Puntura-indotta di Neovascularization dell'iride come un modello murino di Rubeosis Iridis
8 marzo 2018
Neovascularization dell'iride, una complicazione comune della malattia della retina ischemica, può portare ad avvistare-minaccioso il glaucoma neovascular. Qui, descriviamo un protocollo murino per indurre il neovascularization iris sperimentali che possono essere utilizzati per la valutazione non invasiva delle sostanze l'angiogenesi di modulazione.
L'obiettivo generale di questa procedura è indurre la vascolarizzazione dell'iride, che consente la visualizzazione diretta in vivo dei processi angiogenici. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'oftalmologia, in particolare nelle malattie neovascolari. Il vantaggio principale di questa tecnica è che utilizza topi albini per consentire la visualizzazione diretta in vivo dei vasi sanguigni.
Attraverso questo metodo può dare un'idea della malattia neovascolare oculare. Può anche essere applicato come modello generale di angiogenesi, come test per nuove terapie angiogeniche. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché la dissezione dell'iride è impegnativa a causa delle piccole dimensioni dell'occhio del topo.
Con la pratica, tuttavia, può essere padroneggiato. Dopo aver anestetizzato un topo P12.5 e averlo preparato per la procedura, metterlo in posizione di decubito laterale sotto uno stereoscopio e verificare che la maschera sia ben posizionata. L'occhio dovrebbe riempire il campo visivo.
Una chiara messa a fuoco dell'occhio è fondamentale. Successivamente, utilizzando una piccola pinza di legatura nella mano non dominante, sporgere con cautela l'occhio applicando una pressione verso il basso sulle palpebre, dorsale e ventrale sull'occhio. Mantenere una presa salda sulla palpebra aiuta.
Prima di procedere, fotodocumentare la vascolarizzazione a 40X. Quindi, usa lo stereoscopio per localizzare il limbus corneale. Il limbus dei topi albini BALB/c può essere facilmente identificato come il plesso vascolare circolare posteriore alla cornea.
Ora, nella mano dominante, impugnare un ago smussato calibro 30 e utilizzarlo per eseguire una piccola puntura uveale in prossimità del limite limbare posteriore dell'uvea tra il corpo ciliare e l'ora serrata. Effettuare la puntura utilizzando solo la punta dell'ago e non più della metà dello smusso. Evitare di rompere l'obiettivo.
La puntura deve essere autosigillante ma consentire comunque l'iniezione intraoculare delle sostanze in studio attraverso la ferita. Successivamente, eseguire una seconda puntura uveale nel sito opposto dell'occhio. Ottimizza le punture in modo che siano nelle posizioni più dorsali e più ventrali.
Ripetere le punture uveali nelle stesse due posizioni ogni quattro giorni fino a P24.5. E prima di ripetere la puntura, controllare sempre la presenza di cataratta traumatica. Dopo aver enucleato l'occhio e averlo fissato come descritto nel protocollo di testo, rimuovere la soluzione fissativa e sciacquare l'occhio tre volte con PBS fresco.
Quindi, posizionare l'occhio su una superficie liscia e asciutta con la camera anteriore rivolta verso l'alto. Quindi, inserire un ago smussato calibro 30 posteriormente al limbus per creare un punto di ingresso. Quindi, fissare il segmento anteriore con una piccola pinza da legatura e utilizzare le forbici dritte Clayman-Vannas per tagliare intorno al limbus ruotando l'occhio.
L'uso di tagli parziali può semplificare il processo. Una volta completato, il segmento posteriore dell'occhio dovrebbe rilasciarsi. Quindi, posizionare il segmento anteriore verso il basso per esporre la lente.
Rimuovere la lente con cautela afferrandola con una piccola pinza e tirandola verso l'alto. Ora, posiziona il segmento anteriore con la cornea rivolta verso il basso e con il taglio perpendicolare al campo visivo. Quindi, afferrare delicatamente il tessuto posteriormente al corpo ciliare usando una piccola pinza di legatura nella mano non dominante.
