Name: Isolamento di cellule endoteliali umane da Colon normale e Carcinoma colorettale - un protocollo migliorato (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: Scopri un protocollo migliorato per isolare cellule endoteliali pure e vitali da tessuti di carcinoma colorettale e colon normale. Questo metodo facilita la ricerca sull'angiogenesi tumorale e i test farmacologici.

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Ringraziamo Christian Flierl, Katja Petter, Christina Schnürer (divisione di molecolare e chirurgia sperimentale), Uwe Appelt, Michael Mroz (Core unità FACS-ordinamento) e Simon Völkl (Core unità FACS-Immunomonitoring) per l'eccellente assistenza tecnica. Quest'opera è stata sostenuta da sovvenzioni a EN/MS del centro interdisciplinare per la ricerca clinica (IZKF) della University Medical Center Erlangen, German Research Foundation (DFG: per 2438, SP2) e Lutz-Stiftung, da una sovvenzione della Fondazione Robert-Pfleger-Stiftung a VSS, come pure di sovvenzioni conferite a MS da German Research Foundation [DFG: KFO257 (sottoprogetto 4), SFB 796 (Sub-progetto B9)].

Il processo di isolamento è stato approvato dal comitato etico locale della University Medical Center Erlangen (n. 159_15 B, TuMiC-Studio). Criteri di inclusione paziente erano come segue: CRC, UICC tappa-IV, senza la storia della malattia di viscere infiammatoria e nessun trattamento neoadiuvante.
1. chirurgia e preparazione di tessuti per isolamento di singole cellule
<ol><li>Ottenere campioni di chirurgia da un paziente CRC (tessuto di carcinoma > 0,5 g, centrali del tumore non-necrotici; tessuto normale del colon > 10 cm distanti dal sito del tumore).</li>
	<li>I pezzi di tessuto ottenuti sono per lo più < 1 g per il carcinoma, ma > 1 g per il colon normale. Se pezzi > 1G sono ottenuti, dividerli in più parti di 1g usando un bisturi fresco per un'ulteriore elaborazione del tessuto. Nota: Se il pezzo di tessuto del tumore è inferiore a 0,5 g fin dall'inizio, l'isolamento di solito non riesce.</li>
	<li>Raccogliere freschi non fissati pezzi di tessuto usando pinze sterili in 40 mL di ghiaccio freddo Hanks equilibrata soluzione salina (HBSS) completati con penicillina/streptomicina/amphothericin B (1% HBSS-penna/mal/ampho) in provette da centrifuga da 50 mL e trasferirli rapidamente alla laboratorio. Nota: Tessuto dei due punti è spesso altamente contaminato con batteri/funghi fin dall'inizio. Durante l'intera procedura di isolamento, penna/mal/ampho deve essere aggiunto a tutte le soluzioni al fine di eliminare microrganismi contaminanti.</li>
	<li>Lavare ogni pezzo di tessuto almeno 4 volte con 40 mL di ghiaccio freddo HBSS-penna/mal/ampho (Vedi punto 1.3) in provette da centrifuga da 50 mL trasferendo i pezzi di tessuto in sequenza da una provetta per il tubo successivo utilizzando pinze sterili.<ol>
<li>Forcipe pulito dopo ogni passaggio con etanolo al 70%.</li>
		<li>Utilizzare pinze separate per il carcinoma e pezzi di tessuto normale del colon.</li>
		<li>Pesare tutti i pezzi di tessuto. Nota: Non mettere pezzi di tessuto direttamente su una scala per la pesatura. Dopo il lavaggio, pesare l'ultima provetta da centrifuga contenente il tessuto prima e dopo aver inserito i pezzi di tessuto. Calcolare il peso dei pezzi di tessuto per sottrazione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. generazione di sospensione unicellulare
Nota: Si consiglia di mantenere il tessuto idratato in ogni momento.
