ossigeno mitocondriale nelle fibre Permeabilized di Drosophila utilizzando la minima quantità di tessuto

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare la respirazione mitocondriale nel comune moscerino della frutta, Drosophila Melanogaster, utilizzando la respirometria ad alta risoluzione. Ciò si ottiene sezionando prima la Drosophila, per raccogliere il torace. I torace contenenti i muscoli del volo vengono quindi accuratamente permeabilizzati meccanicamente, con pinze affilate, e incubati con saponina, per un'ulteriore permeabilizzazione. I torace vengono quindi trasferiti nelle camere di un respirometro e il consumo di ossigeno mitocondriale viene misurato con una combinazione di diversi substrati, disaccoppiatori e inibitori. Ciao, sono Chlo

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Un protocollo spettrofluorimetrico per la misura della permeabilità mitocondriale apertura dei pori di transizione nel cuore topo mitocondri isolati è presentato qui. Il test prevede la misurazione simultanea dei mitocondri...

Multi-parametro di misura della apertura dei pori di transizione di permeabilità nel Cuore mouse mitocondri isolati

I metodi presentati forniscono istruzioni passo dopo passo per l'esecuzione di una raccolta di saggi respirometrici basati su micropiastre utilizzando mitocondri isolati da quantità minime di muscolo scheletrico di topo. Questi saggi sono in grado di misurare i cambiamenti/adattamenti meccanicistici nel consumo di ossigeno mitocondriale in un modello animale di uso comune.

Utilizzo di mitocondri isolati da minime quantità di muscolo scheletrico del mouse per High micropiastre rendimento respiratorie Misure

Ad alta risoluzione respirometria è utilizzato per determinare il consumo di ossigeno mitocondriale. Questa è una tecnica semplice per determinare mitocondriale complessi della catena respiratoria '(I-IV) frequenza respiratoria, la capacità del sistema di trasporto degli elettroni mitocondriale massima, e l'integrità della membrana mitocondriale esterna.

Ad alta risoluzione respirometria mitocondriale per valutare la funzione in permeabilizzate e cellule intatte

L'analisi della relazione struttura-funzione mitocondriale è necessaria per una comprensione approfondita dei meccanismi regolatori della funzionalità mitocondriale. In questo articolo sono descritti e dimostrati metodi specifici per lo studio della struttura e della funzione mitocondriale nelle ovaie di Drosophila vive e fisse.

Studiare mitocondriale Struttura e funzione in Drosophila ovaie

Vi presentiamo un protocollo per misurare il consumo di ossigeno e l'acidificazione extracellulare nei cervelli di larve e adulti di Drosophila melanogaster . Un analizzatore metabolico è utilizzato con un protocollo adattato e ottimizzato. Vincoli di micro-tessuto sono una componente fondamentale del presente protocollo e progettate e create appositamente per il loro uso in questa analisi.

Analisi metabolica di Drosophila melanogaster Larval e cervello adulto

La respirazione mitocondriale è fondamentale per la sopravvivenza organismal; Pertanto, il tasso di consumo di ossigeno è un eccellente indicatore della salute mitocondriale. In questo protocollo, descriviamo l'uso di un respirometro commercialmente disponibile per misurare basale e tassi di consumo di ossigeno massimo nel vivere, intatta e liberamente-motile Caenorhabditis elegans.

Misurazione dei tassi di consumo di ossigeno in intatto Caenorhabditis elegans

La respirometria ad alta risoluzione accoppiata a sensori di fluorescenza determina il consumo di ossigeno mitocondriale e la generazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS). Il presente protocollo descrive una tecnica per valutare le frequenze respiratorie mitocondriali e la produzione di ROS nel nervo sciatico permeabilizzato.

Valutazione della funzione mitocondriale nel nervo sciatico mediante respirometria ad alta risoluzione

La respirometria coulometrica è ideale per misurare il tasso metabolico di piccoli organismi. Quando è stato adattato per Drosophila melanogaster nel presente studio, il consumo di O2 misurato era all'interno dell'intervallo riportato per D. melanogaster selvatico da studi precedenti. Il consumo di O2 per mosca da parte dei mutanti CASK , che sono più piccoli e meno attivi, è stato significativamente inferiore rispetto al wildtype.

Misurazione del consumo di O2 in Drosophila melanogaster mediante microrespirometria coulometrica

Qui presentiamo un protocollo di respirometria ad alta risoluzione per analizzare la bioenergetica nei moscerini della frutta mutanti PINK1B9-null. Il metodo utilizza il protocollo SUIT (Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration).

Analisi della funzione mitocondriale in un mutante PINK1B9-null di Drosophila melanogaster utilizzando la respirometria ad alta risoluzione

Questo articolo descrive un metodo per valutare le interazioni e gli assemblaggi di proteine integrali di membrana in vitro con vari fattori partner in un ambiente lipidico-prossimale.

Utilizzando impalcatura liposomi per ricostituire interazioni proteina-proteina lipidi-prossimale In Vitro

Scopri la misura del consumo di ossigeno mitocondriale in fibre permeabilizzate di Drosophila utilizzando respirometria ad alta risoluzione. Questo metodo richiede minime quantità di tessuto e fornisce risultati fisiologicamente rilevanti per studi metabolici.

Misura del consumo di ossigeno mitocondriale nelle fibre Permeabilized di Drosophila utilizzando la minima quantità di tessuto

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