Name: Live Cell Imaging della segregazione cromosomica durante la mitosi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: Impara a etichettare e visualizzare i cromosomi in cellule mitotiche utilizzando Histone2B-GFP BacMam 2.0 e microscopia confocale a disco rotante. Questo metodo consente di studiare la segregazione cromosomica in fibroblasti embrionali di topo.

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Vorremmo ringraziare il Dr. Guo-Sabrina Hung e Dr. Bharatkumar Joshi per i preziosi commenti che il manoscritto è migliorato.

Tutti gli esperimenti condotti in questi studi sono stati effettuati secondo protocolli approvati dal comitato di uso e cura degli animali istituzionali presso la struttura di ricerca di Food and Drug Administration (FDA).
1. isolamento e coltura di fibroblasti embrionali del Mouse (MEFs)
<ol><li>Isolare i fibroblasti embrionali del mouse (MEFs) da un ceppo di PP2A-B56γ-mouse e wild-type littermates da protocollo standard 7,8,9.</li>
	<li>ExpandMEFs per 3 passaggi, congelare e conservare fino a quando necessario per esperimenti 8.</li>
</ol>2. coltura Mefs in vetro di copertura Chambered 2-pozzo per vivere Imaging
<ol><li>Preparare 500 mL di mezzi di sviluppo MEF contenente Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM/F12) con 10% siero bovino fetale (FBS), 1 X penicillina/streptomicina antibiotici, L-Glutammina (200 mM) e 1 X gli aminoacidi non essenziali (NEAA) in una bottiglia di 500 mL media.</li>
	<li>Scongelare i flaconcini di MEFs congelati da wild type e PP2A-B56γ-topi al passaggio 3 in bagno di acqua pre-riscaldata a 37 ° C.</li>
	<li>Trasferimento scongelati MEFs di provette da 15 mL e lentamente aggiungere goccia a goccia 20 mL di DMEM/F12 media ai tubi 15 mL utilizzando una pipetta di 10 mL.</li>
	<li>Trasferimento MEFs insieme con 20 mL di coltura DMEM/F12 in boccette T75 ed espanderli fino a quando le cellule sono 70% confluenti. Confluency è stimato utilizzando un microscopio inverso a 4x o ingrandimento 10x.</li>
	<li>Aspirare il terreno di coltura utilizzando un pascolo di vetro Pipettare collegato ad un sistema di vuoto nella cappa, aggiungere 3 mL di tripsina/EDTA 0.25% e incubare a 37 ° C per 5 min. aggiungere 3 mL di terreno di coltura DMEM/F12 per arrestare la reazione.</li>
	<li>Centrifugare le cellule a bassa velocità (300 x g) per 5 min a temperatura ambiente. Con attenzione rimuovere il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di terreno di coltura DMEM/F12 pre-riscaldato a 37 ° C in un bagno d'acqua.</li>
	<li>Enumerare le celle utilizzando il metodo di esclusione del blu di trypan o altre cella appropriata contando metodo 8.</li>
	<li>Seme circa 20.000 MEFs/pozzetto in un vetro di copertura chambered 2-pozzo. Aggiungere 200 µ l/pozzetto di coltura DMEM/F12 e permettono alle cellule di allegare incubando una notte a 37 ° C e 5% CO2.</li>
</ol>3. sincronizzazione
<ol><li>Sincronizzare MEFs in fase G0/G1 incubando le cellule in coltura DMEM/F12 contenente 0,1% FBS per 24 h, per ottenere un numero massimo di cellule in fase G0/G1. Nota: Sebbene inedia del siero è stato utilizzato come metodo di preferenza, vari altri metodi possono essere utilizzati a seconda della fase mitotica in cui le cellule sono necessarie per essere arrestato 10.</li>
</ol>4. etichettatura
<ol><li>Preparare 1,5 mg/mL di soluzione madre di nocodazole in DMSO. Nocodazole arresti le cellule in fase G2/M inibendo la formazione di microtubuli 10.</li>
	<li>Tre giorni dopo la sincronizzazione, aggiungere 200 µ l di terreno di coltura (con 10% FCS), 200 ng/mL nocodazole e CL-HB regent (istone 2B-GFP BacMam 2.0).</li>
	<li>Calcolare il reggente di CL-HB particelle Per cella (PPC) da aggiungere alle cellule come segue: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57389/57389eq1.jpg"> Dove il numero delle cellule è il numero totale stimato delle cellule al momento dell'etichettatura, PPC è il numero di particelle Per cella, e 1 × 108 è il numero di particelle per mL di reagente. Ad esempio, alle cellule di etichetta 20.000 con un PPC di 30 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57389/57389eq2.jpg"> Nota: Regent CL-HB funziona bene con molti tipi di cellule tra 10 e 50 PPC. Tuttavia, 30 PPC ha funzionato meglio per questo studio.</li>
	<li>Incubare MEFs per 18 h a 37 ° C e 5% CO2. Nota: Per l'esperimento corrente, visualizzazione di cromosomi nelle cellule mitotiche sfuggire il checkpoint di montaggio del mandrino si è verificato 18 h dopo l'arresto del ciclo cellulare con nocodazole.</li>
</ol>5. visualizzazione di in ritardo di cromosomi
<ol><li>Visualizzare fibroblasti embrionali di topo (MEFs) utilizzando un sistema di microscopio confocale di filatura disco dotato di una camera climatica e un olio da immersione, obiettivo obiettivo 63X.<ol>
