Sintesi di nanotubi di carbonio Multi-parete modificati con nanoparticelle di argento e valutazione dell'attività antibatterica e proprietà citotossiche

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di produrre nanocomplessi antibatterici costituiti da nanotubi di carbonio con nanoparticelle d'argento sintetizzate sulle superfici del nanotubo. Questo metodo può essere utilizzato nello sviluppo di nuovi nanomateriali batterici che hanno una bassa tossicità per l'uomo pur avendo forti proprietà settiche per diversi tipi di batteri e biofilm. Il protocollo descrive la valutazione dei nanocomplessi nell'eradicazione dei batteri, mantenendo la loro biocomparabilità con l'uomo.

Per iniziare la procedura, mettere da 30 a 50 milligrammi di MWCNT in una fiala da 50 millilitri. Utilizzando una micropipetta dotata di puntali da un millilitro, aggiungere lentamente otto millilitri di una soluzione di acido solforico e acido nitrico tre a uno in volume ai MWCNT. Attendere 30 minuti per il termine della reazione esotermica, quindi sonicare la soluzione a 60-80 gradi Celsius e 160 watt fino a quando i MWCNT non si depositano sul fondo della fiala, che di solito dura circa un'ora.

Trasferire il composto in una provetta da centrifuga. Utilizzare una micropipetta per aggiungere con cautela 30 millilitri di acqua distillata goccia a goccia ai MWCNT funzionalizzati con acido carbossilico, facendo una pausa per consentire alla miscela di raffreddarsi secondo necessità. Quindi, centrifugare la miscela a 12.000 G per 15 minuti.

Rimuovere il surnatante con una pipetta dotata di un puntale da un millilitro. Aggiungere cinque millilitri di etanolo al solido e sciacquare le pareti della fiala con altro etanolo. Centrifugare nuovamente la miscela con le stesse impostazioni e controllare il pH del surnatante con carta per pH.

Continuare a lavare i solidi mediante centrifugazione in etanolo fino a quando il pH del surnatante non è neutro, quindi rimuovere il surnatante e aggiungere un millilitro di acqua distillata al precipitato. Disperdere i MWCNT funzionalizzati con acido carbossilico nell'acqua e liofilizzare la dispersione a meno 60 gradi Celsius sotto vuoto. Mettere 10 milligrammi di MWCNT funzionalizzati con acido carbossilico liofilizzato in una provetta da centrifuga conica da 50 millilitri.

Aggiungere 30 millilitri di acqua distillata al tubo. Unisci sei millilitri di nitrato d'argento normale 0,1 e 18 millilitri di acqua distillata in un altro tubo conico da 50 millilitri. Sonicare entrambe le miscele a 60 gradi Celsius e 160 watt per un'ora.

Quindi, mentre si continua a sonicare la dispersione MWCNT a 60 gradi Celsius e 160 watt, aggiungere la soluzione di nitrato d'argento goccia a goccia alla dispersione MWCNT utilizzando una pipetta dotata di un puntale da un millilitro. Una volta completata l'aggiunta, continuare a sonicare la miscela per un'ora, quindi centrifugare la miscela per 15 minuti a 12.000 G a temperatura ambiente e rimuovere il surnatante. Disperdere nuovamente i MWCNT d'argento in 30 millilitri di acqua distillata mediante sonicazione a 24 gradi Celsius per 30 minuti.

Ripetere la centrifugazione in 30 millilitri di acqua distillata e rimuovere due volte il surnatante. Quindi, disperdere i MWCNT d'argento lavati in un millilitro di acqua distillata mediante sonicazione per cinque minuti. Aggiungere cinque millilitri di etanolo alla dispersione e mescolare il composto a temperatura ambiente per un'ora.

Quindi centrifugare la miscela per 15 minuti a 12.000 g a temperatura ambiente e controllare il pH del surnatante. Rimuovere il surnatante e disperdere nuovamente la miscela in cinque millilitri di etanolo mediante vortex. Continuare a lavare il precipitato in etanolo mediante centrifugazione fino a quando il pH del surnatante non è neutro.

Infine, disperdere i MWCNT d'argento lavati in un millilitro di acqua distillata. Liofilizzare la dispersione a meno 70 gradi Celsius sotto vuoto per 24 ore e conservare la dispersione in un contenitore sigillato. Per iniziare a preparare il test, mescolare e autoclavare 18,12 grammi di agar R2A e un litro di acqua distillata.

Lasciare raffreddare il gel a temperatura ambiente. Quando il gel è pronto per essere versato, mettere 10 millilitri di gel in piastre di Petri da 90 millimetri e lasciare indurire l'agar. In una cappa aspirante, utilizzare un anello e un ago sterilizzati a fiamma di alcol per striare 100 microlitri di una miscela di specie di metilobatterio sulla superficie del terreno di coltura.

