Name: Ottimizzare lutilizzo di un Robot di manipolazione liquido per condurre un alto Throughput avanti chimica genetica schermo di Arabidopsis thaliana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-30T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: Scopri come eseguire uno screening genetico chimico ad alto throughput su Arabidopsis thaliana utilizzando un robot di manipolazione liquido. Questo metodo automatizzato consente di identificare rapidamente nuove molecole attive sulla fisiologia vegetale.

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Ringraziamo Jozsef cicogna, Mitchel Richmond, Jarrad Gollihue e Andrea Sanchez per la discussione costruttiva e critica. Dr. Sharyn Perry per le fotografie fenotipiche. Questo materiale si basa su lavori sostenuta dalla National Science Foundation sotto cooperativa contratto n. 1355438.

1. creazione di una libreria di diluizione
<ol><li>Etichetta 625 piastre di diluizione biblioteca a mano, garantendo che essi corrispondono alla loro piastra corrispondente dalla biblioteca chimica. Inoltre, connettersi in flusso e out tubi di flusso per il multicanale suggerimento lavaggio automatizzato Labware posizionatore (ALP) passando attraverso l'unità di Console per il serbatoio da 5 galloni (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Accedere al computer e accendere la pompa di lavaggio attraverso la connessione del Controller del dispositivo per il multicanale suggerimento Wash ALP al fine di far circolare l'acqua. Questo si spegne automaticamente alla fine del protocollo.</li>
	<li>Carico, a mano, il 10 di Stacker fissato al carosello Stacker, nel seguente ordine in Alberghi A - D (Figura 4, Stacker); una scatola di AP96 P20 puntali in camera 1, quattro V 96 pozzetti-piastre di fondo in camere a 2-5 con le due piastre superiore contenenti concentrazioni d'archivio dalla libreria di ordinato e le due piastre inferiore vuoto (Figura 5, impilatore). Inoltre, caricare una scatola di AP96 P20 puntali in camera 6 e quattro 96 pozzetti V-piastre inferiori nelle camere: 7-9 con le due piastre superiore contenenti concentrazioni d'archivio della biblioteca ordinata e le due piastre inferiore vuoto (Figura 5, impilatore).</li>
	<li>Istituire, a mano, il ponte con un serbatoio di acqua 300 mL su P3, un 300 mL 70% EtOH bagno il P7, suggerimento Loader ALP (TL1) e multicanale suggerimento Wash ALP (TW1) (Figura 4, Deck e Figura 5, ponte).</li>
	<li>Utilizzando il software operativo, presentare AP96 P20 puntali da 10 Stacker e spostarli all'Alpe Loader Tip. Nota: 1.5 tramite 1.12 tutte sono fatte con il liquido gestione software operativo del robot; Vedi Tabella materiali.</li>
	<li>Presentiamo 2 camera da Hotel A e separare tutti i quattro 96 pozzetti V-fondo piastre sul ponte, mettendo sul fondo due su P4 e P8 e le prime due su P5 e P9 (Figura 4).</li>
	<li>Caricare AP96 P20 puntali con il caricatore di punta ALP sulla testa con 96 canali a 200 µ l. 90 µ l del serbatoio di acqua di 300 mL di aspirare e dispensare al v 96-Well-piastra di diluizione inferiore su P4. Ripetere questo passaggio per la piastra su P8.</li>
	<li>Mescolare la piastra libreria chimica su P5 ripetutamente aspirazione e il dosaggio 15 µ l tre volte. Inoltre, aspirare 10 µ l dalla cassa della libreria chimica su P5 e Pipettare 10 µ l nella piastra diluizione su P4.</li>
	<li>Mescolare le soluzioni della piastra sul P4 da ripetutamente aspirazione e il dosaggio 50 µ l di un totale di tre volte. Una volta miscelato, pulire le punte di pipetta P20 AP96 di aspirazione e il dosaggio di 70 µ l di 70% EtOH da P7, poi lavarli in multicanale suggerimento Wash Alpe di aspirazione e il dosaggio di un 110% del volume di acqua quattro volte.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 1.8-1.9 per la seconda coppia di piastre su P8 e P9. Al momento di creare il secondo V 96-Well-piastra inferiore diluizione, stack le piastre nel seguente ordine dal basso verso l'alto: P4, P5, P8 e P9. Quindi, posizionare la risma un vuoto statico ALP; P1, P2, P6, P10, P11, P12 o P13.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 1.6-1.10 5 camera in Hotel A è vuoto. Ripetere il passaggio 1.5 su raggiungendo la camera 6, spostando nuovo AP96 P20 puntali all'Alpe Loader Tip e mettendo i puntali per pipette usate AP96 P20 su un vuoto statico ALP.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 1.6-1.10 9 camera di Hotel A è vuoto. Tuttavia, al fine di procedere all'Hotel B, le piastre e suggerimenti sul ponte devono essere ricaricati in a Hotel.</li>
	<li>A mano, ri-riempire il serbatoio di acqua di 300 mL. Questo passaggio è cruciale, e il programma del computer può incorporare una pausa dettagliare questo messaggio, che richiede l'utente a premere 'continua', prima di eseguire il passaggio successivo.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 1.5-1.13 per i rimanenti Hotel, garantendo un serbatoio dell'acqua pieno 300 mL ogni volta prima di procedere all'hotel successivo.</li>
</ol>2. aggiunta di miscela di Media-semi per piastre di Screening
<ol><li>Fare ½ Murashige e Skoog (MS) Media con 0,1% Agar con l'aggiunta di 4,3 g MS Salts, 0,50 g MES, 1,0 g Agar a 1 L DI H2O. regolare il pH a 5.7 però l'aggiunta di 5 M di idrossido di potassio durante il monitoraggio con una sonda di pH.</li>