<li>Utilizzare lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nm ed emissione lunghezza d'onda 450 nm per acquisizione di immagini di canale GFP.</li>
		<li>Utilizzare un sistema di microscopio confocal di filatura disco con la capacità di fasi motore di scansione, Z-Piezo inserti, incubazione di palcoscenico-top e recupero di fluorescenza diretta dopo foto lo sbiancamento per questa tecnica.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Un giorno prima di formazione immagine, accendere l'unità di camera ambientale e riscaldare l'intera camera a 37 ° C durante la notte.</li>
	<li>Accendere per il basamento del microscopio, macchina fotografica, unità disco di filatura, illuminatore, laser ad argon, computer e tavolino motorizzato.</li>
	<li>Lasciare che il sistema riscaldare per 3 min; avviare il laser di argon attivando la chiave di accensione. L'interruttore toggle per argon laser dalla modalità "standby" per "esecuzione di laser".</li>
	<li>Avviare il software di acquisizione ed elaborazione di dati.</li>
	<li>Avviare il controller di CO2 per l'incubatrice di fase superiore e impostare la concentrazione di CO2 al 5%. Questo deve essere fatto prima dell'inizio dell'imaging.</li>
	<li>Rimuovere il vetro di copertura incamerato dall'incubatore e posto sul palco per la visualizzazione. Visualizzare le cellule tramite un obiettivo ad immersione 63 x obiettivo (NA1.4).</li>
	<li>Vista attraverso le lenti oculari, mettere a fuoco l'immagine e identificare una cella in fase di ripartizione (NEBD) involucro nucleare.</li>
	<li>Avviare adeguate laser (laser di argon 488 nm per visualizzare Histone2B-GFP).</li>
	<li>Aprire la finestra acquisizione del controllo e impostare il tempo di esposizione per il canale GFP. Identificare una cella che si trova in NEBD.<ol>
<li>Manualmente determinare la parte superiore della cella di destinazione e il piano focale inferiore e immettere impostazioni di sezionamento ottico xyz.</li>
		<li>Osservarlo per 20 min; Se la cella non procede attraverso la divisione cellulare, interrompere l'acquisizione di immagini dopo 20 min e passare alla cella successiva che è in NEBD.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Circa 1 h per ogni cella è necessaria ai cromosomi in ritardo immagine durante la mitosi in PP2A-B56γ-cellule che fuggiti dal SAC. Per ottenere i dati per un film, scattare foto ogni 3 min. Nota: cellule Wild type arrestano e non progredire oltre NEBD quando trattati con nocodazole.</li>
	<li>Salvare le immagini nel formato di file di zvi per ulteriori analisi.</li>
</ol>6. analisi ed elaborazione di immagini
Nota: Eseguire l'elaborazione immagine tridimensionale e analisi utilizzando qualsiasi software disponibile come Axiovision versione 4.8.2 o Imaris versione 8.2. Per questo studio il ImageJ software è stato utilizzato.
<ol><li>Aprire la sequenza di immagini. Se le immagini sono già in un formato di pila, procedere al passaggio successivo. Se non, combinare tutte le immagini pertinenti in una pila utilizzando ' immagine &gt; Pile &gt; immagini allo Stack' nella barra dei menu.</li>
	<li>Eseguire eventuali regolazioni come richiesto per luminosità/contrasto e livelli.</li>
	<li>Per aggiungere un timestamp al film:<ol>
<li>Vai alla ' immagine &gt; Pile &gt; etichetta... ' nella barra dei menu.</li>
		<li>Selezionare il formato appropriato, il valore di tempo iniziale e intervallo di tempo tra ogni immagine.</li>
		<li>Selezionare la casella di 'Anteprima' e regolare le impostazioni di posizione e formato. Premere 'OK' per applicare il timbro di tempo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per aggiungere una barra di scala per il film:<ol>
<li>Impostare l'immagine ridimensionamento sotto ' analisi &gt; Imposta scala ' nella barra dei menu.</li>
		<li>Nel campo 'Distanza in pixel', immettere un numero di pixel di cui è nota la distanza e nel campo 'Distanza noto' immettere la distanza. Impostare la corretta unità di lunghezza per la distanza, per esempio, in µm. Premere 'OK' per applicare la scala allo stack.</li>
		<li>Vai a ' Analyze &gt; Strumenti &gt; scala bar... ' per aggiungere la barra della scala. Impostare la dimensione della barra come 'Larghezza in µm' e regolare le restanti opzioni come appropriato di formattazione. Selezionare la casella 'Etichettare tutte le fette' per aggiungere la barra della scala per l'intero stack.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Visualizzare in anteprima il filmato facendo clic sul pulsante triangolare play in basso a sinistra del bordo della finestra immagine. Regolare il frame rate tramite ' immagine &gt; Pile &gt; Animazione &gt; Opzioni di animazione nella barra dei menu.</li>
	<li>Esportare il file del filmato selezionando ' File &gt; Salva con nome &gt; AVI... ' e selezionare il frame rate e compressione.</li>
	<li>Premere 'OK' per scegliere Salva percorso e nome file. Premere 'Salva' per salvare il file del filmato.</li>
</ol>

