Procedura di RNA Pull-down per identificare gli obiettivi di RNA di un RNA lunghi Non codificanti

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di identificare in cellule in coltura o in tessuto, i partner molecolari dell'RNA di un RNA lungo non codificante di interesse. Questo metodo può aiutare a decifrare le funzioni biologiche di un RNA lungo non codificante fornendo nuove conoscenze significative sulla regolazione dell'RNA da parte di RNA lunghi non codificanti. Il vantaggio principale di questo metodo è che è utilizzabile per la maggior parte delle applicazioni poiché lo abbiamo ottimizzato, in primo luogo per diversi RNA lunghi non codificanti e in secondo luogo sia per le cellule in coltura che per gli estratti di tessuti.

Il nostro metodo si basa sul mix di due metodi precedenti, il ChIRP, che sta per Chromatin Isolation by RNA Purifications, e il CHART, che è l'analisi di ibridazione a cattura di bersagli di RNA. La specificità del nostro metodo è che le sonde oligonucleotidiche sono state progettate utilizzando la modellazione bioinformatica di una struttura secondaria di un lungo RNA non codificante e il suo obiettivo era identificare i bersagli dell'RNA. A dimostrare la procedura saranno due tecnici del mio team, Benedicte Boyer e Severine Guillen.

Dopo aver coltivato le cellule GH4C1 secondo il protocollo di testo, rimuovere il terreno da una piastra di coltura cellulare e utilizzare un volume di PBS per risciacquare le cellule. Aggiungere 10 millilitri di PFA all'1% in PBS per fissare le cellule. Quindi, reticolare le cellule sotto agitazione a temperatura ambiente per 10 minuti.

Estinguere l'azione del PFA aggiungendo 1 millilitro di glicina molare da 1,25 e agitare il campione a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi, scartare la soluzione per aspirazione e utilizzare 10 millilitri di PBS per sciacquare la piastra due volte per cinque minuti ciascuna. Quindi, aggiungi un millilitro di PBS, usa un raschietto per raccogliere le cellule e trasferiscile in una provetta da centrifuga.

Centrifugare il campione a 510 g e quattro gradi Celsius per cinque minuti. Quindi, rimuovere quanto più surnatante possibile e conservare i pellet a tempo indeterminato a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius. Per effettuare la reticolazione tissutale, immergere cinque milligrammi di tessuto della ghiandola pituitaria di topo appena ottenuto in un volume 10X di PFA all'1% in PBS e agitare il campione a temperatura ambiente per 10 minuti.

Spegnere il PFA aggiungendo 0,05 millilitri di soluzione di glicina molare da 1,25 e agitare il tessuto a temperatura ambiente per cinque minuti. Aspirare il terreno e utilizzare 0,5 millilitri di PBS per risciacquare il tessuto due volte. Dopo aver rimosso quanto più surnatante possibile, conservare il tessuto reticolato a tempo indeterminato a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius.

Preparare il tampone di lisi per lisare i campioni senza scongelarli preventivamente. Utilizzare il tampone per risospendere i campioni in circa un millilitro per 100 milligrammi di pellet cellulare o tessuto. Posizionare i campioni lisati in un bagno d'acqua a quattro gradi Celsius e avviare la serie di sonicazione ottimizzata secondo il protocollo di testo.

Subito dopo la sonicazione, centrifugare i campioni a 12.000 g e quattro gradi Celsius per cinque minuti. Quindi, trasferire i surnatanti in nuove provette. La serie di sonicazione deve essere ottimizzata per essere sufficientemente efficiente da ridurre la viscosità del DNA senza ottenere altri RNA frammentati.

Per eseguire l'ibridazione sui campioni sonicati, aggiungere due volumi di tampone di ibridazione ai tubi e al vortice. Trasferire 20 microlitri di ciascun campione in provette da centrifuga e conservare a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius. Aggiungere 100 picomoli di sonde oligonucleotidiche biotinilate a ciascun campione.

