Name: Trombosi venosa profonda indotta dalla stasi in topi monitorati dallecografia ad alta frequenza (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 44 s
Description: Impara a indurre la trombosi venosa profonda nei topi usando il modello di stasi della vena cava inferiore e monitorala con ecografia ad alta frequenza. Questo metodo non invasivo permette di quantificare la formazione e la risoluzione del trombo in vivo.

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Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione dal cuore e Stroke Foundation of Canada e da The Morris e Bella Fainman Family Foundation. Gli autori vorrei ringraziare Veronique Michaud per il suo aiuto tecnico con il sistema di imaging ad ultrasuoni VEVO770.

Tutte le procedure sono state approvate dal istituzionale animale cura Comitato della McGill University Montreal, QC, Canada. Tutte le attrezzature necessarie sono elencata nella tabella I.
1. murino (C57BL/6J) IVC stasi protocollo
<ol><li>Preparazione all'intervento Nota: Questo è un intervento chirurgico di sopravvivenza e di conseguenza, un'adeguata tecnica asettica deve essere seguita in ogni momento. Questo include assicurandosi che tutti i materiali sono a portata di mano, la pulizia e sterilizzazione degli strumenti prima e tra uso e che designa una zona sterile sulla superficie di lavoro per tutto il materiale sterile.<ol>
<li>Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici e materiali in autoclave. Uno sterilizzatore di perlina di vetro è sufficiente per sterilizzare suggerimenti strumento tra gli animali, se più di una procedura venga eseguita in una sola volta.</li>
		<li>Anestetizzare topi maschii C57Bl/6 di 8-10 settimane vecchio con una miscela di 100% ossigeno e 2,5% isoflurane. Nota: Regolare il flusso di ossigeno e isoflurano come necessario.</li>
		<li>Confermare amputate pizzicando la zampa posteriore dell'animale tra le dita dei piedi con il forcipe. Nessuna risposta dal pizzico indica che l'animale è anestetizzato.</li>
		<li>Somministrare analgesici a lento rilascio (buprenorfina) tramite iniezione sottocutanea. Dare ai topi una dose di 1 mg di analgesico per 1 kg di peso corporeo (1 mg/kg).</li>
		<li>Posto unguento oculare su entrambi gli occhi dell'animale affinché nessun dissecazione corneale per tutta la durata della procedura.</li>
		<li>Somministrare per via sottocutanea 0,2 - 0,5 mL di liquidi isotonici per 10 g di peso corporeo.</li>
		<li>Fissare l'animale alla tabella chirurgia utilizzando nastro chirurgico. Metti l'animale in posizione supina per esporre l'addome. Eseguire un intervento chirurgico su un rilievo di riscaldamento per evitare l'ipotermia.</li>
		<li>Rimuovere i capelli dall'addome del mouse mediante applicazione di una crema depilatoria per 1-2 min. pulire l'area addominale pulire con garza e acqua distillata, se necessario.</li>
		<li>In alternativa, rimuovere i capelli dall'addome di rasatura con un rasoio elettrico piccolo.</li>
		<li>Sterilizzare l'addome con Baxedin (soluzione di clorexidina gluconato BP) prima di effettuare qualsiasi incisioni. Applicare etanolo leggermente con una garza per evitare eccessive perdite di calore causata dall'evaporazione dell'alcool.</li>
	</ol></li>
	<li>Esposizione della Vena Cava inferiore (IVC)
	<ol>
<li>Utilizzando le forbici chirurgiche, eseguire una laparotomia per aprire la cavità addominale.<ol>
<li>Sollevi la pelle con il forcipe al basso addome e praticare un'incisione verticale parallela su entrambi i lati della linea alba. Effettuare l'incisione prima a sinistra o a destra della linea alba, a seconda la manualità dell'operatore. L'incisione è fatta partire dal midline per assistere in ecografia più tardi.</li>
			<li>Fare un'incisione seconda, orizzontale nella parte superiore dell'addome. Nota: Al momento la penetrazione nell'addome, la muscolatura dovrebbe essere "tented" e poi penetrata con le forbici chirurgiche per evitare di danneggiare gli organi addominali.</li>
			<li>Ripetere le incisioni verticali e orizzontali su strato del muscolo addominale dell'animale. Essere sicuri di tenda la muscolatura durante la penetrazione nell'addome per non danneggiare gli organi sotto. Attenzione: Sollevare pelle e muscolo dall'intestino e altri organi interni quando fare incisioni per non forare loro.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Piegare la pelle e muscolo da incisione per esporre la cavità addominale.</li>
		<li>Applicare garza, inumidito con soluzione isotonica, ai lati dell'apertura della ferita ed esternare l'intestino. Applicare pressione su entrambi i lati dell'addome per assistere l'esternalizzazione degli intestini. Utilizzare movimenti dolci con un cotton-fioc per spostare gli intestini. Immergere la garza in soluzione isotonica e posto sopra l'intestino esternalizzato.<ol>
<li>Garza deve essere pre-inumidito prima del posizionamento sul tessuto.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Spostare da parte qualsiasi grasso peritoneale ed esporre il IVC fra le vene iliache e renali.</li>
		<li>Fare un'identificazione iniziale di rami laterali evidenti. Un ramo laterale apparirà come più piccolo, ma significativa vena che si dirama dalla IVC, tra renale e iliaca vene. Sistema vascolare può variare notevolmente fra i topi. Topi possono avere rami laterali presenti su uno o entrambi i lati del IVC.</li>
	</ol></li>
	<li>Legatura dei rami laterali Nota: Se rami laterali sono presenti, è seguita la seguente procedura per ciascuno di essi. Se non è presente, procedere al passaggio 4: posizionamento della sutura iniziale sotto il IVC. Il sito di legatura del IVC sarà immediatamente distale della vena renale sinistra, indipendentemente dalla presenza di rami laterali.<ol>
<li>Eseguire una dissezione smussa su ciascun lato del ramo laterale. Scollamento è il processo di apertura ripetutamente forcipe smussato con una leggera pressione, in modo da spezzare attraverso fascia senza danneggiare i vasi circostanti. Attenzione: Evitare forature o danneggiare la vena.</li>
		<li>Sollevare il ramo e passare una sezione di 6-0 sutura seta sotto la vena. Fare sempre attenzione quando il sollevamento o lo spostamento di navi. Si consiglia di afferrare il grasso intorno ai vasi, altrimenti c'è il rischio di danneggiare la nave.</li>