<ol><li>Se presente, rimuovere grasso allegata, altri tessuti non tumorali o parti di tessuto necrotico potenzialmente dall'esemplare chirurgia trasferendo i pezzi di tessuto in una capsula di Petri sterile cella cultura utilizzando pinze sterili.<ol>
<li>Tenere i pezzi di tessuto idratati a tutte le volte con l'aggiunta di 3-5 mL di HBSS-penna/mal/ampho.</li>
		<li>Tagliare i pezzi di tessuto usando un bisturi sterile fresco (Figura 1). Consultare un patologo in caso di identificazione di tessuto è poco chiaro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tritare il tessuto restante in piccoli pezzi (circa 2 × 2 × 2 mm3) usando un bisturi fresco con una lama curva. Trasferimento di pezzi di tessuto con pinze sterili in provette di dissociazione del tessuto (ad esempio, tubi di gentleMACS C) pre-riempite con pre-riscaldata (37 ° C) medium di coltura cellulare (Dulbecco´s modified eagle [DMEM] basale Media) secondo il produttore istruzioni. Nota: Provare a utilizzare il bisturi come uno strumento a dondolo. Non strizzare le cellule al fine di evitare danni ai tessuti.</li>
	<li>Digest/dissociare pezzi tessuto utilizzando un dissociatore di tessuto (come gentleMACS Octo dissociatore) in combinazione con il kit di dissociazione del tumore per tessuto umano utilizzando le istruzioni del programma "37C_h_TDK_1" seguendo il possible.</li>
	<li>Centrifugare le provette di dissociazione per 1 min a 300 x g a temperatura ambiente (TA).</li>
	<li>Aggiungere 10 mL di pre-riscaldato (37 ° C) DMEM completate con 0,5% siero bovino fetale (FBS) (DMEM-basso) in ogni provetta utilizzando una pipetta sierologica e filtrare la sospensione cellulare utilizzando un colino di cella (dimensione dei pori di 100 µm) sulla cima di una provetta da centrifuga da 50 mL pipettando cella sospensione sulla parte superiore del filtro.</li>
	<li>Aggiungere 10 mL di DMEM-basso ancora una volta per ogni Mac-tubo mediante una pipetta sierologica e trasferire le cellule rimanenti al filtro cella sulla parte superiore della provetta da centrifuga da 50 mL.</li>
	<li>Lavare il filtro cella una volta con un ulteriore 10 mL di DMEM-bassa media utilizzando una pipetta sierologica.</li>
	<li>Centrifugare la sospensione cellulare per 7 min a 300 x g a RT ed eliminare il surnatante.</li>
	<li>Risospendere le cellule in 5 mL di sostanza basale endoteliale pre-riscaldato (EBM) -2-microvascolare medium (MV) (Lonza) completate con penna/mal/ampho nella stessa provetta da centrifuga da 50 mL.</li>
	<li>Sospensione di cellule di piastra in un matraccio di cultura cellulare T-25 preverniciato durante la notte con 1,5% gelatina-tamponato fosfato salino (PBS) a 37 ° C con 5% CO2.</li>
	<li>Incubare le cellule per 24 h a 37 ° C e 5% CO2, lavare le cellule due volte con attenzione con circa 5 mL di PBS e aggiungere 5 mL di terreno nuovo.</li>
	<li>Coltivare le cellule a 37 ° C e 5% CO2 fino al confluency di 80-90% (di solito 5-7 giorni) con intervalli di 48 h di rinnovamento medio.</li>
</ol>3. FACS-ordinamento delle cellule endoteliali
Nota: Cercate di evitare la perdita di cellule in qualsiasi punto, ad esempio limitando la procedura di colorazione per incubazione delle cellule in un tubo singolo reagente.
<ol><li>Staccare le cellule con 1 mL di accutase (circa 10 min) e aggiungere 4 mL di terreno di EBM-2-MV pre-riscaldata (37 ° C).</li>
	<li>Determinare il conteggio delle cellule utilizzando una cella automatizzata anomala (intervallo 10-25 µm).</li>
	<li>Centrifugare la sospensione cellulare per 4 min con 250 x g a RT ed eliminare il surnatante.</li>
	<li>Risospendere le cellule in pre-riscaldato FACS-buffer (1x PBS, il 2,5% di sieroalbumina bovina [BSA], pH di 5 mM EDTA 8.0, 10 µM Y-27632) secondo il conteggio delle cellule (5 x 106/ml).</li>
	<li>Aggiungere FACS-macchiatura anticorpi secondo volume delle cellule totali/FACS-buffer: CD31-FITC (100 µ l/mL = 1/10), CD144/vascolare endoteliale (VE) - cadherin - PE (100 µ l/mL = 1/10), CD105-APC (25 µ l/mL = 1/40), miscelare e incubare per 7 min a temperatura ambiente al riparo dalla luce; delicatamente flick e incubare per un altro 8 min (per un tempo totale di incubazione di 15 min).</li>
	<li>Aggiungere 2 mL di buffer di FACS alla sospensione cellulare con etichetta utilizzando una pipetta sierologica.</li>
	<li>Centrifugare per 4 min con 250 x g a RT e gettare il surnatante.</li>
	<li>Lavare due volte con l'aggiunta di 2 mL di buffer di FACS e condurre una successiva centrifugazione per 4 min a 250 x g a RT e gettare il surnatante.</li>
	<li>Risospendere le cellule in 500 µ l di pre-riscaldato EBM-2-MV-penna/mal/ampho e cellule di trasferimento allo strumento FACS-ordinamento.<ol>
<li>Cellule endoteliali moriranno rapidamente durante il processo di ordinamento se il FACS-strumento è raffreddato. Pertanto, eseguire l'ordinamento delle cellule endoteliali a RT e trasferire immediatamente le cellule raccolte nell'incubatore a 37 ° C in seguito. Nota: Lo strumento di FACS è solitamente non sterile!</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cellule di triple-positive di sorta/raccogliere direttamente in una piastra di coltura delle cellule (per esempio, 24 pozzetti piastra multistrip durante la notte con 1,5% gelatina-PBS) riempito con 0,5 mL di terreno nuovo pre-riscaldato (EBM-2-MV-penna/mal/ampho). Nota: Controllare la sospensione cellulare dopo l'ordinamento utilizzando un microscopio. Se le cellule si raggruppano, tenta di ottenere una distribuzione uniforme delle cellule nella piastra di coltura cellulare mescolandoli lentamente o aggiungendo medio.</li>