Forbici diritte di Clayman-Vannas per tagliare appena anteriormente al corpo ciliare con l'obiettivo di rimuovere la rete trabecolare e isolare l'iride. L'iride dovrebbe quindi muoversi all'interno della cornea. Quindi, utilizzare una piccola pinza da legatura per afferrare la cornea e trasferire con cura la coppa oculare anteriore in una piastra a 96 pozzetti contenente 200 microlitri di PBS.
Mantenere la presa sulla cornea e continuare a sezionare l'iride lavando il tessuto con PBS. Se necessario, è possibile utilizzare un ago calibro 30 per aiutare a spostare l'iride. Ora, rimuovi la cornea usando la piccola pinza da legatura.
L'iride isolata può quindi essere conservata temporaneamente in PBS a quattro gradi Celsius fino a quando non viene sperimentata. I topi albini BALB/c a P12.5 sono stati sottoposti a punture uveali ripetute ogni quattro giorni fino a P24.5, come descritto. A causa della trasparenza della cornea e della carenza di melanina dei topi BALB/c, la vascolarizzazione dell'iride è facilmente visibile nei cuccioli di P16.5 e si intensifica per tutta la durata del protocollo.
A P27.5, i topi sono stati soppressi e le loro iridi sono state accuratamente sezionate. Le punture hanno indotto una risposta vascolare dall'iride innescando il sistema di guarigione della ferita. L'immunoistochimica è stata eseguita contro PECAM1.
La colorazione risultante ha mostrato un aumento della vascolarizzazione complessiva nelle iridi degli occhi perforati rispetto ai controlli. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come indurre l'angiogenesi dell'iride e isolare con successo l'iride del topo. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la QBCR per rispondere a ulteriori domande molecolari e cellulari, come testare l'efficacia di sostanze pro-angiogeniche o anti-angiogeniche.
Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori per esplorare le malattie neovascolari con metodi in-vivo e non invasivi utilizzando piccoli roditori come modello.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo murino per indurre la neovascolarizzazione dell'iride, una condizione associata alle malattie retiniche ischemiche e al glaucoma neovascolare. Il metodo consente la valutazione non invasiva di sostanze che modulano l'angiogenesi mediante visualizzazione diretta in vivo della vascolarizzazione dell'iride.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Oftalmologia
- Angiogenesi
- Malattie neovascolari
Sfondo
- La neovascolarizzazione dell'iride può minacciare la vista.
- Comprendere l'angiogenesi è fondamentale per lo sviluppo di terapie.
- L'uso di topi albini facilita la visualizzazione dei vasi sanguigni.
- Esistono difficoltà nella dissezione dell'iride a causa delle piccole dimensioni dell'occhio del topo.
Scopo dello studio
- Indurre la vascolarizzazione dell'iride per studi in vivo.
- Fornire informazioni sulle patologie neovascolari oculari.
- Testare nuove terapie angiogeniche.
Metodi Utilizzati
- Induzione di neovascolarizzazione dell'iride in topi albini.
- Tecniche di visualizzazione in vivo.
- Valutazione sperimentale di sostanze modulatrici dell'angiogenesi.
- Dimostrazione delle tecniche di dissezione dell'iride.
Risultati principali
- Induzione riuscita della neovascolarizzazione dell'iride.
- Visualizzazione efficace dei processi angiogenetici.
- Conoscenze acquisite sui meccanismi delle malattie neovascolari.
- Applicazioni potenziali per la sperimentazione di nuove terapie.
Conclusioni
- Il metodo fornisce uno strumento prezioso per lo studio della neovascolarizzazione dell'iride.
- Migliora la comprensione delle patologie neovascolari oculari.
- La ricerca futura potrà utilizzare questo modello per la sperimentazione terapeutica.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo modello consente una valutazione non invasiva e longitudinale dei processi angiogenetici nell'iride, supportando la validazione precoce di bersagli terapeutici per le terapie antiangiogenetiche. Sfruttando la trasparenza degli occhi di topo albino, fornisce una piattaforma scalabile per valutare modulatori dell'angiogenesi in un contesto oculare rilevante per la malattia. L'approccio riduce la dipendenza dall'istologia terminale e migliora la sicurezza predittiva nei test preclinici di angiogenesi.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente lo studio dei percorsi angiogenetici mediante neovascolarizzazione iridea indotta da sistemi infiammatori e attivatori del plasminogeno.