		<li>Mezzo di sutura forcipe, fare una legatura chirurgica intorno al ramo laterale utilizzando il nodo chirurgico standard tecnica di legatura. Legatura completa è fatto per garantire 100% occlusione della vena. Utilizzare almeno tre tiri di legatura per fissare saldamente la legatura.</li>
		<li>Ripetere il passaggio 1.3 per qualsiasi restanti rami laterali.</li>
	</ol></li>
	<li>Dissezione dell'aorta addominale da IVC
	<ol>
<li>Eseguire una dissezione smussa intorno la IVC immediatamente distale dalla vena renale di sinistra. L'aorta addominale è collegato a IVC tramite fascia, pertanto eseguire iniziale dissezione smussa intorno alla IVC e l'aorta addominale. Attenzione: Evitare di perforatura o di danneggiare la vena. Non rompersi o puntura sia vaso. Questa è la parte più critica della procedura, con il più alto rischio di danno vascolare.</li>
		<li>Continuare ad applicare una leggera pressione tramite dissezione smussa fino a quando una finestra trasparente è fatta fra l'aorta e IVC.</li>
	</ol></li>
	<li>Posizionamento della sutura e legatura IVC
	<ol>
<li>Passare una sezione di 6-0 sutura seta sotto l'IVC e l'aorta addominale.</li>
		<li>Individuare la sutura attraverso la finestra creata tra l'IVC e l'aorta. Utilizzare pinze per tirare il filo di sutura e infilarla fra l'aorta addominale e IVC. Far passare la sutura attraverso con attenzione, cercando di non tirare/puntura la IVC e dell'aorta addominale.</li>
		<li>Fare una legatura chirurgica intorno IVC con il forcipe di sutura, garantendo una totale occlusione della vena. Ancora una volta, rendere la legatura immediatamente distale dalla vena renale di sinistra.</li>
		<li>Fare tre tiri di sutura per garantire la legatura. Nota: È anche possibile passare la sutura sotto l'IVC e l'aorta prima che separa i due come opzione alternativa. In alternativa, le suture 7-0 Prolene possono essere utilizzate per la legatura dei rami laterali e IVC.</li>
	</ol></li>
	<li>La chiusura della ferita e cure post-operatorie
	<ol>
<li>Verificare che l'aorta addominale è stato lasciato senza interruzioni e che tutti i rami laterali sono stati legati. L'IVC appare dilatato distale dal sito legatura e nessun sangue flusso sarà visibile.</li>
		<li>Posto tutto grasso peritoneale e intestini indietro nella cavità addominale.</li>
		<li>Chiudere la ferita con sutura forcipe e sutura seta 6-0. Utilizzare un suturare corrente (semplice continuo) e assicurarsi che la sutura non sarà troppo stretta. Una sutura stretta rompe quando l'animale si sveglia e si muove intorno la sua gabbia.<ol>
<li>In alternativa, è possibile utilizzare clip PDS, Vicryl, Vicryl, Dexon o in acciaio inox per la chiusura della ferita.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Sutura lo strato del muscolo addominale prima mediante sutura appropriata tecnica di legatura.</li>
		<li>Ripetere la tecnica di sutura per la pelle e verificare la chiusura della ferita è sufficiente. Nota: Se si utilizza la stessa sutura ago e filo per più animali, sterilizzare sia in etanolo al 70% prima di ogni utilizzo.</li>
		<li>Rimuovere l'animale dal gas anestetico e metterli in un'incubatrice di 34 ° C per almeno 30 minuti.</li>
		<li>Ancora una volta, somministrare 0,2 - 0,5 mL di liquidi isotonici per 10 g di peso corporeo per via sottocutanea. Fluidi possono essere dato nei giorni successivi per mantenere il peso corporeo pre-operatoria, se necessario.</li>
		<li>Monitorare l'animale fino al recupero per garantire il successo della chirurgia e valutare la salute generale dell'animale. Attenzione: Aspettatevi una lieve postura ricurva per una procedura invasiva come questo, ma l'animale si comporterà normalmente più presto post-operazione di 30 minuti.</li>
		<li>Mettere l'animale in una propria gabbia e non metterlo con gli altri animali fino a quando completamente recuperato.</li>
		<li>Ri-amministrare analgesico ogni giorno per fino a 48 h operata.</li>
		<li>Posto cibo sul pavimento della gabbia per l'animale mentre in recupero. Altra cura speciale non è generalmente necessario.</li>
		<li>Esaminare il sito della ferita per arrossamento, gonfiore, o scarico e altri segni di infezione.</li>
		<li>Se necessario, rimuovere le suture dopo 7-10 giorni.</li>
		<li>Eseguire immediatamente l'eutanasia se chirurgia ha esito negativo (ad esempio, significativi danni e/o sangue perdita del vaso) o animale non migliora con cure post-operatorie. L'eutanasia è generalmente effettuata a operata di 48 h. Per gli esperimenti più lunghi, è possibile utilizzare 7-0 Prolene per legare i rami laterali e VCI e suture di Vicryl 5-0 per chiudere la cavità addominale.<ol>
<li>Eseguire l'eutanasia amputate dell'animale in un'induzione come descritto in precedenza, tranne al 5% isoflurane. Questa è seguita da asfissia con 100% CO2 mentre anestetizzati.</li>
			<li>Dopo la conferma dell'eutanasia per asfissia (perdita del battito cardiaco e non respira), eseguire dislocazione cervicale per garantire completa eutanasia.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. protocollo di ultrasuono ad alta frequenza di
Nota: Questo protocollo è adattato dalla signora Davis Institute roditore Phenotyping Core SOP per l'imaging ad ultrasuoni ad alta frequenza. Questo protocollo viene effettuato post-operatorio 24 h, ma può essere fatto prima, purché l'animale sta rispondendo bene alla chirurgia. Il protocollo può essere effettuato in qualsiasi momento su topi sani ed è spesso fatto per confrontare prima e dopo la chirurgia.
<ol><li>
Preparazione dell'animale
	<ol>
<li>Metti l'animale in una camera di induzione e anestetizzare l'animale con una miscela di 100% ossigeno e 2,5% isoflurane.</li>
		<li>Accendere il monitor di temperatura e frequenza cardiaca. Lampada di calore posizione sopra tabella per tenere caldo animale durante la procedura.</li>
		<li>Rimuovere l'animale dalla camera di induzione e applicare il lubrificante di occhio per evitare disidratazione corneale. Posizionare l'animale sulla piattaforma di analisi e fissare il tubo anestetico per bocca/naso dell'animale.</li>
		<li>Ultrasuono caldo gel a 37 ° C e mettere il gel sull'addome dell'animale. Il gel per ultrasuoni è riscaldato mediante un sistema di riscaldamento dell'acqua che pompe caldo acqua attraverso le bobine che sono avvolti intorno alla bottiglia di gel.</li>