	<li>Sterilizzare i semi agitando in 1% candeggina e SDS tra 15 e 30 min e poi lavare 4 volte con un volume uguale di acqua mediante centrifugazione. Una volta che i semi sono sterili, metterli a 4 ° C da 24 ore a 7 giorni per vernilization. Il centro di risorse biologiche di Arabidopsis descrive ulteriori metodi di sterilizzazione, vernilization e crescita22.</li>
	<li>Aggiungere i semi ai media a mano ad una densità di 0,1 g/100 mL. Questa densità si traduce in una media di 3-10 semi per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.</li>
	<li>Luogo, a mano, quattro 96 pozzetti piatto-piastre di fondo in camere 1 e 2 di Hotel A (Figura 6, A Hotel). Inserire una casella di AP96 P250 puntali sull'Alpe Loader Tip, un serbatoio 300ml riempito con la miscela di semi di media creata nei passaggi da 2.1-2.3 in P3 e un serbatoio 300 mL riempita con 70% EtOH sul P7 (Figura 4, Deck e Figura 6 Ponte). Nota: 2.5 tramite 2.8 sono fatto con il software operativo.</li>
	<li>Presentare le camere 1 e 2 in Hotel A e separare le pile di quattro piastre. Posizionare una piastra su ciascuna delle Alpi vuoto statico (P4, P5, P6, P8, P9, P10, P11 e P12). Caricare AP96 P250 puntali sulla testa con 96 canali a 200 µ l.</li>
	<li>90 µ l dal serbatoio 300ml media-seme su P3 di aspirare e dispensare nel primo appartamento di 96 pozzetti-piastra inferiore. Ripetere questo processo fino a quando tutte le otto tavole contengono la miscela di semi di media.</li>
	<li>Pulizia delle punte di pipetta P250 AP96 di aspirazione e il dosaggio di 70 µ l dal serbatoio 300 mL riempito con 70% EtOH sul P7. Lavare le punte in multicanale suggerimento lavare Alpe di aspirazione e il dosaggio di un 110% del volume di acqua quattro volte, scaricare le punte presso TL1 e raccogliere i piatti a mano.</li>
</ol>3. aggiunta di piccole molecole per piastre di Screening
<ol><li>Carico, a mano, una scatola di AP96 P250 puntali in 1 camera di Hotel A, due V 96 pozzetti-piastre inferiori del libreria di diluizione in camere da 2, 4, 6 e 8 e due 96 ben piatto-Screening piastre inferiori in camere 3, 5, 7 e 9 (Figura 4 Fascicolatore e Figura 7, un Hotel). Inoltre, collegare i tubi flessibili da e verso l'Alpe di Wash suggerimento multicanale per il serbatoio da 5 galloni. Nota: 3.2 al 3.10 sono fatto con il software operativo.</li>
	<li>Configurare il mazzo per contenere un serbatoio di lavaggio 300 mL 70% EtOH presso P7; il serbatoio di media-seme può essere lasciato sul ponte a P3 (Figura 4, Deck e Figura 7, ponte). Inoltre, accendere l'unità di Console tramite connessione del dispositivo Controller per far circolare l'acqua attraverso l'Alpe Wash suggerimento multicanale. Questo si spegne automaticamente alla fine del protocollo.</li>
	<li>Presentiamo la scatola di Tip pipetta AP96 P250 da Hotel A e spostarlo all'Alpe Loader Tip.</li>
	<li>Presentare il V 96 pozzetti-piastre di diluizione biblioteca inferiori da 2 camera di Hotel al ponte e posto uno statico ALP P4 e uno su P8. Presentare il piatto di 96 pozzetti-piastre di Screening di fondo da camera 3 di Hotel al ponte e posizionare uno statico ALP P5 e uno su P9.</li>
	<li>Caricare AP96 P250 puntali con il caricatore di punta ALP sulla testa con 96 canali a 200 µ l.</li>
	<li>Mescolare il V 96-Well-piastra di diluizione inferiore su P4 di aspirazione e il dosaggio 50 µ l tre volte. In seguito, aspirare 10 µ l da questo piatto e versare nel piatto 96-Well-piastra di Screening inferiore su P5.</li>
	<li>Mescolare le soluzioni nella piastra a P5 di aspirazione e il dosaggio 50 µ l tre volte. Pulire le punte di pipetta AP96 P250 con etanolo di aspirazione e il dosaggio di 70 µ l di 70% EtOH dal serbatoio a P7 e poi lavare i suggerimenti in multicanale suggerimento Wash Alpe di aspirazione e il dosaggio di un 110% del volume di acqua quattro volte.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 3.5 e 3.6 per il secondo V 96-Well-piastra di fondo diluizione biblioteca (P8) e 96 pozzetti piatto-piastra inferiore Screening (P9).</li>
	<li>Stack due 96 pozzetti V-piastre di diluizione biblioteca inferiori insieme e le due piastre di fondo Screening 96 pozzetti piatto insieme. Spostare le piastre statico Alpi P1, P2, P6, P10, P11, P12 o P13.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 3.4-3.9 tre volte, l'aggiunta di prodotti chimici diluiti allo screening piatti un totale di otto volte. Infine, controllare il numero di semi in ciascun pozzetto delle piastre di screening attraverso visual conformazione e integrare tali pozzetti con meno di tre semi per ulteriori seme vernalizzato e sterilizzato.</li>
</ol>4. incubazione e visualizzazione delle piastre di Screening
<ol><li>Incubare le piastre a 96 pozzetti a fondo piatto di Screening per quattro giorni in una camera climatica a 22 ° C su un ciclo luce/buio di 16/8 in un contenitore di prova di essiccazione. Visualizzare le piastre da 96 pozzetti a fondo piatto Vagli sotto un microscopio per dissezione. Registrare tutti i fenotipi aberranti per ulteriori indagini.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Questo protocollo è progettato per aiutare i ricercatori nella realizzazione di uno schermo in avanti genetica chimica su Arabidopsis. Forniamo risultati rappresentativi da uno schermo di 50.000 composti (Figura 2 e Figura 3), uno dei più grandi schermi avanti genetica chimica eseguita su Arabidopsis ad oggi9,13,23. L'utilizzo di un robot di manipolazione dei liquidi pe...