<ol><li>Funk, L. C., Zasadil, L. M., Weaver, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Living+in+CIN%3A+Mitotic+Infidelity+and+Its+Consequences+for+Tumor+Promotion+and+Suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Living in CIN: Mitotic Infidelity and Its Consequences for Tumor Promotion and Suppression.</a> Dev Cell. 39, 638-652 (2016).</li>
<li>Etemad, B., Kops, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attachment+issues%3A+kinetochore+transformations+and+spindle+checkpoint+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Attachment issues: kinetochore transformations and spindle checkpoint silencing.</a> Curr Opin Cell Biol. 39, 101-108 (2016).</li>
<li>Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spindle+assembly+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The spindle assembly checkpoint.</a> Curr Biol. 22, 966-980 (2012).</li>
<li>Jallepalli, P. V., Lengauer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+segregation+and+cancer%3A+cutting+through+the+mystery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Chromosome segregation and cancer: cutting through the mystery.</a> Nat Rev Cancer. (2), 109-117 (2001).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+protein+CSPP1+interacts+with+CENP-H+protein+to+coordinate+accurate+chromosome+oscillation+in+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mitotic protein CSPP1 interacts with CENP-H protein to coordinate accurate chromosome oscillation in mitosis.</a> J Biol Chem. 290 (45), 27053-27066 (2015).</li>
<li>Pikor, L., Thu, K., Vucic, E., Lam, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+detection+and+implication+of+genome+instability+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">The detection and implication of genome instability in cancer.</a> Cancer Metastasis Rev. 32 (3-4), 341-352 (2013).</li>
<li>Varadkar, P., Despres, D., Kraman, M., Lozier, J., Phadke, A., Nagaraju, K., McCright, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+phosphatase+2A+B56%CE%B3+regulatory+subunit+is+required+for+heart+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">The protein phosphatase 2A B56γ regulatory subunit is required for heart development.</a> Dev Dyn. 243 (6), 778-790 (2014).</li>
<li>Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Mouse+Embryonic+Fibroblast+Cells+Suitable+for+Culturing+Human+Embryonic+and+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells.</a> J. Vis. Exp. (64), e3854(2012).</li>
<li>Varadkar, P., Abbasi, F., Takeda, K., Dyson, J. J., McCright, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PP2A-B56%CE%B3+is+required+for+an+efficient+spindle+assembly+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">PP2A-B56γ is required for an efficient spindle assembly checkpoint.</a> Cell Cycle. 18 (12), 1210-1219 (2017).</li>
<li>Rosner, M., Schipany, K., Hengstschläger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merging+high-quality+biochemical+fractionation+with+a+refined+flow+cytometry+approach+to+monitor+nucleocytoplasmic+protein+expression+throughout+the+unperturbed+mammalian+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle.</a> Nat Protoc. 8 (3), 602-626 (2013).</li>
<li>Jonkman, J., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Any+Way+You+Slice+It-A+Comparison+of+Confocal+Microscopy+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Tech%22%5BJournal%5D)">Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques.</a> J Biomol Tech. 26 (2), 54-65 (2015).</li>
<li>Versaevel, M., Braquenier, J. B., Riaz, M., Grevesse, T., Lantoine, J., Gabriele, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+reveals+LINC+complex+recruitment+at+nuclear+indentation+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy reveals LINC complex recruitment at nuclear indentation sites.</a> Sci Rep. 8 (4), 7362(2014).</li>
<li>Wild, T., Larsen, M. S., Narita, T., Schou, J., Nilsson, J., Choudhary, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26904940">The Spindle Assembly Checkpoint Is Not Essential for Viability of Human Cells with Genetically Lowered APC/C Activity.</a> Cell Rep. 1 (8), 1829-1840 (2016).</li>
<li>Iuso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+Expression+of+Human+Protamine+1+%28hPrm1%29+Remodels+Fibroblast+Nuclei+into+Spermatid-like+Structures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Exogenous Expression of Human Protamine 1 (hPrm1) Remodels Fibroblast Nuclei into Spermatid-like Structures.</a> Cell Rep. 1 (9), 1765-1771 (2015).</li>
<li>Ratcliffe, E., Glen, K. E., Naing, M. W., Williams, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+and+perspectives+on+stem+cell-based+therapies+undergoing+clinical+trials+for+regenerative+medicine%3A+case+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Br+Med+Bull%22%5BJournal%5D)">Current status and perspectives on stem cell-based therapies undergoing clinical trials for regenerative medicine: case studies.</a> Br Med Bull. 108, 73-94 (2013).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