		<li>Per misure di frequenza cardiaca (se necessario), mettere gel per elettrodi 4 elettrodi della piattaforma di analisi e fissare le zampe dell'animale per il piattaforma/elettrodi con nastro chirurgico. Metti l'animale in posizione supina per l'imaging del IVC. Il sistema di imaging a ultrasuoni comprende una piattaforma di analisi che viene riscaldata e contiene gli elettrodi per il monitoraggio dell'animale.</li>
		<li>Per misure di temperatura, mettere il gel per elettrodi sul termometro e inserire nel retto dell'animale.</li>
		<li>Regolare la lampada di calore e isoflurano come necessario garantire quell'animale è confortevole, ha una respirazione tra 30-70 bpm ed è tenuto a 37 ° C.</li>
		<li>Se necessario, Radere l'addome dell'animale o Rimuovi i peli con la crema depilatoria. Applicare per 1-2 minuti e pulire con garza e acqua distillata. Nota: I capelli troppo possono influenzare la qualità delle immagini.</li>
		<li>Posizionare la garza sotto o al lato dell'animale per catturare qualsiasi gel per ultrasuoni in eccesso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
L'IVC e l'embolo di imaging
	<ol>
<li>Attivare il software di imaging e avviare un nuovo studio.</li>
		<li>Selezionare un scanhead adeguato per l'imaging. Il scanhead usato qui è per gli organi addominali (frequenza: 35 MHz, lunghezza focale: 12,8 mm).</li>
		<li>Registrare tutte le informazioni pertinenti circa l'animale. Questo può includere animale ID, sesso, peso, data di nascita, ceppo, ecc.</li>
		<li>Abbassare il scanhead fino a quando non sta toccando il gel per ultrasuoni sull'animale.</li>
		<li>Avviare la sonda scanhead per iniziare 2-D imaging dell'animale. In questa modalità, le immagini sono presentate come due dimensioni, in varie tonalità di grigio.</li>
		<li>Individuare l'IVC e l'aorta addominale spostando la piattaforma del mouse durante la x - e/o y-aereo, mentre anche in movimento il scanhead attraverso il piano z. Nota: Sangue vasi apparirà con il loro bianco di pareti e il sangue all'interno quasi nero. Aorta addominale sarà pulsare intensamente e hanno pareti più spesse, mentre l'IVC sarà hanno pareti più sottili e comprimere/espandere facilmente l'immagine dello schermo quando il scanhead viene spostato e giù. Il sito di legatura sarà evidente, come la vena sarà essere dilatata e la parete venosa arriverà a un punto. Qualsiasi embolo formata all'interno sarà solido sotto l'imaging ad ultrasuoni e non comprimerà facilmente come fa la parete venosa. La vena comprimerà solo sopra la legatura, dove nessun embolo è formato.</li>
		<li>All'individuazione della IVC e il sito di legatura, centro loro il punto focale degli ultrasuoni, al fine di ottenere l'immagine più accurata.<ol>
<li>Se l'immagine è troppo buio per vedere chiaramente, regolare il gel e rimuovere eventuali bolle d'aria con un cotton-fioc.</li>
			<li>Se necessario, inclinare il scanhead 45° verso sinistra o verso destra e riadattare la piattaforma animale per vedere chiaramente la vena. Ciò avviene se c'è interferenza con il scanhead. In questo scenario, la vena deve essere imaged ad angolo lato per evitare la sutura. Nota: Immagine interferenza è spesso causato da macchie scure della pelle il posizionamento della sutura della ferita poveri, bolle nel gel ultrasuoni o degli animali.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Utilizzando il software, prendere le foto di tutte le strutture desiderate e fare misurazioni utilizzando qualsiasi strumenti di misurazione. Misure comuni includono l'area della sezione trasversale dell'embolo o larghezza del sito legatura.</li>
		<li>Modificare la modalità di imaging Doppler onda di impulso di fare misure del flusso sanguigno. Questa modalità consente l'imaging del flusso sanguigno vascolare e la misura della velocità di flusso, tra altre variabili.</li>
		<li>Inclinare la piattaforma di analisi per abbassare l'estremità posteriore dell'animale.</li>
		<li>Modificare la posizione di angolo della scanhead in modo che metterà in contatto il gel con un angolo di circa 30° dalla parte posteriore dell'animale.</li>
		<li>Riposizionare la piattaforma animale e scanhead. Se necessario, riposizionare l'IVC e la legatura.</li>
		<li>Effettuare misure del flusso sanguigno intorno al sito di legatura per confermare lo stasis e prendere qualsiasi immagine desiderate. Misure comuni di flusso sanguigno includono velocità media, velocità di picco o velocità mediana.</li>
		<li>Salvare le misure o le immagini scattate.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Recupero di clean-up e animale
	<ol>
<li>Sollevare il scanhead per posizione iniziale e riposizionare la piattaforma animale alla posizione iniziale, come pure.</li>
		<li>Rimuovere il gel in eccesso fuori l'animale con una garza. Farlo delicatamente in modo che la sutura della ferita non sarà essere rotto.</li>
		<li>Rimuovere il termometro dal retto dell'animale e l'animale fuori dalla piattaforma.</li>
		<li>Metti l'animale nella sua gabbia e un incubatore di 34 ° C.</li>
		<li>Monitorare l'animale fino al recupero. La procedura è molto minore e non invasivo. L'animale si sveglia rapidamente. Continuare il monitoraggio degli animali nei giorni seguenti conformemente al punto 1.6 del presente protocollo.</li>
		<li>Pulire la piattaforma animale con garza e disinfettante.</li>
		<li>Pulire il scanhead con garza e acqua distillata. Attenzione: Pulire il scanhead molto delicatamente e solo con acqua distillata.</li>
		<li>Ripetere il passaggio 2 per il prossimo animale.<ol>
<li>Se fatto con tutti i soggetti, verificare che tutte le immagini e le registrazioni sono state salvate. Quindi spegnere tutte le apparecchiature e software.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ci sono diversi passaggi critici per la formazione del trombo venoso successo utilizzando il modello di stasi. Induzione di trombosi della vena è più impegnativo in vecchi topi dovuta all'accumulo di grasso che circonda la vena cava inferiore e l'aorta. Idealmente, i topi sottoposti a questa procedura dovrebbero essere 8 - 10 settimane fa. Dovrebbe prestare molta attenzione a non indurre danno endoteliale nell'IVC durante la dissezione smussa e la legatura. Inoltre, è fondamentale per mantenere l'animale in un'incubatric...