Negli ultimi 20 anni i ricercatori nel campo della biologia vegetale hanno compiuto grandi progressi utilizzando approcci di genetica chimica, sia avanti e indietro, migliorando la nostra comprensione della biosintesi della parete cellulare, il citoscheletro, la biosintesi dell'ormone e di segnalazione, gravitropismo, patogenesi, biosintesi delle purine ed endomembrane traffico1,2,3,4,5. L'impiego di tecniche di genetica chimica in avanti permettendo l'identificazione di fenotipi di interesse e permette ai ricercatori di capire i fondamenti genotipici di particolari processi. Al contrario, genetica chimica inversa Cerca prodotti chimici che interagiscono con un pre-determinata proteina bersaglio6. Arabidopsis è stato all'avanguardia di queste scoperte in biologia vegetale, perché il suo genoma è piccolo, mappato e annotati. Ha un tempo di generazione breve, e sono presenti più righe di mutante/reporter disponibili per facilitare l'identificazione di macchinari subcellulare aberrante7.
Ci sono due principali colli di bottiglia che rallentano i progressi degli schermi genetici chimici in avanti, l'iniziale processo di screening e determinare l'obiettivo del composto di interesse8. Un aiuto importante nell'aumentare la velocità di selezione piccola molecola è l'uso di apparecchiatura automatizzata9e automazione. Robot di manipolazione dei liquidi sono un ottimo strumento per la gestione delle grandi biblioteche di piccole molecole e hanno contribuito a guidare il progresso nelle scienze biologiche10. Il protocollo qui presentato è stato progettato per alleviare il collo di bottiglia associato con il processo di screening, che consentano l'identificazione di piccole molecole bioattive a ritmo veloce. Questa tecnica riduce il carico di lavoro e il tempo per conto dell'operatore, anche diminuendo il costo economico per il ricercatore di principio.
Finora, le librerie più chimiche analizzate hanno tenuto tra 10.000 e 20.000 composti, alcuni con oltre 150.000 ed alcuni con minor come 709,11,12,13,14, 15 , 16. il protocollo introdotto nel presente documento è stato implementato su una libreria piccola molecola di 50.000 composti (Vedi Tabella materiali), uno della più grande genetica chimica avanti schermi condotti su Arabidopsis fino ad oggi. Questo protocollo si adatta con l'attuale tendenza verso una maggiore efficienza e velocità per quanto riguarda la genetica chimica in avanti, soprattutto per quanto riguarda erbicida scoperta, scoperta di insetticida, fungicida scoprire, drug discovery e biologia del cancro17 ,18,19,20,21. Anche se qui implementato con Arabidopsis, questo protocollo, potrebbe facilmente essere adattato alle colture cellulari, spore e potenzialmente anche gli insetti in mezzo liquido all'interno di 96, 384- o 1536 pozzetti. Grazie alle sue piccole dimensioni, Arabidopsis è favorevole alla proiezione a 96 pozzetti. Tuttavia, distribuendo uniformemente tra pozzi è una sfida. Mano il seeding è accurata, ma ad alta intensità di manodopera, e anche se ci sono dispositivi progettati per erogare semi in piastre da 96 pozzetti, essi sono costosi da acquistare. Qui, ci mostrano come questo passaggio può essere aggirato con solo una piccola perdita in precisione.
L'obiettivo generale di questo metodo era per fare lo screening di una grande biblioteca chimica contro Arabidopsis più gestibile, senza compromettere la precisione, tramite l'utilizzo di un robot di manipolazione dei liquidi. L'utilizzo di questo metodo migliora l'efficienza del ricercatore di diminuire il tempo necessario per completare la gestione di serie di diluizione iniziale e schermate successive fenotipiche, consentendo una visualizzazione rapida dei campioni sotto un microscopio per dissezione e rapida identificazione di nuove piccole molecole bioattive. Figura 1 illustra i risultati chiave di questo protocollo in 4 passi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57393/57393fig1.jpg"> Figura 1: flusso di lavoro complessivo dello schermo in avanti genetica chimica. Una panoramica del protocollo per essere descritto con qualche dettaglio per ciascuno dei 4 passaggi chiave. 