Espressione del Transgene di mediata da Virus adeno-associato in neuroni geneticamente definiti del midollo spinale

L'obiettivo generale della somministrazione intraspinale di virus adeno-associati ricombinanti è quello di consentire la marcatura istologica e la manipolazione funzionale di neuroni geneticamente definiti nel midollo spinale dorsale. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del dolore, come ad esempio quali circuiti neuronali sono necessari per la percezione delle diverse modalità del dolore. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i neuroni geneticamente marcati possono essere manipolati in modo particolarmente ristretto e temporalmente controllato.

Individuare la coppia di costole più caudale palpando lungo la colonna vertebrale del topo anestetizzato. Quindi, fai un taglio longitudinale da 1,5 a 2,5 centimetri nella pelle, partendo dal solo rostrale fino al paio di costole più caudali. Sollevare la pelle con una pinza e staccarla dal muscolo sottostante con le forbici.

Durante l'intervento, mantenere umidi i tessuti esposti con cloruro di sodio sterile allo 0,9%. Usando una pinza fine e piccole forbici, praticare un'incisione nello strato membranoso più sottile successivo, proprio accanto alla linea mediana, e tagliarlo via dai processi spinosi. Diversi punti di riferimento anatomici possono aiutare a identificare le vertebre corrette da colpire.

Qui descriviamo tre alternative. Palpare lungo la colonna vertebrale. La coppia di costole più caudale si trova appena rostrale rispetto alle vertebre T13 e l'osso pelvico a livello dell'anca è a livello delle vertebre L6.

In alternativa, tirare indietro la pelle verso la coda per esporre la cresta iliaca. Allo stesso livello, la coppia più caudale di legamenti intetrasversi visibili si unisce al processo spinale L6. Contare all'indietro in direzione caudale o rostrale per identificare le vertebre di interesse.

In caso contrario, individuare il punto in cui il tendine lungo il lato della colonna vertebrale è più bianco e più mediale. Le vertebre T13 si trovano solo rostrali. Il segmento L4 del midollo spinale lombare si trova all'interno di queste vertebre.

Quindi, posiziona l'animale su un cuscino di fazzoletti arrotolati per sollevarlo fino ai morsetti spinali del telaio stereotassico. Allineare i morsetti adiacenti alle vertebre bersaglio. Fissare un morsetto in posizione, quindi tenere la colonna vertebrale con la pinza Adson mentre si fissa il secondo morsetto.

Confermare il corretto serraggio premendo con cautela sulle vertebre mirate. Quindi, rimuovere il muscolo paraspinoso sopra le vertebre di interesse. Innanzitutto, fai un'incisione appena mediale ai tendini paralleli alla colonna vertebrale.

Quindi, praticare incisioni perpendicolari rostrali e caudali alle vertebre bersaglio. Successivamente, usa i rongeurs per strappare o tagliare via il muscolo paraspinoso sopra le vertebre di interesse. Utilizzare il forcipe secondo necessità per rimuovere il tessuto rimasto sulle vertebre o sopra la dura madre nello spazio intravertebrale

Il vaso sanguigno dorsale dovrebbe ora essere visibile, segnando la linea mediana del midollo spinale. Per le iniezioni unilaterali, eseguire una laminectomia parziale utilizzando un trapano da dentista di precisione dotato di una fresa sferica da 0,5 millimetri per praticare con molta attenzione un foro al centro del lato bersaglio delle vertebre. Rimuovere eventuali frammenti ossei rimanenti con un ago smussato calibro 26 per esporre il midollo spinale.

Utilizzare l'ago per perforare la dura madre negli spazi intravertebrali rostrali e caudali alle vertebre bersaglio, a circa 300 micron lateralmente al vaso sanguigno dorsale. Quindi, perforare la dura madre sotto il foro praticato. A questo punto, il liquido cerebrospinale dovrebbe fuoriuscire dai fori e il midollo spinale dovrebbe essere leggermente sporgente.