Tromboembolismo venoso (TEV), che è composto di trombosi venosa profonda (TVP) ed embolia polmonare, è la terza causa di morte cardiovascolare dopo infarto miocardico e ictus. È una condizione comune che colpisce 1-2% della popolazione, con un'incidenza annuale di 1 su 5001. VTE può portare a: 1) morte attraverso embolia polmonare; 2) post-trombotica sindrome, caratterizzata da dolore cronico alla gamba, il gonfiamento e l'ulcerazione; o 3) ipertensione polmonare cronica conseguente compromesso respiratorio cronico significativo. TEV è una malattia multi-fattoriale e può derivare da stasi del flusso sanguigno, danni alle pareti del vaso, e/o stati hypercoagulable a causa di una rottura dell'equilibrio tra la coagulazione e del sistema fibrinolitico, come è stata descritta più di cento anni fa di Virchow ed è noto come triade di Virchow.
Perché nella maggior parte dei casi è impossibile da ottenere campioni DVT umani, i ricercatori hanno sviluppato modelli sperimentali animali di DVT. Sono stati utilizzati diversi animali incluse ratto2del mouse3, coniglio4, maiale5, cane6e primate non umano7 . I topi possono essere geneticamente modificati e sono l'animale più frequentemente usato per studiare DVT. Tuttavia, come in tutti gli animali, DVT spontanea non è osservato nei topi. Pertanto, alterazioni fisiche o chimiche della parete venosa vengono utilizzate per creare trombosi nei topi. In precedenza abbiamo utilizzato il modello di cloruro ferrico per indurre trombosi nella vena cava inferiore (IVC) di topi8,9,10. Questo modello ha il vantaggio di produrre in modo affidabile gli emboli occlusivi pochi minuti e può essere utilizzato per indagare il ruolo dei farmaci anticoagulanti e antipiastrinici durante la TVP acuta. Tuttavia, è una procedura terminale. Così, per studiare la TVP acuta e cronica, il modello di stasi è più adatto. In questo modello, la formazione dell'embolo è indotta dall'interruzione completa del flusso di sangue nella VCI, uno dei fattori nella triade di Virchow per sviluppo di TVP. Questo modello può essere utilizzato per studiare la formazione di DVT e risoluzione, che è un vantaggio rispetto al FeCl3 modello11.
Abbiamo sviluppato un metodo non invasivo per seguire la formazione dell'embolo e risoluzione nel tempo utilizzando un sistema di micro-Imaging per applicazioni ad alta frequenza ultrasuoni12. Precedentemente abbiamo dimostrato che misura di trombosi venosa dall'ultrasuono correla favorevolmente con gli emboli ottenuti patologico. In due studi successivi abbiamo confermato che le misure ottenute con ultrasuoni in correlazione con l'embolo area quantificato di istochimica9,10e peso dell'embolo. Ancora più importante, abbiamo mostrato che l'ultrasuono ad alta frequenza può essere utilizzato per monitorare la formazione di trombosi venosa profonda in topi12. Può anche essere utilizzato per quantificare la risoluzione dell'embolo in modo non invasivo.
Qui, descriviamo il protocollo che consente la formazione di trombi utilizzando il modello murino di trombosi stasi-indotta e come formazione dell'embolo possa essere monitorata in modo non invasivo nel corso del tempo usando l'ultrasuono ad alta frequenza.