I checkpoint di controllo del ciclo cellulare che assicurano la segregazione del cromosoma accurata prevenire aneuploidia e cella trasformazione 1,2,3. Nello studio presente, abbiamo trovato che l'inattivazione di PP2A-B56γ ha provocato un checkpoint di montaggio mandrino indebolito. Live cell imaging ci ha permesso di osservare la mis-segregazione cromosomica durante la mitosi in MEFs di PP2A-B56γ trattati con nocodazole <sup c...

Nel seguente protocollo, descriviamo un metodo conveniente per visualizzare la segregazione cromosomica e mitotica progressione durante il ciclo cellulare in fibroblasti embrionali del mouse utilizzando istone 2B-GFP, BacMam 2.0 etichettatura e live cell imaging.
I checkpoint di controllo del ciclo cellulare monitorare la segregazione del cromosoma e svolgono un ruolo importante nel mantenimento dell'integrità genetica delle cellule 1,2,3. Accumulo di mis-segregati cromosomi può portare a aneuploide, che è un segno dei più solidi tumori 4. Quindi, rilevamento di in ritardo cromosomi utilizzabile come un metodo per studiare l'instabilità cromosomica.
L'etichetta fluorescente proteine possono essere utilizzato per visualizzare la segregazione del cromosoma dal vivo e cromosomiche in ritardo ma la generazione di mCherry-etichetta o proteina H2B-GFP etichettate richiede conoscenza sostanza di gene consegna e biologia molecolare 5. Qui descriviamo l'uso del reagente CellLight Histone2B-GFP BacMam 2.0, chiamato in seguito reggente di CL-HB, per ragioni di semplicità. Questo reagente può essere utilizzato immediatamente e quindi Elimina le preoccupazioni circa la qualità di vettore e l'integrità. Inoltre, questo reagente non richiede l'uso di trattamenti potenzialmente dannosi o di lipidi e di tintura-caricamento prodotti chimici. A differenza di etichette fluorescenti convenzionali, il reggente di CL-HB macchie indipendentemente dalla funzione (cioè., potenziale di membrana). Il reggente di CL-HB può essere semplicemente aggiunti alle cellule e incubato durante la notte per l'espressione della proteina. Il reggente di CL-HB non replica in cellule di mammiferi e può essere utilizzato nelle regolazioni del laboratorio 1 (BSL) livelli di biosicurezza. Inoltre, la trasfezione transiente può essere rilevata dopo incubazione overnight per fino a 5 giorni, tempo sufficiente per svolgere analisi cellulari più dinamiche.
In alternativa, le anomalie cromosomiche potrebbero essere studiate mediante varie tecniche quali la citometria a flusso, immunohistochemistry o fluorescenza in situ di ibridazione (pesce) 6. Citometria a flusso può essere utilizzato per studiare l'aneuploidia, che può essere misurato basato sul contenuto del DNA e la fase delle cellule nel ciclo cellulare. Anche se la citometria a flusso può essere utilizzato per misurare l'aneuploidia, non fornisce informazioni sulla mis segregazione cromosomica. Tecniche di immunoistochimica e pesce utilizzano sonde fluorescenti per associare al DNA o cromosomi. Mentre queste tecniche forniscono un'istantanea dello stato di una popolazione di cellule, non consentono live cell imaging quindi manca qualsiasi informazione ottenuta attraverso la visualizzazione spaziotemporali della citochinesi in cellule specifiche seguiti per un periodo di tempo.
Questo protocollo è stato usato per studiare i cromosomi in ritardo o mis-segregazione cromosomica in fibroblasti embrionali del mouse di nocodazole trattati (MEFs) isolate da topi-B56γ-PP2A. In aggiunta ai sopra applicazione, questo protocollo fornisce un semplice strumento per etichettare e visualizzare segregazione cromosomica in vari tipi di cellule che può essere usato per studiare la regolazione del ciclo cellulare o instabilità cromosomica in cellule del tumore. Inoltre, può essere utilizzato anche per studiare l'instabilità cromosomica causata da vari trattamenti farmacologici o per studiare gli effetti di gene knock out conseguente mis segregazione cromosomica.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320082</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali (100X)</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>EMD Millipore</td><td>MX 1458-6</td><td></td></tr><tr><td>Scatole criogeniche per fiale</td><td>Fisherbrand</td><td>10-500-28</td><td></td></tr><tr><td>Fiale criogeniche</td><td>Corning/costar</td><td>431416</td><td></td></tr><tr><td>Palloni T75</td><td>Cellstar</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>2 vetri di copertura a camera pozzettistica</td><td>Nunc</td><td>155380PK</td><td></td></tr><tr><td>Cellometro Vision Cell Profiler</td><td>Nexcelom Bioscience LLC</td><td>Cellometro Vision Trio</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td>Sigma</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>CellLight Histone 2B-GFP, BacMam 2.0</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>C10594</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Cell Observer Sistema di microscopio confocale a disco rotante</td><td>Microscopia Carl Zeiss</td><td>Microscopia Zeiss Cell Observer SD</td><td></td></tr><tr><td>Bagno d'acqua</td><td>Incubatore</td><td>Thermoscientific serie</td><td></td>280</tr><tr><td></td><td>Soluzioni commerciali Sanyo</td><td>MCO-18AIC (UV)</td><td></td></tr><tr><td>Classe II Cabina di sicurezza biologica</td><td>The Baker Company</td><td>SterilGard</td><td></td></tr><tr><td>Software Axiovision</td><td>Zeiss</td><td>Ver.4.8.2</td><td></td></tr><tr><td>Software ImageJ</td> Istituto <td>Superiore di Sanità</td><td>Ver. 1.51r</td><td></td></tr></tbody></table>