- Valore operativo: Supporta la validazione funzionale degli obiettivi attraverso punture uvealiche ripetibili e autostabilizzanti che innescano una risposta vascolare misurabile.
- Valore predittivo: Facilita la riduzione del rischio meccanicistico permettendo la visualizzazione diretta in vivo della modulazione dell'angiogenesi nel tempo.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Fornisce un riscontro quantificabile dell'angiogenesi mediante immunohistochimica per PECAM1 e imaging non invasivo in vivo attraverso la cornea trasparente.
- Valore operativo: Permette un'induzione vascolare standardizzata e ripetibile ogni quattro giorni da P12,5 a P24,5, favorendo la riproducibilità del saggio.
- Valore di scalabilità: Compatibile con la preparazione in flatmount di iridi semitrasparenti di BALB/c per analisi immunohistochimiche ad alta risoluzione con basso fondo.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore traslazionale: Modella la patogenesi del glaucoma neovascolare, una complicanza minacciosa per la vista della retinopatia diabetica, aumentando la rilevanza della malattia.
- Continuità preclinica: Permette la sperimentazione in vivo di sostanze pro- o anti-angiogeniche, collegando la scoperta alla valutazione terapeutica.
- Progressione basata sul rischio: Consente il monitoraggio longitudinale della risposta vascolare, supportando decisioni di avanzamento o interruzione basate sull'efficacia angiogenica.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta dell'angiogenesi, dall'analisi dell'ipotesi sul bersaglio alla validazione preclinica dell'efficacia di modulatori, in particolare nei programmi sulle malattie neovascolari oculari.
- Biologia della scoperta: Supporta la chiarificazione dei percorsi biologici inducendo l'angiogenesi attraverso la guarigione delle ferite e stimoli infiammatori nell'iride.
- Screening: Fornisce output vascolari quantitativi e riproducibili, adatti allo screening di sostanze angiogeniche in un contesto di tessuto vivente.
- Analisi: Permette l'analisi della densità e della morfologia dei vasi mediante colorazione per PECAM1 e imaging in vivo, facilitando la valutazione comparativa delle condizioni.
- Ricerca traslazionale: Modella i meccanismi del glaucoma neovascolare umano, supportando la validazione preclinica allineata ai biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile di induzione vascolare applicabile a diversi progetti incentrati sull'angiogenesi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia nell'obiettivo modellando la neovascolarizzazione dell'iride simile a quella umana, guidata da vie angiogeniche conservate.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità attraverso la standardizzazione dei tempi di perforazione, della selezione del sito e del monitoraggio postoperatorio per la cataratta traumatica.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo letture precoci ed efficaci non invasive che riducono il rischio di insuccesso nelle fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione corretta rispetto al rischio dei candidati angiogenici in base alla risposta vascolare dell'iride in vivo.
Considerazioni relative all'implementazione
- Richiede competenze nelle tecniche microchirurgiche, inclusi il punzionamento uveale e l'isolamento dell'iride sotto guida stereoscopica.
- È dipendente da strumentazione specifica, come aghi smussati da 30 gauge, pinze da annodatura e forbici di Clayman-Vannas, per una manipolazione precisa dei tessuti.
- Necessita di protocolli standardizzati per il momento del punzionamento (ogni 4 giorni da P12,5 a P24,5) e per il monitoraggio postoperatorio, al fine di garantire la coerenza del modello.
- Le considerazioni per l'adattamento includono le variazioni nella pigmentazione del ceppo murino e nella trasparenza corneale, che influiscono sulla qualità della visualizzazione vascolare.
- I limiti pratici comprendono la difficoltà tecnica della dissezione dell'iride a causa delle ridotte dimensioni dell'occhio, richiedendo un adeguato addestramento per un isolamento affidabile del tessuto.