<table><tbody><tr><td>6-0 sutura di seta a mano permanente</td><td>Ethicon</td><td>706G</td><td></td></tr><tr><td>forbici chirurgiche</td><td>strumenti di scienze fini</td><td>20830-00</td><td></td></tr><tr><td>pinza per legatura di sutura</td><td>strumenti di scienze fini</td><td>20830-00</td><td></td></tr><tr><td>pinza smussata (diritta e curva)</td><td>strumenti di scienze fini</td><td>20830-00</td><td></td></tr><tr><td>cacciavite per aghi</td><td>strumenti di scienze fini</td><td>13002-10</td><td></td></tr><tr><td>Moria Forbici a molla</td><td>Strumenti per la scienza fine</td><td>15396-00</td><td></td></tr><tr><td>Siringhe da 1 ml BD</td><td>Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>26G aghi</td><td>Becton Dickinson & Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VEVO 770 Sistema di imaging ad alta risoluzione</td><td>Visualsonics</td><td>Non più venduto</td><td></td></tr><tr><td>SR Buprenorfina</td><td>ZooPharm</td><td></td><td>Donato a LDI da Veterinaria</td></tr><tr><td>Chirurgia Microscopia</td><td>Leica</td><td>Leica M651</td><td></td></tr><tr><td>Systan unguento per gli occhi</td><td>Alcon</td><td>288/28062-0</td><td></td></tr><tr><td>2x2 garza sterile</td><td>CDMV</td><td>#104148</td><td></td></tr><tr><td>punta di cotone Applicatori</td><td></td><td></td><td>da JGH</td></tr><tr><td>Transpore nastro chirurgico ipoallergenico</td><td>CDMV</td><td>#7411</td><td></td></tr><tr><td>Gel per ultrasuoni (Aquasonic-100)</td><td>Dufort & Lavigne</td><td>#AKEN4061</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore</td><td></td><td></td><td>da JGH</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Dispomed</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Camera anestetica, tubi flessibili e attrezzature per l'amministrazione</td><td>Dispomed</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hair Remover</td><td>Nair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cuscinetto duro riscaldato ad acqua</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>#HHP-2</td><td></td></tr><tr><td>Pompa dell'acqua di riscaldamento Gaymar TP500</td><td>MATVET Inc.</td><td>#R-500305</td><td></td></tr><tr><td>Lampada riscaldante a infrarossi</td><td>electrimat inc.</td><td>#1R175R-PAR</td><td></td></tr><tr><td>Temperatura rettale di topo prope</td><td>emkaTECHNOLOGIES</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acqua</td><td></td><td></td> sterile <td>da JGH</td></tr></tbody></table>