	<li>Coltivare cellule fino al confluency di 90-100% con intervalli di 48 h di rinnovamento media ed espandere le cellule per le dimensioni del piatto di cultura desiderata (piastra a 24 pozzetti → 12-pozzetti → 3,5 cm piatto → T-25 → T-75).</li>
</ol>4. raccolta e caratterizzazione di cellule endoteliali Pure
<ol><li>Raccogliere le cellule al 90-100% confluency e li caratterizzano mediante un metodo appropriato (ad es., FACS, Citochimica, reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR) o delle cellule endoteliali funzione saggi7,8).</li>
	<li>Analizzare le cellule isolate con qualsiasi metodo di caratterizzazione è scelto.</li>
</ol>

<ol><li>Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in health and disease.</a> Nat Med. 9 (6), 653-660 (2003).</li>
<li>Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+life%2C+disease+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in life, disease and medicine.</a> Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).</li>
<li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+cancer+and+other+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in cancer and other diseases.</a> Nature. 407 (6801), 249-257 (2000).</li>
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<li>Schellerer, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+of+human+colorectal+cancer+and+healthy+colon+reveal+phenotypic+differences+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells of human colorectal cancer and healthy colon reveal phenotypic differences in culture.</a> Lab Invest. 87 (11), 1159-1170 (2007).</li>
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<li>Grange, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+human+breast+tumor-derived+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol+Rep%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of human breast tumor-derived endothelial cells.</a> Oncol Rep. 15 (2), 381-386 (2006).</li>
<li>Miebach, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+microvascular+endothelial+cells+from+gliomas+of+different+WHO+grades%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurooncol%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of microvascular endothelial cells from gliomas of different WHO grades.</a> J Neurooncol. 76 (1), 39-48 (2006).</li>
<li>Richard, L., Velasco, P., Detmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+immunomagnetic+protocol+for+the+selective+isolation+and+long-term+culture+of+human+dermal+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A simple immunomagnetic protocol for the selective isolation and long-term culture of human dermal microvascular endothelial cells.</a> Exp Cell Res. 240 (1), 1-6 (1998).</li>
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<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere nessun interessi concorrenti.

Principalmente, tre diversi metodi sono stati impiegati finora per isolare puro e vitale CNE e TECs da tessuti umani solidi, vale a dire (1) immunomagnetica arricchimento, microdissezione laser (2) e (3) FACS-ordinamento della frazione CE. Nella maggior parte delle pubblicazioni, immunomagnetica arricchimento delle cellule dopo la generazione di una sospensione unicellulare di disintegrazione meccanica era usato11,12,13. Ad esempio, immunomagnetica purificazione di umano cutaneo microvascolare CE (HDMEC) di E-selectin anticorpi dopo il fattore di necrosi tumorale (TNF)-α trattamento da neonatale prepuzi13 è stato segnalato per l'isolamento di umana CE da glioma dal tessuto digerire, gradiente di percoll e selezione utilizzando anti-CD31/CD105 e VE-caderina-anticorpi12, o dagli anticorpi anti-CD105 da umano seno carcinoma11. Protocolli che impiegavano microdissezione laser o FACS-ordinamento sono stati riportati meno frequentemente. Microdissezione laser è stato utilizzato, per esempio, per identificare potenziale pan-tumore marcatori delle cellule endoteliali (TEMs) CE derivate da carcinoma colorettale umano con l'analisi delle cellule immediatamente dopo dissezione9. FACS-ordinamento utilizzando anti-CD31-anticorpi è stato dimostrato con successo per l'isolamento della frazione CE da embrionali indifferenziate umane cellule staminali14.
Questi approcci presentano diversi vantaggi e svantaggi che devono essere considerati. I vantaggi per l'approccio basato su immunomagnetica sono che non è necessario nessun equipaggiamento elaborato, la selezione può essere effettuata in qualsiasi momento e l'arricchimento delle cellule è veloce (circa 15 min) rispetto al FACS-ordinamento (circa 1h). La mancanza di matrice per un periodo di tempo più lungo può indurre la morte delle cellule della CE di anoikis. Pertanto, aggiunta dell'inibitore della chinasi rho Y-27632 nel buffer di FACS è stato impiegato per impedire la cella anoikis15.
Gli svantaggi di arricchimento immunomagnetica sono che più cicli di selezione sono necessari al fine di raggiungere la purezza superiore al 99%. Inoltre, colture cellulari tra arricchimenti sono necessaria per il recupero delle cellule, che aumenta l'età delle culture sostenere manufatti indotta da cultura. Microdissezione laser ha il vantaggio che le cellule possono essere utilizzati immediatamente che riduce indotta da cultura manufatti ma include il rischio di contaminazione da parte di cellule dal tessuto adiacente zone10. Inoltre, microdissection non è stabilito in ogni laboratorio. Gli svantaggi dell'approccio FACS-ordinamento-base includono, simile al laser microdissection, che l'apparecchiatura è elaborati e costosi. Di conseguenza, questa apparecchiatura può non essere accessibile in qualsiasi momento. In una regolazione clinica, dove la disponibilità del tessuto di interesse non può essere prevista esattamente, questo può aggiungere un ulteriore svantaggio.