live cell imaging della segregazione cromosomica durante la mitosi

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Cromosomi devono essere uniformemente e in modo affidabile suddivise in cellule della figlia durante la divisione cellulare mitotica. Fedeltà della segregazione cromosomica è controllata da meccanismi multipli che includono il mandrino Assembly Checkpoint (SAC). Il SAC è parte di un sistema di feedback complessi che è responsabile per la prevenzione di un progresso delle cellule attraverso la mitosi, a meno che tutti i cinetocori cromosomici hanno attaccato per mandrino microtubuli. Cromosomiche in ritardo e cromosoma anormale segregazione è un indicatore di checkpoint di controllo del ciclo cellulare disfunzionale e può essere usata per misurare la stabilità genomica di divisione delle cellule. Deregolamentazione del SAC può causare la trasformazione di una cellula normale in una cellula maligna attraverso l'accumulo di errori durante la segregazione cromosomica. Implementazione del SAC e la formazione del cinetocore complesse sono strettamente regolati dalle interazioni tra chinasi e fosfatasi come proteina fosfatasi 2A (PP2A). Questo protocollo descrive live cell imaging di in ritardo di cromosomi in fibroblasti embrionali di topo isolate da topi che avevano un knockout della subunità regolatoria di PP2A-B56γ. Questo metodo sormonta le imperfezioni di altri ciclo cellulare controllo tecniche di imaging quali la citometria a flusso o immunocitochimica che forniscono solo un'istantanea di uno stato di citochinesi cellulare, invece di una visualizzazione dinamica spazio-temporale dei cromosomi durante la mitosi.

MEFs da wild type e PP2A-B56γ-topi sono stati seminati in un vetro di copertura 2-pozzo camera e permesso di allegare. Il giorno 2, MEFs sono stati sincronizzati utilizzando 0,1% FBS per 24 h. Il giorno 3, MEFs nei media con 200 ng/mL nocodazole e 30 PPC CL-HB regentwere incubati per 18 h 37° C e 5% CO2. Il giorno 4, le cellule erano imaged utilizzando un sistema di microscopio confocal di filatura disco (Figura 1). Live imaging cellular...

Questo protocollo descrive un metodo facile e conveniente per etichettare e visualizzare live cromosomi nelle cellule mitotiche utilizzando etichetta Histone2B-GFP BacMam 2.0 e un sistema di microscopia confocal di filatura disco.