trombosi venosa profonda indotta dalla stasi in topi monitorati dall'ecografia ad alta frequenza

Deep Vein Thrombosis Induced by Stasis in Mice Monitored by High Frequency Ultrasonography

La trombosi venosa è una condizione comune che colpisce 1-2% della popolazione, con un'incidenza annuale di 1 su 500. Trombosi venosa profonda può condurre alla morte attraverso l'embolia polmonare o risultati nella sindrome post-trombotica, caratterizzata da dolore cronico alla gamba, il gonfiamento e l'ulcerazione, o nell'ipertensione polmonare cronica conseguente significativo cronica delle vie respiratorie compromesso. Questa è la più comune malattia cardiovascolare dopo infarto miocardico e ictus ischemico ed è una sfida clinica per tutte le discipline mediche, come può complicare il corso di altre malattie come il cancro, la malattia sistematica, chirurgia e trauma principale.
Modelli sperimentali sono necessari per lo studio di questi meccanismi. Il modello di stasi induce embolo coerente dimensione e una quantità quantificabile dell'embolo. Tuttavia, è necessario sistematicamente lega i rami laterali della vena cava inferiore per evitare la variabilità nelle dimensioni dell'embolo e qualsiasi interpretazione di dati errati. Abbiamo sviluppato una tecnica non invasiva per misurare la dimensione dell'embolo usando l'ecografia. Utilizzando questa tecnica, che possiamo valutare lo sviluppo dell'embolo e risoluzione nel tempo dello stesso animale. Questo approccio limita il numero di topi necessaria per la quantificazione di coerenza con il principio di sostituzione, riduzione e perfezionamento degli animali nella ricerca di trombosi venosa. Abbiamo dimostrato che il peso dell'embolo e l'analisi istologica di embolo dimensione correlano con la misura ottenuta con l'ecografia. Pertanto, lo studio corrente descrive come indurre trombosi profonda della vena in topi utilizzando il modello di stasi della vena cava inferiore e come monitorare utilizzando ultrasuoni ad alta frequenza.

Modello di trombosi venosa stasi
Nel modello di stasi, topi sono anestetizzati e un'incisione è fatta per esporre la vena cava inferiore (IVC). L'incisione è fatta sul lato sinistro o destro del mouse invece di una laparotomia mediana in un modo che non avrebbe interferito con la sonda di ultrasuono. I muscoli addominali e la pelle si piega indietro per esporre il IVC (Figura 1). In...

Il presente protocollo descrive la procedura per ottenere la trombosi venosa utilizzando un modello di stasi. Inoltre, stiamo utilizzando un metodo non invasivo per misurare la formazione dell'embolo e risoluzione nel tempo.

Trombosi venosa profonda indotta dalla stasi in topi monitorati dall'ecografia ad alta frequenza

Venous thrombosis is a common condition affecting 1 - 2% of the population, with an annual incidence of 1 in 500. Venous thrombosis can lead to death ...

