Ottimizzare l'utilizzo di un Robot di manipolazione liquido per condurre un alto Throughput avanti chimica genetica schermo di Arabidopsis thaliana
30 aprile 2018
Una schermata di throughput elevato di piccole molecole sintetiche è stato condotto su specie modello, Arabidopsis thaliana. Questo protocollo, sviluppato per un robot di manipolazione dei liquidi, aumenta la velocità degli schermi genetica chimica avanti, accelerando la scoperta di nuove molecole piccole che riguardano la fisiologia vegetale.
L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di eseguire uno screening genetico chimico ad alto rendimento su piantine di Arabidopsis. Con questo metodo, possiamo scoprire in modo efficiente ed efficace nuove piccole molecole che influenzano la fisiologia delle piante. Queste scoperte forniranno le basi per ulteriori studi sui processi fisiologici, come la sintesi della parete cellulare.
Il vantaggio principale di questa tecnica è che decine di migliaia di piccole molecole possono essere sottoposte a screening in un breve periodo di tempo. Sebbene questo protocollo sia stato progettato per la specie vegetale modello Arabidopsis, può essere facilmente adattato ad altri organismi, come insetti, microrganismi o colture cellulari. Abbiamo avuto l'idea di questo protocollo quando abbiamo appreso che il centro genomico dell'università aveva bisogno di trovare una casa per un robot per la manipolazione dei liquidi in eccesso.
Ci siamo subito offerti volontari per toglierglielo dalle mani. Preparare la libreria di diluizione e il posizionatore automatizzato da laboratorio Multichannel Tip Wash o ALP come descritto nel protocollo di testo. Caricare manualmente l'impilatore 10s collegato al carosello dell'impilatore.
Negli hotel da A a D, caricare prima una scatola di puntali per pipette AP96 P20 nella sala uno. Quindi, caricare quattro piastre con fondo a V da 96 pozzetti nelle stanze da due a cinque con due piastre superiori contenenti le concentrazioni di stock dalla libreria ordinata e le altre due piastre inferiori vuote. Inoltre, caricare una scatola di puntali per pipette AP96 P20 nella sala sei.
Caricare quattro piastre con fondo a V a 96 pozzetti nelle stanze da sette a nove con le due piastre superiori contenenti le concentrazioni di stock della libreria ordinata e le due piastre inferiori vuote. Prepara il piatto con 300 millilitri di acqua nel serbatoio su P3, un bagno di etanolo al 70% da 300 millilitri su P7, il Tip Loader ALP e il Multichannel Tip Wash ALP. Utilizzando il software operativo del robot per la manipolazione dei liquidi, presentare i puntali per pipette AP96 P20 dello Stacker 10 e spostarli nel caricatore di puntali ALP.
Presenta la sala due dell'Hotel A e separa tutte e quattro le piastre con fondo a V a 96 pozzetti sul ponte, posizionando le due inferiori su P4 e P8 e le due superiori su P5 e P9. Caricare i puntali per pipette AP96 P20 con il caricatore di puntali ALP sulla testina a 96 canali da 200 microlitri. Aspirare 90 microlitri dal serbatoio dell'acqua da 300 millilitri ed erogare nella piastra di diluizione con fondo a V a 96 pozzetti su P4. Ripetere il passaggio per la piastra su P8. Miscelare la piastra della libreria chimica su P5 aspirando ed erogando ripetutamente 15 microlitri tre volte. Inoltre, aspirare 10 microlitri dalla piastra della libreria chimica su P5 ed erogare 10 microlitri nella piastra di diluizione su P4. Miscelare le soluzioni della piastra su P4 aspirando ed erogando ripetutamente 50 microlitri per un totale di tre volte.
Una volta miscelati, pulire i puntali delle pipette AP96 P20 aspirando ed erogando 70 microlitri di etanolo al 70% da P7, quindi lavarli nel Multichannel Tip Wash ALP aspirando ed erogando quattro volte un volume d'acqua al 110%. Ripetere questi passaggi per la seconda coppia di piastre su P8 e P9. Dopo aver creato la seconda piastra di diluizione V-bottom a 96 pozzetti, impilare le piastre P9, P5, P8 e P4 in quest'ordine dal basso verso l'alto. Quindi, posizionare la pila su un ALP statico vuoto.