Live Cell Imaging della segregazione cromosomica durante la mitosi

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di marcare e visualizzare i cromosomi vivi nelle cellule mitotiche utilizzando l'etichetta Histone 2B-GFP BacMam 2.0 e un sistema di microscopia confocale a disco rotante. Questo metodo può essere utilizzato per visualizzare i cromosomi mitotici in cellule in coltura per studiare gli effetti delle modificazioni genetiche o dei trattamenti farmacologici sulla segregazione cromosomica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce un metodo semplice e conveniente per etichettare e visualizzare i cromosomi vivi nelle cellule mitotiche.A dimostrare la procedura di imaging dal vivo sarà il dottor Kazuyo Takeda, che gestisce la struttura di base per la microscopia e l'imaging nella divisione dei prodotti virali presso il Centro per la valutazione e la ricerca biologica della FDA. I fibroblasti embrionali di topo, o MEF, utilizzati in questo esperimento vengono coltivati in un vetro di copertura a due pozzetti a 37 gradi Celsius e 5% di CO2 durante la notte, come descritto nel protocollo di testo. Il giorno successivo, sincronizzare i MEF in fase G0/G1 incubandoli in terreno di crescita DMEM/F12 contenente lo 0,1% di FBS.Il giorno dell'etichettatura, preparare una soluzione madre da 1,5 milligrammi per millilitro di nocodazolo in DMSO. Un passaggio critico consiste nel calcolare la giusta quantità di particelle CL-HB per cellula per ottenere una marcatura sufficiente per la visualizzazione cromosomica senza tossicità per le cellule. In precedenza abbiamo determinato, mediante esperimenti di titolazione, che 30 PPC funziona meglio.Aggiungere ai MEF, 200 microlitri di terreno di coltura con il 10% di FCS, 200 nanogrammi per millilitro di nocodazolo e il reagente CL-HB a 30 particelle per cellula. Incubare i MEF a 37 gradi Celsius e 5% di CO2 per 18 ore. La visualizzazione dei MEF viene effettuata utilizzando un sistema di microscopio confocale a disco rotante dotato di una camera ambientale e di una lente obiettivo 63X a immersione in olio.Un giorno prima dell'imaging, accendere la camera ambientale e riscaldare l'intera camera a 37 gradi Celsius durante la notte. Il giorno seguente, accendere il supporto del microscopio, la fotocamera, l'unità disco rotante, l'illuminatore, il laser ad argon, il computer e il tavolino motorizzato. Dopo aver lasciato riscaldare il sistema per tre minuti, avviare il laser ad argon accendendo la chiave di accensione.Commutare l'interruttore a levetta per il laser ad argon da standby a laser run. Avviare il software di acquisizione ed elaborazione dati. Avviare il controller di CO2 per l'incubatore superiore del tavolino e impostare la concentrazione di CO2 al 5%Rimuovere il vetro di copertura della camera dall'incubatore, posizionarlo sul tavolino del microscopio e selezionare la lente dell'obiettivo 63X a immersione in olio.Guarda attraverso le lenti oculari, metti a fuoco l'immagine e identifica una cellula nella fase di rottura dell'involucro nucleare, o NEBD. Avvia il laser ad argon a 488 nanometri per visualizzare l'istone 2B-GFP. Aprire la finestra di controllo dell'acquisizione e impostare il tempo di esposizione per il canale GFP.Identifica una cellula che si trova in NEBD. Quindi, determinare manualmente il piano focale superiore e inferiore della cella e inserire le impostazioni di sezionamento ottico XYZ. Osservare la cella per 20 minuti.