Gli obiettivi generali di questa procedura sono indurre la trombosi venosa profonda nei topi utilizzando il modello di stasi della vena cava inferiore e monitorare i trombi utilizzando gli ultrasuoni ad alta frequenza. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della trombosi venosa su come un agente farmacologico, un gene o un tipo di cellula di interesse possono influenzare la formazione o la risoluzione dei trombi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che sia la formazione che la risoluzione dei trombi possono essere quantificate in modo non invasivo nei topi.Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando stavamo studiando come denamicare e monitorare in modo non invasivo la formazione di trombi nella vena cava inferiore dei topi. Per iniziare, usa una pinza per sollevare la pelle addominale inferiore di un topo nero C57 di 8-10 settimane. E usa le forbici chirurgiche per fare un'incisione verticale parallela a entrambi i lati della linea alba dalla linea mediana.Fai un'incisione orizzontale nella parte superiore dell'addome. Seguito da ripetute incisioni attraverso lo strato muscolare addominale. Piega la pelle e il muscolo lontano dall'incisione per esporre la cavità addominale.E posizionare una garza inumidita su entrambi i lati della ferita. Applicare una leggera pressione su entrambi i lati dell'addome per esternalizzare l'intestino sulla garza. E posizionare un secondo strato di garza inumidita sul tessuto esternalizzato.Sotto un microscopio da dissezione, spostare da parte il grasso peritoneale per esporre la vena cava interna, o IVC, tra le vene renali e iliache. E individua i rami laterali IVC. Usando una pinza, sezionare delicatamente intorno a ciascun ramo laterale per sfondare la fascia senza danneggiare i vasi circostanti.Quindi, afferra con cura il grasso attorno a un ramo per sollevare la vena. E passa un pezzo di sutura di seta da sei trattini zero sotto il vaso. Quindi utilizzare una pinza da sutura e una tecnica di legatura del nodo chirurgica standard per eseguire una legatura chirurgica con almeno tre lanci attorno al ramo laterale per occludere completamente il vaso.In alternativa, utilizzare Hemoclips. Per separare l'aorta dall'IVC, sezionare con smusso intorno e tra entrambi i vasi immediatamente distali dalla vena renale sinistra senza danneggiare nessuno dei due vasi. Quando è stata creata una finestra libera tra i vasi, passare una sezione di sutura di seta a sei trattini zero sotto l'IVC e l'aorta addominale.E usa una pinza per tirare la sutura attraverso la finestra. Utilizzando una pinza da sutura, legare l'IVC con tre lanci immediatamente distali alla vena renale sinistra per l'occlusione completa del vaso. Verificare che l'aorta addominale sia stata lasciata ininterrotta.E che tutti i rami laterali siano stati legati. L'IVC apparirà dilatato distalmente dal sito di legatura. E nessun flusso sanguigno sarà visibile.Riportare il grasso peritoneale e l'intestino nella cavità addominale. E usa una pinza per sutura e sei punti di sutura in seta dash zero per chiudere separatamente gli strati muscolari e cutanei con punti di sutura. Quindi posizionare l'animale in un'incubatrice a 34 gradi Celsius per almeno 30 minuti con monitoraggio fino al completo recupero.Posizionare il flacone di gel per ultrasuoni attraverso le bobine di un sistema di riscaldamento dell'acqua per riscaldare il gel a 37 gradi Celsius. 24 ore dopo la legatura, posizionare l'animale sulla piattaforma di analisi. E applicare il gel per elettrodi sui quattro elettrodi della piattaforma.Con l'animale in posizione supina, fissare le zampe agli elettrodi. E inserire un termometro lubrificato nel retto. Posiziona una garza sul lato dell'animale per raccogliere il gel per ultrasuoni in eccesso.Quindi applicare il gel sulla pelle esposta. E l'imaging dell'IVC secondo i protocolli standard di imaging ecografico. Utilizzando un sistema di microimaging ad alta frequenza, l'IVC può essere identificato nella vista longitudinale prima della legatura.E la velocità del flusso può essere determinata dall'imaging Doppler a onde pulsate. Immediatamente dopo la legatura, è evidente una diminuzione del flusso sanguigno. 24 ore dopo la legatura, i trombi densi possono essere visualizzati all'interno dell'IVC mediante ecografia.L'ecografia consente anche di quantificare la velocità del flusso sanguigno nei vasi. Utilizzo del Doppler colorato prima, subito dopo e 24 ore dopo la legatura. Una volta padroneggiato, il trombo può essere indotto in 30-45 minuti a seconda della presenza e del numero di rami laterali se la tecnica viene eseguita correttamente.Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di prendersi il proprio tempo e di essere precisi ma delicati nei movimenti poiché è relativamente facile rompere i vasi. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'immunofluorescenza, l'analisi istologica o la citofluorimetria per rispondere a ulteriori domande sul contenuto cellulare dei trombi o per quantificare specifiche proteine di interesse.

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Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

L'induzione elettrolitica di attivazione endoteliale sulla superficie interna della vena cava risultati in formazione tipo trombo venoso a causa di attivazione endoteliale e parziale stasi del sangue, due componenti della triade di Virchow.

Elettrolitico vena cava inferiore Model (EIM) della Trombosi Venosa

L'intero modello murino stasi di trombosi della vena cava inferiore rendimenti quantificabile quantità di tessuto della parete venosa e trombosi. Si è dimostrato utile per valutare le interazioni tra la parete venosa e il trombo occlusivo e nel valutare la progressione da acuta a cronica.