Incubare i piatti a 30 gradi Celsius per 48 ore, quindi mescolare 3,12 grammi di brodo R2A con un litro di acqua distillata e sterilizzare in autoclave il terreno a 121 gradi Celsius per 15 minuti. Utilizzare un anello e un ago sterilizzati per trasferire le colonie nel terreno di coltura R2A. Incubare il campione in un incubatore vibrante a 30 gradi Celsius e 180 giri/min.

Misurare la densità ottica a 600 nanometri all'ora fino a quando la densità ottica è maggiore di 0,7. Quindi, prepara un'altra capsula di Petri contenente 10 millilitri di agar R2A. Quindi mescolare 3,12 grammi di brodo R2A e otto grammi di agar con un litro di acqua distillata.

Sterilizzare in autoclave la miscela a 121 gradi centigradi per 15 minuti. Mescolare 100 microlitri di coltura di metilobatterio nella miscela di agar. Versare 10 millilitri di gel contenente metilobatterio sullo strato inferiore di agar R2A nella capsula di Petri, quindi preparare una dispersione della concentrazione desiderata di MWCNT d'argento liofilizzati in acqua distillata.

Utilizzare una micropipetta per caricare 50 microlitri di questa dispersione su un disco di carta sterile di sei x un millimetro. Applicare acqua distillata su un altro disco di carta sterile come controllo. Asciugare e sterilizzare entrambi i dischi in una camera a vuoto sotto luce UV per 30 minuti.

Quindi posizionare il campione di argento MWCNT e il controllo sull'agar e incubare la piastra di agar a 30 gradi Celsius per 48 ore. Al termine, misurare la zona di inibizione attorno al campione di argento MWCNT. Prima del test, sterilizzare in autoclave acqua tripla distillata a 121 gradi Celsius per 15 minuti.

Preparare una dispersione di 1000 microgrammi per millilitro di MWCNT funzionalizzati con acido carbossilico e 50 microgrammi per millilitro, 40 microgrammi per millilitro e 30 microgrammi per millilitro di MWCNT d'argento in quest'acqua sterile. Per iniziare la procedura di test antibatterico, preparare una coltura di metilobatterio come descritto in precedenza e monitorarne la densità ottica a 600 nanometri. Quando la densità ottica è al massimo, innoculare 100 microlitri di coltura di methylobacterium in tre millilitri di terreno di coltura R2A fresco.

Mettere 500 microlitri di questa soluzione in ciascuno dei cinque tubi conici da 15 millilitri. Aggiungere 100 microlitri di metanolo a una delle provette per preparare il campione di riferimento del metanolo. Preparare un campione per ciascuna delle quattro dispersioni allo stesso modo.

Incubare i campioni e la restante coltura di controllo del methylobacterium a 180 giri/min e 30 gradi Celsius fino a quando la densità ottica del controllo indica la massima attività. Utilizzare uno spandiconcime sterilizzato per distribuire ogni campione su gel di agar R2A solido in piastre di Petri. Incubare le piastre a 30 gradi Celsius per 48 ore.

Contare le colonie batteriche risultanti e determinare la concentrazione minima di batteriocida. I MWCNT d'argento sono stati sintetizzati con successo utilizzando la procedura descritta. La dimensione media delle particelle d'argento depositate era di circa 3,83 nanometri.

La crescita del methylobacterium non è stata osservata quando coltivato con dispersioni di 50 microgrammi per millilitro o 40 microgrammi per millilitro di MWCNT d'argento. La popolazione batterica è stata ridotta di 100.000 volte rispetto al campione di controllo quando è stata coltivata con una dispersione di 30 microgrammi per millilitro di MWCNT d'argento. È stata osservata una zona di inibizione attorno a un campione preparato da una dispersione di 10 microgrammi per millilitro di MWCNT d'argento.

Non è stata osservata alcuna zona di inibizione per un campione preparato da una dispersione di un microgrammo per millilitro. Una certa citotossicità è stata osservata quando è stata aggiunta una dispersione di 40 microgrammi per millilitro di MWCNT d'argento. Non è stata osservata alcuna citotossicità significativa quando è stata aggiunta una dispersione di 30 microgrammi per millilitro.

Un test del blu di tripano ha confermato che c'era una citotossicità minima quando è stata aggiunta una dispersione di 30 microgrammi per millilitro di MWCNT d'argento. Questo protocollo aiuterebbe i ricercatori a preparare nanocomplessi che hanno nanoparticelle metalliche che agiscono direttamente sui nanomateriali di carbonio. Seguendo questo protocollo, i ricercatori sarebbero anche in grado di valutare le proprietà antibatteriche dei nanocomplessi preparati.