1: ricevendo la biblioteca chimica, 2: rendere la libreria di diluizione, 3: rendendo le piastre di Screening e 4: incubazione e visualizzare le piastre di Screening. <a href="/files/ftp_upload/57393/57393fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Tastiera</td><td>Provider locale</td><td>N/A</td><td>Utilizzato per la progettazione del protocollo e il funzionamento del mouse Biomek FX</td></tr><tr><td></td><td>Provider locale</td><td>N/A</td><td>Utilizzato per la progettazione del protocollo e il funzionamento dello schermo del computer Biomek FX</td></tr><tr><td></td><td>Provider locale</td><td>N/A</td><td>Utilizzato per la progettazione del protocollo e il funzionamento del computer Biomek FX</td></tr><tr><td></td><td>Provider locale</td><td>N/A</td><td>Utilizzato per la progettazione e il funzionamento del protocollo Biomek FX</td></tr><tr><td>DIVERSet Libreria di screening diversificata</td><td>ChemBridge</td><td>N/A</td><td>Libreria chimica</td></tr> Software <tr><td>Biomek</td><td>Beckman Coulter</td><td>N/A Gestisce</td><td>e progetta il controller del dispositivo Biomek FX</td></tr><tr><td></td><td>Beckman Coulter</td><td>719366</td><td>Gestisce la pompa dell'acqua/stazione di lavaggio delle punte</td></tr><tr><td>Impilatore Carosello Pendente</td><td>Beckman Coulter</td><td>148240</td><td>Funzionamento manuale di Biomek Stacker Carousel</td></tr><tr><td>Biomek Stacker Carousel</td><td>Beckman Coulter</td><td>148520</td><td>Unità rotante che ospita tutti gli FX Stacker 10's</td></tr><tr><td>FX Stacker 10</td><td>Beckman Coulter</td><td>148522</td><td>Unità di sollevamento che ospita i componenti per lo schermo</td></tr><tr><td>FX Stacker 10</td><td>Beckman Coulter</td><td>148522</td><td>Unità di sollevamento che ospita i componenti per lo schermo</td></tr><tr><td>FX Stacker 10</td><td>Beckman Coulter</td><td>148522</td><td>Unità di sollevamento che ospita i componenti per lo schermo</td></tr><tr><td>FX Stacker 10</td><td>Beckman Coulter</td><td>148522</td><td>Unità di sollevamento che ospita i componenti per lo schermo</td></tr><tr><td>Biomek FX</td><td>Beckman Coulter</td><td>https://www.beckman.com/liquid-handlers</td><td>Robot che esegue le operazioni desiderate</td></tr><tr><td>Accuframe</td><td>Artisan Technology Group</td><td>76853-4</td><td>Telaio Braccio per posizionare correttamente</td></tr><tr><td>i componenti Attrezzatura di inquadratura</td><td>Beckman Coulter</td><td>719415</td><td>Centra il braccio nell'Accuframe</td></tr><tr><td>Lavaggio multicanale delle punte ALP</td><td>Beckman Coulter</td><td>719662</td><td>Lava le punte dopo il bagno di etanolo</td></tr><tr><td>Caricatore di punte ALP</td><td>Beckman Coulter</td><td>719356</td><td>Carica pneumaticamente le punte sul braccio</td></tr><tr><td>Compressore d'aria</td><td>Fornitore</td><td>locale N/A</td><td>Fornisce aria per il caricamento pneumatico delle punte</td></tr><tr><td>Azionamento della console MasterFlex</td><td>Cole-Parmer</td><td>77200-65</td><td>Pompa utilizzata per far circolare l'acqua attraverso il tubo dell'aria della lavatrice della punta multicanale</td></tr><tr><td></td><td>Fornitore locale</td><td>N/A</td><td>Fornisce aria dal compressore d'aria al</td></tr><tr><td>tubo dell'acqua</td> del caricatore della punta <td>Fornitore locale</td><td>N/A</td><td>Fornisce acqua da 5 galloni Riserva alla rondella della punta Statico</td></tr> Il <tr><td>coltro Beckman</td> di ALP <td>viene fornito con l'attrezzatura di