Modello del mouse completa stasi della vena cava inferiore Trombosi

Questo video mostra la tecnica di microscopia a fluorescenza intravitale per studiare la formazione di trombi in un modello murino. Al topo viene iniettato un polisaccaride marcato con fluoroforo per monitorare la circolazione sanguigna. Dopo l'illuminazione con una luce ad alta intensità, l'induzione fototossica di una lesione nella microvascolarizzazione dell'orecchio porta alla formazione di un trombo, che viene confermato visualizzando l'ostruzione nel flusso sanguigno.

Microscopia a fluorescenza intravitale per studiare la formazione di trombi microvascolari

Fonte: Kim, D., et. al. Imaging fluorescente nel vicino infrarosso combinato e tomografia microcomputerizzata per la visualizzazione diretta dei tromboemboli cerebrali. J. Vis. Exp. (2016)Questo video dimostra la visualizzazione del trombo cerebrale nei topi utilizzando l'imaging con tomografia micro-computerizzata (micro-CT). Un modello murino di trombo cerebrale viene iniettato con nanoparticelle d'oro mirate alla fibrina che fungono da agente di contrasto. Il mouse viene posizionato sul...

Visualizzazione di un trombo cerebrale in un topo mediante imaging con tomografia microcomputerizzata

Descriviamo qui stenosi nella vena cava inferiore come un modello murino di trombosi profonda della vena. Questo modello racchiude in sintesi restrizione di flusso di sangue, uno dei principali fattori scatenanti di trombosi venosa in esseri umani.

Stenosi della Vena Cava inferiore: un modello murino di trombosi venosa profonda

Una fistola aortocaval è stata creata perforando l'aorta infra-renale murina attraverso entrambe le pareti nella vena cava inferiore ed è stata seguita dalla creazione di una stenosi nel suo deflusso attraverso la legatura parziale della vena cava inferiore. Questo modello riproducibile può essere utilizzato per studiare la stenosi venosa centrale.

Modello Murine della Stenosi Venoso Centrale utilizzando Aortocaval Fistula con una stenosi di flusso

Lo scopo di questo manoscritto è quello di presentare un metodo basato sulla sonografia che consenta l'imaging in vivo del flusso sanguigno nelle arterie cerebrali nei topi. Dimostriamo la sua applicazione per determinare i cambiamenti nelle velocità del flusso sanguigno associati al vasospasmo nei modelli murini di emorragia subaracnoidea (SAH).

Analisi del vasospasmo cerebrale in un modello murino di emorragia subaracnoidea con ultrasuoni duplex transcranici ad alta frequenza

Il presente protocollo descrive un modello unico e clinicamente rilevante di arteriopatia periferica che combina l'elettrocoagulazione dell'arteria femorale e venosa con la somministrazione di un inibitore dell'ossido nitrico sintasi per indurre la cancrena degli arti posteriori nei topi FVB. La perfusione intracardiaca di DiI viene quindi utilizzata per l'imaging tridimensionale ad alta risoluzione della vascolarizzazione del footpad.

Imaging tridimensionale ad alta risoluzione della vascolarizzazione del footpad in un modello di cancrena posteriore murina

Questo protocollo descrive un metodo per monitorare la progressione dei cambiamenti morfologici nel tempo nell'utero in un modello murino inducibile di cancro dell'endometrio utilizzando l'imaging ad ultrasuoni con correlazione ai cambiamenti grossolani e istologici.

Valutazione ecografica non invasiva della progressione del cancro dell'endometrio nella delezione diretta da Pax8 dei soppressori tumorali Arid1a e Pten nei topi

Questo articolo ha lo scopo di presentare un metodo ottimizzato per la valutazione della trombosi venosa in un modello murino di cancro, utilizzando clip vascolari per ottenere la legatura venosa. L'ottimizzazione riduce al minimo la variabilità nelle misurazioni correlate alla trombosi e migliora la rilevanza per la trombosi venosa umana associata al cancro.

Test della trombosi venosa in un modello murino di cancro

I cambiamenti nel flusso sanguigno ovarico durante il periodo preovulatorio sono essenziali per l'ovulazione. L'ecografia Doppler è stata utilizzata nell'uomo e negli animali di grossa taglia per valutare l'emodinamica e la perfusione ovarica. Viene presentato un protocollo per l'applicazione dell'ecografia Doppler per valutare l'emodinamica ovarica durante le fasi preovulatorie e periovulatorie nei topi.

Ecografia Doppler per l'imaging dal vivo e la quantificazione della funzione vascolare ovarica nei topi

Impara a indurre la trombosi venosa profonda nei topi usando il modello di stasi della vena cava inferiore e monitorala con ecografia ad alta frequenza. Questo metodo non invasivo permette di quantificare la formazione e la risoluzione del trombo in vivo.

Trombosi venosa profonda indotta dalla stasi in topi monitorati dall'ecografia ad alta frequenza

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