Utilizzare P1, P2, P6, P10, P11, P12 o P13. Ripetere questi passaggi fino a quando la sala cinque dell'hotel A non è vuota, quindi riavviare il processo una volta raggiunta la sala sei, spostando i nuovi puntali per pipette AP96 P20 sul caricatore di puntali ALP e posizionando i puntali per pipette AP96 P20 usati su un ALP statico vuoto. Ripetere la procedura fino a quando la camera 9 dell'Hotel A non sarà vuota.
Per procedere verso l'Hotel B, le piastre e le punte sul ponte devono essere ricaricate nell'Hotel A. Sebbene il robot possa lavorare senza supervisione, è necessario riempire il serbatoio dell'acqua dopo ogni ciclo di diluizione. Se il ciclo riprende con acqua insufficiente, il robot aspirerà l'aria e le sostanze chimiche non verranno diluite. Riempire manualmente il serbatoio dell'acqua da 300 millilitri.
Il programma per computer può incorporare una pausa che descrive in dettaglio questo messaggio, richiedendo all'utente di premere Continua prima di eseguire il passaggio successivo. Ripetere i passaggi di diluizione per i restanti tre hotel. Aggiungere manualmente i semi al terreno di coltura a una densità di 0,1 grammi per 100 millilitri.
Questa densità si traduce in una media di 3-10 semi per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Posizionare manualmente quattro piastre a fondo piatto da 96 pozzetti nelle sale uno e due dell'Hotel A.Posizionare una scatola di puntali per pipette AP96 P250 sul caricatore di puntali ALP, un serbatoio da 300 millilitri riempito con la miscela di terreni e semi su P3 e un serbatoio da 300 millilitri riempito con etanolo al 70% su P7. Utilizzando il software operativo, presentare le sale uno e due dell'hotel A e separare le pile di quattro piatti. Posizionare una piastra su ciascuna delle ALP statiche vuote, quindi caricare i puntali per pipette AP96 P250 sulla testa a 96 canali da 200 microlitri.
Aspirare 90 microlitri dal serbatoio del seme da 300 millilitri su P3 ed erogarlo nella prima piastra a fondo piatto da 96 pozzetti. Ripeti questo processo fino a quando tutte e otto le piastre contengono la miscela di semi. Pulire i puntali delle pipette AP96 P250 aspirando ed erogando 70 microlitri dal serbatoio da 300 millilitri riempito con etanolo al 70% su P7. Lavare i puntali nel Multichannel Tip Wash ALP aspirando ed erogando quattro volte un volume d'acqua del 110%, quindi scaricare i puntali a TL1.
Infine, raccogli i piatti a mano. Caricare manualmente una scatola di puntali per pipette AP96 P250 nella sala uno dell'Hotel A.Inoltre, caricare due piastre per librerie di diluizione con fondo a V da 96 pozzetti nelle stanze due, quattro, sei e otto. Caricare due piastre di screening a fondo piatto a 96 pozzetti nelle stanze tre, cinque, sette e nove.
Utilizzando il software operativo, configurare il piatto in modo che contenga un serbatoio di lavaggio di 300 millilitri di etanolo al 70% a P7. Il serbatoio del seme può essere lasciato sul ponte a P3. Inoltre, accendere l'azionamento della console tramite il collegamento del controller del dispositivo per far circolare l'acqua attraverso il Multichannel Tip Wash ALP. Questo si spegnerà automaticamente al termine del protocollo. Presentare la scatola dei puntali per pipette AP96 P250 dell'Hotel A e spostarla nel caricatore di puntali ALP.
Successivamente, presenta le piastre della libreria di diluizione con fondo a V a 96 pozzetti dalla sala due dell'hotel A al ponte. Posizionare una piastra sull'ALP statico P4 e una piastra su P8. Quindi, presentare le piastre di vagliatura a fondo piatto a 96 pozzetti dalla sala tre dell'Hotel A al ponte. Posizionare una piastra sull'ALP statico P5 e una su P9. Caricare i puntali per pipette AP96 P250 con il caricatore di puntali ALP sulla testina a 96 canali da 200 microlitri.