È importante essere consapevoli del fatto che, poiché non tutte le cellule passano attraverso la mitosi, il progresso mitotico deve essere monitorato attivamente. Se la cellula non procede attraverso la divisione cellulare dopo 20 minuti, interrompere l'acquisizione dell'immagine e passare alla cellula successiva che si trova in NEBD. Per ottenere i dati per un filmato, scattare foto ogni tre minuti.È necessaria circa un'ora per cellula per visualizzare i cromosomi in ritardo durante la mitosi nelle cellule PP2A-B56-gamma che sono sfuggite dal checkpoint di assemblaggio del fuso. Salva le immagini in formato file ZVI per ulteriori analisi. L'imaging di cellule vive è stato utilizzato per visualizzare il destino delle singole cellule mentre progredivano dalla NEBD alla mitosi.Dopo il trattamento con nocodazolo, tutte le 21 cellule wild-type osservate sono state arrestate in metafase. Al contrario, delle 21 cellule prive di PP2A-B56-gamma osservate, 16 sono state in grado di passare attraverso la mitosi dopo il trattamento con nocodazolo. Inoltre, in 13 di questi MEF è stata rilevata una segregazione cromosomica anormale.Un esempio di una cellula PP2A-B56-gamma sottoposta a missegregazione cromosomica è mostrato in questo video. Una volta padroneggiata, questa tecnica richiederà dai tre ai quattro giorni a seconda del trattamento cellulare prima del protocollo di marcatura. È importante ricordare che si tratta di una trasfezione transitoria e che i segnali possono essere rilevati solo fino a cinque giorni.Questo protocollo può essere utilizzato per rispondere a ulteriori domande relative alla regolazione del ciclo cellulare, all'instabilità genomica e alla qualità dei prodotti di terapia cellulare. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica potrebbe essere utilizzata per studiare l'imaging dal vivo dei cromosomi in un'ampia varietà di linee cellulari, come linee cellulari primarie, cellule staminali, neuroni e cellule T immortalizzate. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come etichettare e visualizzare facilmente i cromosomi vivi nelle cellule mitotiche utilizzando l'etichetta Histone 2B-GFP BacMam 2 e un sistema di microscopia confocale a disco rotante.

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Qui si descrive un protocollo di base per l'immagine e quantificare i tempi mitotico delle cellule dei tessuti dei mammiferi vivono cultura dopo trasfezione di siRNA.

Time-lapse imaging di mitosi dopo la trasfezione di siRNA

Fonte: Schumacher, D., e Sogaard-Andersen, L. Imaging a fluorescenza delle cellule vive dell'intero ciclo cellulare vegetativo del batterio sociale a lenta crescita Myxococcus xanthus. J. Vis. Esp. (2018)Questo video dimostra l'uso dell'imaging delle cellule vive per tracciare le origini cromosomiche marcate con fluorescente durante la divisione cellulare batterica. Cattura la dinamica della segregazione cromosomica utilizzando microscopia a contrasto di fase a tempo e fluorescenza.