Preparare la siringa per iniezione montando prima il capillare di vetro su una siringa da microlitro. Serrare saldamente il dado per garantire una vestibilità aderente e sicura. Riempire la siringa da microlitro con acqua distillata sterile, quindi premere lo stantuffo.

Se l'acqua non viene espulsa facilmente dal puntale, è probabile che la micropipetta sia bloccata e debba essere sostituita. Montare la siringa su un micromanipolatore collegato a un microiniettore a controllo elettronico. Quindi, utilizzare il microiniettore per aspirare circa un microlitro d'aria per separare l'acqua e il virus.

Quindi, pipettare una goccia da 2,5 microlitri di soluzione virale diluita su un pezzo di pellicola di paraffina. Spostare con cautela la punta della micropipetta nella gocciolina utilizzando il telaio sterotassico e aspirarla nella micropipetta. Quindi, premere dosare fino a quando non fuoriesce una goccia di soluzione virale sulla punta.

Ritrarre la siringa e utilizzare una penna per contrassegnare la micropipetta con una scala graduata per monitorare il volume erogato. Utilizzare il braccio stereotassico per spostare la punta della micropipetta su uno dei fori della dura madre e poi verso il basso fino a quando non appare una leggera depressione sulla superficie del midollo spinale esposto. Per indirizzare l'iniezione al corno dorsale spinale, spostare la punta verso il basso a una profondità di 500 micron con incrementi di 100 micron e poi verso l'alto di 200 micron per consentire la stabilizzazione meccanica del tessuto.

La profondità finale della punta è di 300 micron. Dopo aver programmato la pompa per iniettare 300 nanolitri a una velocità di iniezione di 50 nanolitri al minuto, premere il pulsante di avvio per iniziare l'infusione. Al termine dell'iniezione, controllare la scala sulla micropipetta per vedere se il livello del virus è diminuito.

Lasciare la micropipetta in posizione per altri tre minuti per consentire alla pressione di equilibrarsi. Dopo tre minuti, ritrarre lentamente la micropipetta e quindi ripetere la procedura per gli altri due siti di iniezione. Dopo l'iniezione finale, rimuovere i morsetti spinali e il cuscino sotto il topo.

Chiudere gli strati di incisione con punti interrotti, suturando gli strati di tessuto superficiale con suture riassorbibili e la pelle con suture non riassorbibili. Applicare il disinfettante allo iodio sulla ferita suturata. Terminare l'anestesia e lasciare l'animale sul tappetino termico fino a quando non si riprende prima di rimetterlo nella gabbia di casa.

Il tessuto spinale nel sito di iniezione deve essere esaminato alla fine dell'esperimento. Ciò è necessario per verificare il successo dell'iniezione e della trasduzione e per escludere un eccessivo danno tissutale a seguito dell'intervento chirurgico. Per illustrare i livelli di espressione che possono essere ottenuti mediante iniezione intraspinale di AAV ricombinante, un virus che codifica per la proteina fluorescente eGFP è stato iniettato nel midollo spinale lombare di topi wild-type.

Tre iniezioni distanziate di circa un millimetro l'una dall'altra hanno prodotto un'infezione quasi continua dei segmenti spinali lombari da L3 a L5. L'iniezione di virus a una profondità di 300 micron dalla superficie spinale porta all'infezione predominante delle cellule del corno dorsale del midollo spinale. Tuttavia, le cellule infette potrebbero essere trovate anche nel corno ventrale. Un vettore flessibile cre dipendente che esprime eGFP è stato iniettato nel midollo spinale di topi transgenici GlyT2:Cre.

Ciò ha portato a un'espressione più ristretta di eGFP che riflette la distribuzione dei neuroni GLYT2 positivi. Seguire questo protocollo consentirà il targeting di tre segmenti spinali consecutivi. Abbiamo scoperto che questo è sufficiente per ottenere risultati comportamentali robusti.

Questa tecnica permetterà di studiare la funzione di specifiche popolazioni di neuroni e cellule e le vie sensoriali.