Tuttavia, i vantaggi principali di FACS-ordinamento sono che la frazione di CE possa essere etichettata dagli anticorpi multipli in parallelo. Così, una strategia di gating severe può essere impiegato che garantirà un'elevata purezza. Basato su esperienza, nessun re-ordinamento della frazione CE è stato richiesto, in contrasto con il precedente protocollo basato su Mac dove tondi multipli di selezione dovevano essere impiegato. Ciò ha condotto ad un tempo significativamente ridotta coltivazione fino alla purezza da sei settimane (approccio MACS) per tre settimane nell'approccio FACS, conseguente a un'attivazione di una finestra di tempo prolungato di analisi la vitalità cellulare migliorata. Infine, utilizzando la strategia di FACS-ordinamento-basato, un miglioramento del tasso di successo globale di isolamento potrebbe essere raggiunto (aumento del 12,5%). In conclusione, il FACS-ordinamento basato strategia impiegando 3 anticorpi in parallelo dopo digerire tessuto tramite digestione combinata meccanica ed enzimatica del tessuto ha avuto numerosi vantaggi che ha stabilito questo protocollo come il metodo di scelta per l'isolamento di TECs e CNE da umane di carcinoma del colon-retto e del colon.

Il microambiente tumorale (TME) è definito come una stretta interazione delle cellule del tumore con lo stroma del tumore, che è composto di cellule come le cellule endoteliali (CE), periciti, fibroblasti, cellule muscolari lisce o cellule del sistema immunitario. La comunicazione tra questi compartimenti cellulari può essere guidata da fattori paracrini (ad es., fattori di crescita angiogenici, citochine), dalla matrice extracellulare, o contatto diretto cellula-cellula. Il compartimento stromale può favorire o contrastare l'inizio del tumore o la progressione, a seconda della TME specifico stabilito.
La possibilità di un tumore di connettersi con il sistema del vaso è la chiave per la progressione e la metastasi della malattia. Il sistema del vaso permette il tumore principalmente ottenere l'accesso per la consegna di ossigeno e nutrienti, nonché la rimozione di prodotti di scarto1,2,3. CE costituiscono la superficie interna dei vasi e sono quindi importanti componenti cellulari che partecipano attivamente a questo processo. È noto che cellule endoteliali tumorali (TEC) sono diverse da loro corrispondenti cellule endoteliali normali (NEC) di molte caratteristiche come disturbato gerarchia dell'albero vascolare, permeabilità del vaso, o ridotta maturazione come esemplificato da un ridotto numero di cellule di periciti/murale soltanto senza bloccare collegati al CE4.
Quindi, TECs sono strumenti preziosi cellulari per lo studio di carcinogenesi. TECs principalmente sono stati considerati per promuovere la crescita e la progressione di tumore3. Così, TECs può essere utilizzato come biosensori che consentono il monitoraggio e l'identificazione dei processi patogeni che avviano, favorire o contrastare la tumorigenesi. Inoltre, essi sono bersagli terapeutici in clinica5. Di conseguenza, TECs isolato e CNE corrispondente possono anche essere utilizzati come strumenti per comprendere i meccanismi di risposta o di resistenza al trattamento anti-angiogenico.
In passato, abbiamo sviluppato un protocollo per isolare queste cellule6,7 e identificato che TECs non sono solo diverse da CNE, ma inoltre differiscono tra loro a seconda della TME sono stati derivati da8. Attraverso questo approccio, è stato dimostrato che TECs in determinate TMEs può contrastare attivamente la crescita del tumore e la progressione dalla secrezione di proteine tumore-soppressiva di anti-angiogenici come SPARCL1. Ciò ha indicato che TECs stanno contribuendo attivamente all'istituzione di una TME prognosticamente favorevole nel carcinoma colorettale umano (CRC)8.