supporto Biomek FX</td><td>per lo schermo</td><td></td></tr><tr><td>5 galloni di riserva</td> Il <td>nostro fornitore locale</td><td>N/A</td><td>ricircola l'acqua sporca dalla pulizia delle punte</td></tr><tr><td>Pinze Beckman</td><td>Coulter</td><td>Viene fornito con le pinze Biomek FX</td><td>e sposta l'attrezzatura nei posti corretti</td></tr><tr><td>96 canali 200 &; Testa a L</td><td>Beckman Coulter</td><td>Viene fornito con Biomek FX</td><td>Contiene i 96 puntali utilizzati all'interno dello schermo</td></tr><tr><td>AP96 P200 Puntali per pipette</td><td>Beckman Coulter</td><td>717251</td><td>Utilizzato per realizzare la libreria di screening Piastra a</td></tr><tr><td>fondo piatto a 96 pozzetti</td><td>Costar</td><td>9018</td><td>Aiuta nella visulizzazione dello schermo</td></tr><tr><td>Piastra a fondo V a 96 pozzetti</td><td>Costar</td><td>3897</td><td>Aiuta nella conservazione della libreria di diluizione</td></tr><tr><td>AlumaSeal 96 Pellicola sigillante</td><td>MedSci</td><td>F-96-100</td><td>Guarnizioni per la conservazione sia della libreria chimica che della libreria di diluizione</td></tr><tr><td>Sacchetti per sandwich con chiusura lampo</td><td>in plastica Fornitore locale</td><td>N/A</td><td>Utilizzato per garantire un ambiente umido per lo schermo</td></tr><tr><td>AP96 P20 Puntali per pipette</td><td>Beckman Coulter</td><td>717254</td><td>Utilizzato nella creazione della libreria di diluizione</td></tr><tr><td>Camera di crescita</td><td>Percival</td><td>AR36L3</td><td>Germina i semi per la fenotipia visulizzazione</td></tr><tr><td>Spatola</td><td>Fornitore locale</td><td>N/A</td><td>Contiene i semi da aggiungere nei pozzi dove la semina liquida non è riuscita a seminare adeguatamente</td></tr><tr><td>Stuzzicadenti</td><td>Fornitore locale</td><td>N/A</td><td>Spinge i semi dalla spatola ai pozzi</td></tr><tr><td>Miscela di sali basali Murashige e Skoog</td><td>PhytoTechnology Laboratories</td><td>M524</td><td>Aggiungi alla miscela di terreni</td></tr><tr><td>MS Acido libero monoidrato</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN19483580</td><td>Aggiunto ai terreni MS per diminuire il pH</td></tr><tr><td>Polvere di agar</td><td>Alfa Aesar</td><td>9002-18-0</td><td>Aumenta lo spessore dei terreni per supportare la sospensione di semi</td></tr><tr><td>5M KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>484016</td><td>Aumenta il pH a livelli adeguati</td></tr><tr><td>Flacone per la conservazione dei terreni da 1 litro</td><td>Corning</td><td>1395-1L</td><td>Contiene una quantità sufficiente di terreno per uno schermo</td></tr><tr><td>Provette da centrifuga in polipropilene</td><td>Corning</td><td>431470</td><td>Sterilizza i semi prima della vernilizzazione</td></tr><tr><td>Sonda di pH</td><td>Davis Instruments</td><td>YX-58825-26</td><td>Utilizzato per la produzione di terreni</td></tr><tr><td>ALP (Automated Labware Positioners) Manuale d'uso</td><td>Coltro Beckman PN</td><td>987836</td><td>Aiuta a configurare l'attrezzatura di accompagnamento per il Biomek FX Biomek</td></tr><tr><td>Biomek 2000 Stacker Carousel Guida per l'utente</td><td>Beckman Coulter</td><td>609862-AA</td><td>Aiuta a configurare il carosello</td></tr> <tr><td>dell'impilatoreBiomek FX e FXP Workstation per l'automazione di laboratorio Manuale dell'utente</td><td>Beckman Coulter</td><td>PN 987834</td><td>Utilizzato per inquadrare il pod multicanale</td></tr><tr><td>Biomek FXP Workstation per l'automazione di laboratorio Guida all'avvio per il cliente</td><td>Beckman Coulter</td><td>PN B32335AB</td><td>Utilizzato per facilitare la configurazione del software Biomek FX</td></tr><tr><td>Biomek Manuale dell'utente</td><td>Beckman Coulter</td><td>PN 987835</td><td>Utilizzato per configurare e comprendere il Software</td></tr></tbody></table>