Imaging a time-lapse della segregazione cromosomica in batteri marcati con fluorescenza

Progenitrici neurali mitosi è un parametro critico della neurogenesi. Gran parte della nostra comprensione delle progenitrici neurali mitosi si basa sull'analisi del tessuto fisso. Vivo imaging in fettine cerebrali embrionali è una tecnica versatile per valutare mitosi con alta risoluzione temporale e spaziale in un ambiente controllato.

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Vi presentiamo un protocollo per la sincronizzazione della timidina doppia delle cellule HeLa seguita da analisi mediante microscopia confocale ad alta risoluzione. Questo metodo è la chiave per ottenere il numero elevato di celle che procedono in modo sincrono dalla fase S alla mitosi, permettendo studi sui ruoli mitotici delle proteine multifunzionali che possiedono anche funzioni di interfase.

Combinazione di sincronizzazione cellulare mitotica e microscopia confocale ad alta risoluzione per studiare il ruolo delle proteine del ciclo cellulare multifunzione durante la mitosi

Formazione immagine della vivere-cella fornisce una ricchezza di informazioni su singole cellule o di intere popolazioni che è irraggiungibile da cella fissa imaging da solo. Qui, i protocolli di imaging di cellule vive per valutare le decisioni di destino delle cellule dopo il trattamento con il paclitaxel della droga anti-mitotico sono descritti.

A lungo termine Live cell Imaging per valutare il destino delle cellule in risposta a Paclitaxel

Qui, presentiamo l'imaging a cellule vive che è un metodo di microscopia non tossico che consente ai ricercatori di studiare il comportamento delle proteine e la dinamica nucleare nelle cellule di lievito di fissione viventi durante la mitosi e la meiosi.

Esame della dinamica nucleare del lievito di fissione mitotico e meiotico da fluorescenza microscopia a celle vive

Le divisioni cellulari possono essere visualizzate in tempo reale utilizzando proteine fluorescenti e microscopia time-lapse. Utilizzando il protocollo qui presentato, gli utenti possono analizzare le dinamiche di temporizzazione della divisione cellulare, l'assemblaggio del mandrino mitotico e il congresso cromosomico e la segregazione. I difetti in questi eventi a seguito del knockdown genico mediato dall'RNA (RNAi) possono essere valutati e quantificati.

Uso di celle Drosophila S2 per l'imaging live della divisione cellulare

Qui presentiamo un protocollo per valutare la dinamica della formazione del mandrino e della progressione mitotica. La nostra applicazione di imaging time-lapse consente all'utente di identificare le cellule in varie fasi della mitosi, monitorare e identificare i difetti mitotici e analizzare la dinamica del mandrino e il destino delle cellule mitotiche dopo l'esposizione a farmaci anti-mitotici.

Live Cell Imaging per valutare la dinamica della temporizzazione metafase e del destino delle cellule a seguito di perturbazioni mitotiche del mandrino

La microscopia time-lapse è uno strumento prezioso per studiare la meiosi nel lievito in erba. Questo protocollo descrive un metodo che combina la sincronizzazione del ciclo cellulare, la microscopia time-lapse e l'esaurimento condizionale di una proteina bersaglio per dimostrare come studiare la funzione di una proteina specifica durante la segregazione cromosomica meiotica.

Uso della microscopia time-lapse e della deplezione nucleare stadio-specifica delle proteine per studiare la meiosi in S. cerevisiae

Questo protocollo presenta un metodo efficiente per l'imaging del neuroepitelio dell'occhio pupale di Drosophila. Questo metodo compensa il movimento dei tessuti e la topologia irregolare, migliora la visualizzazione dei confini cellulari attraverso l'uso di più proteine di giunzione marcate con GFP e utilizza un impianto di imaging facilmente assemblabile.

Live-imaging del Drosophila Pupa Eye

Impara a etichettare e visualizzare i cromosomi in cellule mitotiche utilizzando Histone2B-GFP BacMam 2.0 e microscopia confocale a disco rotante. Questo metodo consente di studiare la segregazione cromosomica in fibroblasti embrionali di topo.

Live Cell Imaging della segregazione cromosomica durante la mitosi

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