Gli studi precedenti ha tentato di isolare TECs umana da tumori solidi. Un obiettivo importante di questi studi era, per esempio, l'identificazione di nuovo tumore delle cellule endoteliali marcatori (TEMs)9. Una strategia di utilizzo immediato di TECs dopo microdissezione laser è stato applicato al fine di evitare l'alterazione o la perdita del fenotipo TEC nella cultura. Tuttavia, gli studi di follow-up identificato una popolazione contaminante delle cellule murale come un grave inconveniente di questo approccio10. Il nostro laboratorio è stato il primo a sviluppare un protocollo che ha permesso l'isolamento di TECs puro, praticabile da umano CRC pazienti6,7. È stato scelto un approccio con più cicli di selezione (MACS) cella magnetico di TECs che assicurava ad alta purezza delle culture CE isolate. Tuttavia, questo approccio ha richiesto un periodo di coltivazione relativamente lungo (6 settimane in media), che ha aumentato il rischio di manufatti indotta da cultura. Quindi, nel passaggio successivo, lo scopo era di ridurre il tempo di coltivazione fra chirurgia e la raccolta della prima cultura pura. Per raggiungere questo obiettivo, un protocollo migliorato impiegando una dissociazione combinato enzimatici basati e meccanica del tessuto del tumore iniziale, seguita da celle attivate la fluorescenza che ordinano (FACS)-ordinamento della tripla-con l'etichetta CE, è stato sviluppato. Questo ridotto tempo di isolamento in media per tre settimane, con conseguente colture pure di TEC e NEC con maggiore redditività per studi funzionali. Isolamento delle colture pure di TEC e NEC praticabile da tessuti umani con alte percentuali di successo può aprire nuove vie per paziente-specifici droga test durante lo sviluppo di regimi di terapia individualizzata. L'approccio di isolamento è dettagliato nei paragrafi seguenti.

<table><tbody><tr><td>HBSS 1x</td><td>Gibco di Life Technologies</td><td>14175-053</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina</td><td>Gibco di Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>amfotericina B</td><td>Gibco di Life Technologies</td><td>15290-026</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi, monouso</td><td>Piuma</td><td>n. 23</td><td></td></tr><tr><td>delicata dissociatore octo MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-937</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C-tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>kit di dissociazione del tumore umano</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-929</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>21969-035</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2-MV BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3202</td><td></td></tr><tr><td>Filtro cellulare, 100 &; m</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase&nbsp;</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>Contatore di cellule, contatore di</td><td>coltri</td> automatizzato <td>Z1</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>CD31-FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>555445</td><td></td></tr><tr><td>CD144/VE-caderina-PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>560410</td><td></td></tr><tr><td>CD105-APC</td><td>BD Pharmingen</td><td>562408</td><td></td></tr><tr><td>gelatina da pelle bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>FACS-Dispositivo di selezione</td><td>Beckman Coulter</td><td>MoFlo XDP</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento di cellule endoteliali umane da colon normale e carcinoma colorettale - un protocollo migliorato

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

Cellule primarie isolate da carcinoma umani sono strumenti preziosi per identificare i meccanismi patogeni che contribuiscono alla progressione e lo sviluppo della malattia. In particolare, le cellule endoteliali (CE) che costituiscono la superficie interna dei vasi, direttamente partecipare alla consegna dell'ossigeno, apporto nutritivo e la rimozione dei rifiuti prodotti e dai tumori e sono quindi principalmente coinvolte nella costituzione del tumore microambiente (TME). Cellule endoteliali tumorali (TECs) possono essere utilizzate come biosensori cellulari del microambiente intratumoral istituito dalla comunicazione fra il tumore e cellule stromali. TECs servono anche come gli obiettivi della terapia. Di conseguenza, nella cultura queste cellule permettono studi sui meccanismi di risposta o di resistenza al trattamento anti-angiogenico. Recentemente, è stato trovato che TECs isolata da carcinoma umano del colon-retto (CRC) Mostra memoria-come gli effetti basati sulla TME specifici sono stati derivati da. Inoltre, questi TECs contribuire attivamente alla creazione di una specifica TME dalla secrezione di fattori diversi. Ad esempio, TECs in una Th1-TME prognosticamente favorevole secernere la proteina tumore-soppressiva fattore secernuto anti-angiogenici, acida e ricca di cisteina-simile 1 (SPARCL1). SPARCL1 regola l'omeostasi nave e inibisce la migrazione e la proliferazione delle cellule tumorali. Quindi, culture di TECs puro, praticabile, isolato da tumori solidi umani sono uno strumento prezioso per gli studi funzionali sul ruolo del sistema vascolare nella tumorigenesi. Qui, un nuovo protocollo sono aggiornato per l'isolamento primaria CE da colon normale nonché CRC è descritto. La tecnica si basa sulla digestione meccanica ed enzimatica del tessuto, immunolabeling e delle cellule attivate la fluorescenza che ordinano (FACS)-ordinamento delle cellule triple-positive (CD31, VE-caderina, CD105). Con questo protocollo, TEC praticabile o colture di cellule endoteliali normali (NEC) potrebbero essere isolati dai tessuti del colon con un tasso di successo di 62,12% quando sottoposti a cernita FACS (41 colture pure CE da 66 campioni di tessuto). Di conseguenza, questo protocollo fornisce un approccio efficace per isolare culture umane CE da normale del colon e CRC.

L'isolamento di NEC e TEC da CRC umana di una dissociazione combinato meccanico/acidica del tessuto, seguita da successive CD31/CD105/VE-caderina-driven FACS-ordinamento è descritto qui (Figura 1A). Questo protocollo rappresenta un protocollo migliorato con una finestra di tempo ridotto fino al primo raccolto delle cellule endoteliali pure, praticabile rispetto al precedente protocollo basato su Mac7.