ottimizzare l'utilizzo di un robot di manipolazione liquido per condurre un alto throughput avanti chimica genetica schermo di arabidopsis thaliana

Optimizing the Use of a Liquid Handling Robot to Conduct a High Throughput Forward Chemical Genetics Screen of Arabidopsis thaliana

Genetica chimica sempre più è stata impiegata per decodificare tratti in piante che possono essere recalcitranti alla tradizionale genetica a causa della ridondanza genica o letalità. Tuttavia, la probabilità di una piccola molecola sintetica essendo bioactive è bassa; di conseguenza, migliaia di molecole dovrà essere testati al fine di trovare quelli di interesse. Gestione robotica sistemi sono progettati per gestire un numero elevato di campioni, aumentando la velocità con cui una biblioteca chimica può essere proiettata oltre a minimizzare/standardizzazione errore di liquidi. Per ottenere una schermata di alto-rendimento avanti genetica chimica di una biblioteca di 50.000 piccole molecole su Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), protocolli usando un liquido multicanale banco manipolazione robot sono stati sviluppati che richiedono minima coinvolgimento tecnico. Con questi protocolli, 3.271 piccole molecole sono state scoperte che ha causato alterazioni fenotipiche visibile. 1.563 composti indotto brevi radici, 1.148 composti alterate colorazione, 383 composti causati radice dei capelli e altre, non categorizzata, alterazioni e germinazione 177 composti hanno inibiti.