Miscelare la piastra di diluizione V-bottom a 96 pozzetti su P4 aspirando ed erogando 50 microlitri tre volte. Successivamente, aspirare 10 microlitri da questa piastra ed erogare nella piastra di screening a fondo piatto a 96 pozzetti su P5. Miscelare le soluzioni nella piastra a P5 aspirando ed erogando 50 microlitri tre volte. Pulire i puntali delle pipette AP96 P250 con etanolo aspirando ed erogando 70 microlitri di etanolo al 70% dal serbatoio a P7. Quindi, lavare le punte nel Multichannel Tip Wash ALP aspirando ed erogando quattro volte un volume d'acqua del 110%.
Ripetere questi passaggi per la seconda piastra della libreria di diluizione con fondo a V a 96 pozzetti e la piastra di screening a fondo piatto a 96 pozzetti. Impilare insieme le due piastre della libreria di diluizione con fondo a V a 96 pozzetti e le due piastre di screening a fondo piatto con 96 pozzetti. Spostare le piastre sulle ALP statiche.
Quindi, ripetere il processo tre volte, aggiungendo sostanze chimiche diluite alle piastre di vagliatura per un totale di otto volte. Infine, controllare il numero di semi in ciascun pozzetto delle piastre di vagliatura attraverso la conferma visiva. Integrare i pozzetti con meno di tre semi con l'aggiunta di semi sterilizzati e vernalizzati.
È fondamentale assicurarsi che il substrato in cui crescono le piantine non si secchi, poiché ciò si tradurrà in una scarsa germinazione. I piatti contenenti piantine devono essere conservati ad alta umidità o conservati in contenitori resistenti all'essiccazione. Incubare le piastre di screening a fondo piatto a 96 pozzetti per quattro giorni in una camera ambientale a 22 gradi Celsius con un ciclo luce/buio 16/8 in un contenitore a prova di essiccazione.
Visualizza le piastre di screening a fondo piatto a 96 pozzetti al microscopio da dissezione e registra tutti i fenotipi aberranti per ulteriori indagini. Esempi di fenotipi normali e aberranti sono l'assenza di anomalie morfologiche visibili, i peli castani delle radici, la radice rachitica, la radice gravemente rachitica, la mucillagine sbiancata e verde, la germinazione incompleta e l'assenza di germinazione. I fenotipi visibili in percentuale vengono visualizzati in un grafico a torta.
Le piantine mostravano anomalie nella morfologia delle radici, nella pigmentazione, nei peli delle radici e nella germinazione. Sono inclusi anche una varietà di altri, che includono la produzione di mucillagini verdi. Una volta padroneggiata, questa tecnica può aumentare notevolmente l'efficienza e l'accuratezza di grandi screening genetici chimici in avanti.
Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di sterilizzare e vernalizzare i semi, riempire nuovamente il serbatoio dell'acqua durante le fasi di diluizione, assicurarsi che i campioni siano conservati in contenitori resistenti all'essiccazione e che tutte le immagini vengano eseguite in piastre a fondo piatto. A seconda del processo fisiologico che si desidera indagare, questa schermata iniziale può essere seguita da ulteriori saggi per aiutare a determinare la modalità d'azione di ciascuna sostanza chimica. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare un robot per la manipolazione dei liquidi per migliorare l'efficienza e l'accuratezza di uno screening genetico chimico.
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Panoramica
Questo protocollo delinea uno screening chimicogenetico forward ad alto rendimento progettato per piantine di Arabidopsis. Permette la rapida scoperta di nuove piccole molecole che influenzano la fisiologia delle piante.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Fisiologia delle piante
- Genetica chimica
- Screening ad alto rendimento
Sfondo
- Arabidopsis thaliana è un organismo modello nella ricerca sulle piante.
- Lo screening ad alto rendimento accelera l'identificazione di composti biologicamente attivi.
- Questo protocollo utilizza un robot per la manipolazione dei liquidi per l'efficienza.