NEC e TEC sono stati isolati da CRC umano attenendosi alla seguente procedura: (1) generazione di una sospensione unicellulare di dissociazione combinata meccanica ed enzimatica del tessuto e la crescita di queste cellule al confluency di 80-90% (Figura 1), (2) triple etichettatura della CE di anticorpi fluorocromo-accoppiato CD31/CD105/VE-caderina e (3) FACS-ordinamento delle rispettive cellule triple-positive (Figura 2A). Di nota, un passo fondamentale per il successo della procedura di isolamento e la vitalità delle cellule è rapidamente soggetti l'esemplare di chirurgia per la procedura di isolamento (generazione di sospensione unicellulare &lt; 1 ora dopo resezione). Utilizzando FACS-ordinamento, una media di 12.500 TEC (n = 12) e 17.800 NEC (n = 12, Figura 2B, sinistra) che rappresenta una media di 3,6 e il 5,6% della popolazione totale delle cellule (Figura 2B, destra) potrebbe essere isolato. Successivamente, le cellule sono state ampliate fino a T-75 (chiamato passaggio 1) e raccolto o successivamente trattato per analisi. Della nota, utilizzando il protocollo precedente basato su Mac, è stato raggiunto un successo di isolamento medio del 49,6% (n = 58 TECs puro da n = 117 pazienti8) con puro CE culture disponibile mediamente 6 settimane dopo la chirurgia. Usando il nuovo protocollo basato su FACS descritto qui, le prime colture di CE pure sono state ottenute in media 3 settimane dopo l'intervento chirurgico con un tasso di successo di isolamento del 62,1% (n = 41 colture pure di CE ottenute da n = 66 singole cellule sospensioni sottoposti a cernita FACS). Di conseguenza, un aumento del tasso di isolamento del 12,5% è stato raggiunto in parallelo con una diminuzione del tempo di coltivazione da 6 a 3 settimane. Questa riduzione del tempo di coltivazione hanno portato a vitalità cellulare migliore e prolungata durata accompagnata da minore esposizione all'induzione di potenziali dipendenti dalla cultura manufatti delle culture stabilite.
Caratterizzazione di purezza CE è stata condotta prima di CD31-citochimica (Figura 3A). Se le culture erano privi di cellule di CD31-negative (Figura 3A, TEC e NEC), sono stati sottoposti a una cella più dettagliata digitando da reazione a catena della polimerasi quantitativa trascrizione inversa (RT-qPCR) (Figura 3B). Sono stati utilizzati primers specifici del tipo di cella per CE (CD31, CD105, VE-caderina e von Willebrand factor [vWF]), leucociti (CD45), cellule epiteliali (cytokeratin [CK] -20) e cellule di muscolo liscio/fibroblasti (desmin) (Figura 3B). Utilizzando questa cella basata su qPCR digitando, una potenziale contaminazione delle culture CE da altre celle dell'intervallo di 0,1 - 2%, a seconda del tipo di cellula, può essere rilevato8.
In particolare, precedentemente abbiamo segnalato una perdita preferenziale di espressione della proteina di sindrome di Raynaud in TEC culture rispetto ai loro corrispondenti NEC culture7. Questi risultati potrebbero essere confermati con il protocollo di isolamento neoformata (Figura 3C, significa perdita di Ct NEC-TEC = 0.687, p = 0.173, t-prova accoppiata). Culture, superato con successo questi controlli di qualità sono state testate per infezione del micoplasma e successivamente utilizzate per ulteriori esperimenti.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57400/57400fig1.jpg"> Figura 1 : Cellule endoteliali pure possono essere isolate dal colon umano normale e CRC ordinando FACS. (A) diagramma di flusso delle tappe fondamentali del processo di isolamento CE. (B) (giallo), altre parti non-tumorale, o parti di tessuto necrotico potenzialmente (marrone) sono stati rimossi dall'esemplare della chirurgia (pannello di sinistra e centrale) ed il tumore era disintegrato in cubetti di 2-3 mm di lunghezza lato prima del tessuto dissociazione (tessuto adiposo Pannello di destra). (C), la singola cella sospensione estratto dopo dissociazione del tessuto (pannello di sinistra) è stato incubato per 24 h in piastre di coltura delle cellule. Successivamente, le cellule non-aderenti sono stati rimossi per lavaggio delicato con PBS (pannello centrale) e le cellule sono state coltivate per confluency di 80-90% prima dell'ordinamento FACS (pannello di destra). Immagini del pannello inferiore (C) sono state acquisite da microscopia di contrasto di fase. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57400/57400fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57400/57400fig2.jpg"> Figura 2 : Una media di 3,6-5,6% della sospensione delle singole cellule isolate da pazienti affetti da CRC e filtrate FACS erano triple-positivi EC. (A) NEC e TEC erano FACS-ordinati utilizzando una tripla etichettatura delle cellule con anticorpi anti-CD31, - CD105 e - VE-caderina. (B) una media di 12.500 TECs (n = 12) e 17.800 CNE (n = 12) possono essere isolati dal colon umano normale o CRC usando FACS-ordinamento (celle CD31, CD105 e VE-caderina-positivo, pannello sinistro), che rappresenta in media 3.6 e 5,6% (pannello di destra) della cella totale popolazione occupata. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57400/57400fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57400/57400fig3.jpg"> Figura 3 : NEC e TEC da CRC umani esprimono marcatori tipici delle cellule endoteliali. Cellule endoteliali del colon normale (NEC, n = 10) e cellule endoteliali tumorali (TEC, n = 10) da CRC umano sono CD31 (marcatore di CE)-, CD105 (marcatore di CE)-, VE-caderina (marcatore CE)-, sindrome di Raynaud (marcatore CE) - positivo e CK20 (indicatore di cella CRC)-, desmina (indicatore del fibroblasto/SMC)-, CD45 ( marcatore del leucocita)-negativo come determinato da (A) CD31-immunocitochimica (cellule positive = rosso) e (B) RT-qPCR (dati punti sotto la linea tratteggiata sono campioni rilevati essere negativo). Espressione di sindrome di Raynaud (C) come determinato da RT-qPCR per campioni TEC/NEC corrispondenti dagli stessi pazienti. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57400/57400fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Cellule endoteliali tumorali sono fattori determinanti importanti del microambiente tumorale e il decorso della malattia. Qui, un protocollo per l'isolamento di cellule endoteliali pure e praticabile da carcinoma colorettale umano e colon normale a essere impiegata nella ricerca di droga test e la patogenesi è descritto.