La capacità di esattamente ed efficientemente caratterizzare fenotipi basati sull'aggiunta di piccole molecole alle concentrazioni sotto un microscopio per dissezione di screening è l'obiettivo finale di questo metodo di inoltro genetica chimica su Arabidopsis. I fenotipi osservati quando tutti i 50.000 composti erano stati proiettati era vari e può essere suddiviso in diverse classi distinte (Figura 2). Figura 3A <stron...

Una schermata di throughput elevato di piccole molecole sintetiche è stato condotto su specie modello, Arabidopsis thaliana. Questo protocollo, sviluppato per un robot di manipolazione dei liquidi, aumenta la velocità degli schermi genetica chimica avanti, accelerando la scoperta di nuove molecole piccole che riguardano la fisiologia vegetale.

Ottimizzare l'utilizzo di un Robot di manipolazione liquido per condurre un alto Throughput avanti chimica genetica schermo di Arabidopsis thaliana

Chemical genetics is increasingly being employed to decode traits in plants that may be recalcitrant to traditional genetics due to gene redundancy or ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di eseguire uno screening genetico chimico ad alto rendimento su piantine di Arabidopsis. Con questo metodo, possiamo scoprire in modo efficiente ed efficace nuove piccole molecole che influenzano la fisiologia delle piante. Queste scoperte forniranno le basi per ulteriori studi sui processi fisiologici, come la sintesi della parete cellulare.Il vantaggio principale di questa tecnica è che decine di migliaia di piccole molecole possono essere sottoposte a screening in un breve periodo di tempo. Sebbene questo protocollo sia stato progettato per la specie vegetale modello Arabidopsis, può essere facilmente adattato ad altri organismi, come insetti, microrganismi o colture cellulari. Abbiamo avuto l'idea di questo protocollo quando abbiamo appreso che il centro genomico dell'università aveva bisogno di trovare una casa per un robot per la manipolazione dei liquidi in eccesso.Ci siamo subito offerti volontari per toglierglielo dalle mani. Preparare la libreria di diluizione e il posizionatore automatizzato da laboratorio Multichannel Tip Wash o ALP come descritto nel protocollo di testo. Caricare manualmente l'impilatore 10s collegato

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Riportiamo un metodo per l'introduzione, il monitoraggio e l'analisi quantitativa di espressione GFP nelle cellule vegetali. Questo metodo utilizza un sistema progettato su misura per la robotica semi-continua raccolta di immagini da un gran numero di campioni, nel corso del tempo. Abbiamo anche dimostrare l'uso di ImageJ e ImageReady per l'analisi delle serie di immagini.