Quindi, incubare i campioni sotto agitazione moderata su un rotatore di provette a temperatura ambiente per quattro-sei ore. Dopo l'incubazione, aggiungere ai campioni 50 microlitri di perle di streptavidina magnetica integrate con 200 unità per millilitro di una soluzione inibitrice della RNasi e un cocktail di inibitori della proteasi da 5 microlitri per millilitro. Incubare le provette a temperatura ambiente con agitazione moderata sul rotatore di provette per una notte.

Il giorno seguente, effettuare l'isolamento dell'RNA posizionando le provette su un supporto magnetico e scartare il surnatante. Quindi, aggiungere 900 microlitri di tampone di lavaggio alle perle e posizionare i tubi su un rotatore a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi, posizionare i campioni sul magnete, scartare il tampone e ripetere il lavaggio cinque volte.

Dopo aver rimosso il lavaggio finale, aggiungere al campione 95 microlitri di tampone proteinasi K e cinque microlitri di 20 milligrammi per millilitro di proteinasi-K. Quindi, con ghiaccio, scongelare i campioni in ingresso e aggiungere 75 microlitri di tampone proteinasi K e cinque microlitri di proteinasi-K. Incubare i campioni a 50 gradi Celsius per 45 minuti, quindi a 95 gradi Celsius per 10 minuti.

Raffreddare i campioni con ghiaccio per tre minuti, quindi posizionarli sul magnete e raccogliere il surnatante contenente gli RNA e scartare le perle. Utilizzare un kit di purificazione dell'RNA per purificare gli RNA. Infine, conservare gli RNA a 80 gradi Celsius negativi ed eseguire RT e qPCR e costruire librerie di DNA secondo il protocollo di testo.

Sulla base di modelli bioinformatici della struttura secondaria dell'lncRNA qui illustrata, le sonde sono state progettate contro due lncRNA, Neat1 o Malat1 di ratto per le cellule coltivate di GH4C1 e Neat1 di topo per gli estratti di tessuto ipofisario. L'arricchimento relativo di Neat1 o Malat1 è stato calcolato per sonde non specifiche e specifiche rispetto ai campioni in ingresso. Questa figura mostra l'efficienza delle sonde specifiche per l'abbattimento di Neat1 nella linea cellulare ipofisaria GH4C1 di ratto e negli estratti di tessuto ipofisario di topo.

Quando il protocollo per specifiche sonde di oligonucleotidi o SO è stato indirizzato a Malat1, è stata generata una sonda efficiente insieme a una sonda inefficiente che è stata scartata. Dopo pull-down dell'RNA e RT qPCR, gli RNA associati a Neat1 negli estratti cellulari di GH4C1 sono stati associati anche a Neat1 negli estratti di tessuto ipofisario. Infatti, dopo il pull-down dell'RNA di Neat1, è stato riscontrato che Malat1 è bersaglio di Neat1 sia nella linea cellulare GH4C1 che negli estratti di tessuto ipofisario di topo.

Inoltre, Neat1 è stato significativamente arricchito dopo che è stato eseguito un pull-down dell'RNA Malat1 con la sonda nelle cellule GH4C1. La stretta relazione identificata tra i due lncRNA è coerente con il potenziale ruolo co-regolatorio di Neat1 e Malat1, suggerito da topi knock-out per Malat1 che mostrano variazioni nell'espressione dell'RNA di Neat1. Una volta padroneggiata, questa tecnica consente in due o tre giorni la cattura dei bersagli di RNA di un RNA lungo non codificante desiderato.

Con l'approccio bioinformatico, è importante progettare diverse sonde antisenso e quindi confrontare sperimentalmente la loro efficienza perché l'efficienza della sonda può essere alterata dai preparati di lisato cellulare. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire il sequenziamento dell'RNA ad alto rendimento al fine di fornire l'intero interattoma dell'RNA di un lungo RNA non codificante di interesse. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come catturare i partner RNA di un lungo RNA non codificante utilizzando sonde efficienti e specifiche che si ibridano nelle regioni disponibili del lungo RNA non codificante, come determinato dalla modellazione bioinformatica della sua struttura secondaria.