Isolamento di cellule endoteliali umane da Colon normale e Carcinoma colorettale - un protocollo migliorato

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

L'obiettivo generale di questo protocollo di isolamento cellulare è quello di ottenere cellule endoteliali pure e vitali da pazienti affetti da carcinoma del colon-retto, sia dal tumore che dal corrispondente colon normale. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia dei tumori e dell'angiogenesi, come stimare e analizzare l'impatto del sistema dei vasi sanguigni sulla tumorigenesi del colon-retto. Il vantaggio principale di questa tecnica è che si può avere un tasso di successo relativamente alto nell'ottenere cellule endoteliali umane pure e vitali da pazienti con carcinoma colorettale.Per ottenere il campione di tessuto da pazienti con carcinoma del colon-retto, utilizzare un bisturi fresco per ottenere pezzi di tessuto che pesano circa un grammo. Quindi, utilizzare una pinza sterile per trasferire i pezzi di tessuto fresco in 40 millilitri di tampone HBSS ghiacciato con antibiotici in una provetta da centrifuga da 50 millilitri. Quindi, utilizzare una pinza sterile separata per trasferire il carcinoma e il tessuto normale in sequenza da una provetta da centrifuga all'altra per lavare 40 millilitri di tampone HBSS ghiacciato con antibiotici quattro volte.Per rimuovere tutto il grasso, il tessuto non tumorale o le parti di tessuto potenzialmente necrotiche, utilizzare una pinza sterile e trasferire i pezzi di tessuto in una piastra di Petri sterile per colture cellulari. Quindi, aggiungere da tre a cinque millilitri di tampone HBSS integrato con antibiotici per lasciare i pezzi di tessuto inumiditi. Quindi, usa un bisturi fresco per tagliare i pezzi di tessuto.Quindi, usa un bisturi con una lama curva per tritare il tessuto rimanente in piccoli pezzi. Trasferire i pezzi di tessuto tritati in una provetta di dissociazione tissutale riempita con terreno di coltura cellulare preriscaldato. Dissociare i pezzi di tessuto tritato utilizzando un dissociatore tissutale, insieme a un kit di dissociazione tumorale per tessuti umani seguendo le istruzioni del produttore.Il primo passo critico è quello di elaborare e microdissezionare correttamente il campione chirurgico al fine di ottenere pezzi di tessuto con le dimensioni e il tipo di tessuto corretti. Dopo aver dissociato i pezzi di tessuto, centrifugarlo a temperatura ambiente a 300 volte la gravità per un minuto. Quindi, utilizzare una pipetta sierologica per aggiungere 10 millilitri di DMEM Low medium preriscaldato alla provetta MACS.Quindi, versare la sospensione cellulare dalla provetta su un filtro cellulare con pori di 100 micrometri posizionato sopra una provetta da centrifuga da 50 millilitri. Pipettare altri 10 millilitri di DMEM Low medium nella provetta MACS per eliminare le cellule aggiuntive dalla provetta attraverso il filtro nella provetta da centrifuga. Una volta filtrata l'intera sospensione cellulare, lavare il filtro cellulare con altri 10 millilitri di DMEM Low medium.Centrifugare la sospensione cellulare a temperatura ambiente a 300 volte la gravità per sette minuti. Quindi, scartare il surnatante una volta terminata la centrifugazione. Quindi, sciogliere il pellet cellulare in cinque millilitri di terreno EBM-2-MV integrato con antibiotici e preriscaldato nella stessa provetta da centrifuga da 50 millilitri.Rimuovere la soluzione di rivestimento dal pallone di coltura e trasferire la sospensione cellulare direttamente in un pallone di coltura T-25 mantenuto a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Quando la confluenza raggiunge circa l'80-90%aggiungere un millilitro di Accutase per staccare le cellule nel pallone. Quindi, lasciare le celle con l'Accutase per 10 minuti.Quindi, aggiungere quattro millilitri di terreno EBM-2-MV mantenuto a 37 gradi alle celle. Quindi, utilizzare un dispositivo di conteggio automatico delle cellule con una gamma da 10 a 25 micrometri per contare le cellule. Il secondo passaggio più critico sono tutti i passaggi in cui le celle devono essere divise.La stima del punto temporale corretto richiede esperienza. Se la divisione è troppo precoce, le cellule moriranno. Se la scissione è troppo tardiva, le cellule endoteliali raggiungeranno la senescenza o la crescita eccessiva dei fibroblasti sarà un problema.Quindi, centrifugare le celle a temperatura ambiente a 250 volte la gravità per quattro minuti ed espellere il surnatante alla fine della