- Le scoperte possono portare a intuizioni su processi fisiologici come la sintesi della parete cellulare.
Scopo dello studio
- Effettuare uno screening ad alto rendimento per piccole molecole che influenzano la fisiologia delle piante.
- Fornire una base per ulteriori studi fisiologici.
- Adattare il protocollo per l'uso in altri organismi.
Metodi utilizzati
- Screening ad alto rendimento di piccole molecole sintetiche.
- Utilizzo di un robot per la manipolazione dei liquidi per l'automazione.
- Screening di decine di migliaia di composti in un breve arco di tempo.
- Applicazione dei risultati a vari sistemi biologici.
Risultati principali
- Identificazione di nuove piccole molecole che influenzano la fisiologia delle piante.
- Efficienza dimostrata del protocollo nello screening di grandi librerie di composti.
- Potenziale di adattamento ad altri contesti biologici.
- Fondazione gettata per future ricerche su processi fisiologici specifici.
Conclusioni
- Il protocollo accelera significativamente la scoperta di composti biologicamente attivi.
- Offre un approccio versatile applicabile a vari organismi.
- Studi futuri possono basarsi sui risultati per esplorare ulteriormente la fisiologia delle piante.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
High-throughput forward chemical genetics screening enables rapid interrogation of phenotypic space in model organisms, supporting early target validation and mechanistic de-risking in discovery pipelines. Automating compound delivery via liquid handling robotics increases throughput, reproducibility, and scalability while reducing manual error, directly addressing the low hit-rate challenge in synthetic library screening. This approach accelerates lead identification by generating quantitative, reproducible phenotypic readouts that inform go/no-go decisions and portfolio triage in preclinical research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables systematic interrogation of biological pathways through phenotype-driven small molecule discovery, supporting target hypothesis testing and functional validation.
- Operational Value: Reduces false-negative rates by screening large compound libraries efficiently, increasing confidence in target engagement and mechanism of action.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, dose-responsive phenotypic data suitable for assay standardization and hit confirmation in secondary screens.
- Operational Value: Ensures reproducible compound dilution and transfer across 96-well formats, minimizing well-to-well variability and enhancing data reliability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides a disease-relevant system for evaluating compound effects on conserved physiological processes, supporting translational biomarker alignment.
- Operational Value: Facilitates seamless transition from primary screening to mechanistic follow-up assays through standardized plate formats and storage-compatible outputs.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling high-content phenotypic screening that informs lead identification and preclinical advancement decisions through reproducible, scalable compound evaluation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-free screening to uncover novel bioactive compounds affecting plant physiology, providing a foundation for pathway elucidation and target de-risking.
- Screening: Delivers assay-ready plates with consistent compound concentrations and seedling densities, enabling reliable compound evaluation across large libraries.
- Analytics: Produces quantifiable phenotypic outputs (e.g., root length, coloration, germination rates) that support statistical analysis and hit prioritization.
- Translational Research: Establishes continuity from discovery to preclinical validation by linking phenotypic hits to physiological processes such as cell wall synthesis.
- Enterprise Reuse: Configurable for multiple organism systems, positioning the liquid handling workflow as a reusable platform across discovery campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through large-scale phenotypic screening.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability via automated liquid handling, minimizing technician-dependent variability.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling rapid screening of tens of thousands of compounds, reducing time-to-hit and early-stage attrition.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by generating high-volume, reproducible phenotypic data for informed advancement decisions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in liquid handling robot programming, plate stacking, and tip management to ensure proper dilution and transfer accuracy.
- Depends on access to a bench-top multichannel liquid handling robot with compatible software and automated labware positioners (ALPs) for tip washing and loading.
- Necessitates cross-team standardization of seed preparation, media formulation, and incubation conditions to maintain assay consistency across runs.
- Involves adaptation considerations when transferring the protocol to non-Arabidopsis systems, including seed density, media composition, and phenotypic readout optimization.
- Includes practical limitations such as the need for manual reservoir refills during dilution cycles and visual phenotype confirmation under microscopy, which may limit full automation.