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High-throughput screening e biopercezione con fluorescente C. elegans Ceppi

Un protocollo per l'espressione elevato throughput screening e quantitativa analitica purificazione di proteine ​​di fusione di piccoli culture Escherichia coli è descritto ed applicato alla espressione di proteine ​​bersaglio veleno animale ricchi di disolfuro.

High Throughput Screening espressione quantitativa e purificazione Applicata al ricombinante Disulfide ricchi di Venom proteine ​​prodotte in<em&gt; E. coli</em

Qui descriviamo un saggio genetico reporter basato su cellule come uno strumento prezioso per lo screening di librerie chimiche per composti che modulano i meccanismi di controllo post-trascrizionale esercitati attraverso 3' UTR.

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Una metodologia high-throughput, la produzione di protoplasti di tabacco automatizzata e la trasformazione è descritto. Il sistema robotico consente l'espressione genica massicciamente parallelo e la scoperta nel sistema modello BY-2 che dovrebbe essere traducibile di colture non-modello.

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Qui, un flusso di lavoro automatizzato per eseguire il montaggio modulare di "dispositivo" di DNA usando un metodo di assemblaggio modulare clonazione di DNA su robot di maneggio del liquido è presentato. Il protocollo utilizza uno strumento intuitivo software per la generazione di elenchi a discesa gestore liquido per combinatoria generazione della libreria dispositivo DNA, che dimostriamo utilizzando due piattaforme di gestione dei liquidi.

Automatizzato robot Liquid Handling Assembly di dispositivi modulari del DNA

Qui descriviamo un protocollo semplice per produrre rapidamente centinaia di agar media di crescita del nematode, piastre di coltura 96 pozzetti con un numero consistente di Caenorhhabditis elegans per pozzetto. Queste culture sono utili per lo screening fenotipico di interi organismi. Qui ci concentriamo sull'utilizzo di queste culture ai prodotti chimici schermo per effetti di pro-longevità.

Un metodo semplice per High Throughput Screening chimico in Caenorhabditis Elegans

Viene fornito un protocollo ad alto rendimento per la sterilizzazione superficiale dei semi di Arabidopsisthaliana (Arabidopsis), ottimizzando le fasi di movimentazione del liquido con un semplice dispositivo di aspirazione costruito con una pompa per vuoto. Centinaia di campioni di semi possono essere sterilizzati in superficie in un giorno.

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Questo protocollo fornisce un metodo per l'ottimizzazione globale sistematica di biosensori geneticamente codificati attraverso la generazione e la valutazione di librerie genetiche assistite dall'automazione. A ciò si aggiungono metodologie di progettazione dell'esperimento per semplificare la sperimentazione e consentire la selezione di componenti genetici per regolare i biosensori in base a risultati di progettazione specifici.

Campionamento efficiente dello spazio di progettazione di biosensori geneticamente codificati grazie alla progettazione di esperimenti e al flusso di lavoro di automazione

Questo protocollo presenta un flusso di lavoro standard ad alta produttività per lo screening dei microrganismi industriali. Consiste nella costruzione di una libreria mutante tramite mutagenesi ARTP, nell'esecuzione di screening positivo delle gocce con microfluidica automatizzata, e successivamente nella verifica dei risultati. L'affidabilità del flusso di lavoro è stata convalidata tramite lo screening di ceppi ad alta resa di B. coagulans .

Screening ad alta produttività dei mutanti di Bacillo coagulante iperproduttore di acido lattico L-lattico utilizzando una piattaforma microfluidica automatica a gocce

Scopri come eseguire uno screening genetico chimico ad alto throughput su Arabidopsis thaliana utilizzando un robot di manipolazione liquido. Questo metodo automatizzato consente di identificare rapidamente nuove molecole attive sulla fisiologia vegetale.

Ottimizzare lutilizzo di un Robot di manipolazione liquido per condurre un alto Throughput avanti chimica genetica schermo di Arabidopsis thaliana (Video) | JoVE Journal

Ottimizzare l'utilizzo di un Robot di manipolazione liquido per condurre un alto Throughput avanti chimica genetica schermo di Arabidopsis thaliana

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