corsa. Quindi, sciogliere il pellet della cella nel tampone FACS preriscaldato. Quindi, aggiungere gli anticorpi di colorazione FACS alle cellule.Mescolare e successivamente incubare a temperatura ambiente per un totale di 15 minuti. Dopo la metà di questo periodo di incubazione, sbattere una volta la provetta. Utilizzare una pipetta sierologica per aggiungere due millilitri di tampone FACS alla sospensione cellulare marcata.Quindi, centrifugare la sospensione cellulare a temperatura ambiente a 250 volte la gravità per quattro minuti e decantare il surnatante al termine della centrifugazione. Quindi, aggiungere due millilitri di tampone FACS per sciogliere il pellet cellulare e centrifugare la sospensione cellulare a temperatura ambiente per quattro minuti a 250 volte la gravità. Quindi, risospendere il pellet in 500 microlitri di terreno EBM-2-MV integrato con antibiotici.Quindi, trasferire le celle allo strumento di smistamento FACS. Identificare le cellule triplo positive e lasciarle seminare nel piatto di coltura a 24 pozzetti riempito con terreno EBM-2-MV fresco e preriscaldato. Coltivare le cellule per le successive 48 ore, quindi rinnovare il terreno.Continuare a cambiare il mezzo ogni due giorni fino a quando la confluenza raggiunge il 90-100% in cinque o 10 giorni. Quindi, espandere la popolazione cellulare in base al piatto di coltura desiderato. Quindi, raccogliere una volta raggiunta la confluenza e procedere verso la caratterizzazione.In primo luogo, il campione tumorale ottenuto viene dissociato e seminato in una piastra di coltura cellulare. Le cellule non aderenti vengono lavate via e le cellule aderenti vengono coltivate all'80-90% di confluenza prima della selezione FACS. Successivamente, viene eseguita l'analisi FACS per identificare la popolazione del tumore vitale immunomarcato e delle cellule endoteliali normali.Per fare ciò, viene eseguita una tripla marcatura specifica per anticorpi accoppiati a fluorocromo delle cellule endoteliali normali e tumorali per essere selezionate attraverso FACS. In media, il 3,6 e il 5,6% dell'intera popolazione cellulare selezionata sono rispettivamente cellule tumorali ed endoteliali normali. Successivamente, per identificare l'espressione dei marcatori delle cellule endoteliali, le cellule endoteliali normali e tumorali ottenute vengono sottoposte a immunocitochimica.Le immagini qui mostrano cellule endoteliali normali e tumorali CD31-positive. Quindi, l'RNA viene isolato dalla popolazione CD31-positiva di cellule endoteliali e sottoposto a RT-qPCR per identificare gli altri marcatori specifici delle cellule endoteliali. Dal grafico viene rilevata anche l'espressione di marcatori di cellule endoteliali, come CD105, VE-caderina e fattore di von Willebrand, ma manca l'espressione di marcatori da popolazioni cellulari potenzialmente contaminanti, indicando la purezza delle colture cellulari endoteliali isolate.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa tre settimane se eseguita correttamente. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché richiede esperienza con colture cellulari endoteliali primarie per stimare quando e a quali rapporti le cellule possono essere divise o essere ulteriormente elaborate per l'analisi di smistamento FACS. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia del carcinoma del colon-retto perché le colture cellulari possono essere utilizzate per identificare i meccanismi della tumorigenesi, della risposta al trattamento o della resistenza nel carcinoma del colon-retto.Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo letto diversi rapporti in letteratura che indicavano problemi con la creazione di cellule endoteliali veramente pure e vitali da tumori solidi umani. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché le fasi di microdissezione o lavorazione dei tessuti per l'analisi di smistamento FACS o l'ulteriore suddivisione delle cellule endoteliali richiedono esperienza per stimare il punto temporale corretto. Durante il tentativo di questa procedura, è importante prima stabilire una rete cooperativa funzionale con chirurgia, patologia e registro tumori.Inoltre, dovresti essere addestrato all'esercizio fisico per lavorare con colture di cellule endoteliali primarie, poiché queste cellule sono fragili. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare le cellule endoteliali dal carcinoma colorettale umano e dal corrispondente colon normale.

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