Isolamento di cellule endoteliali umane da Colon normale e Carcinoma colorettale - un protocollo migliorato

L'obiettivo generale di questo protocollo di isolamento cellulare è quello di ottenere cellule endoteliali pure e vitali da pazienti affetti da carcinoma del colon-retto, sia dal tumore che dal corrispondente colon normale. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia dei tumori e dell'angiogenesi, come stimare e analizzare l'impatto del sistema dei vasi sanguigni sulla tumorigenesi del colon-retto. Il vantaggio principale di questa tecnica è che si può avere un tasso di successo relativamente alto nell'ottenere cellule endoteliali umane pure e vitali da pazienti con carcinoma colorettale.

Per ottenere il campione di tessuto da pazienti con carcinoma del colon-retto, utilizzare un bisturi fresco per ottenere pezzi di tessuto che pesano circa un grammo. Quindi, utilizzare una pinza sterile per trasferire i pezzi di tessuto fresco in 40 millilitri di tampone HBSS ghiacciato con antibiotici in una provetta da centrifuga da 50 millilitri. Quindi, utilizzare una pinza sterile separata per trasferire il carcinoma e il tessuto normale in sequenza da una provetta da centrifuga all'altra per lavare 40 millilitri di tampone HBSS ghiacciato con antibiotici quattro volte.

Per rimuovere tutto il grasso, il tessuto non tumorale o le parti di tessuto potenzialmente necrotiche, utilizzare una pinza sterile e trasferire i pezzi di tessuto in una piastra di Petri sterile per colture cellulari. Quindi, aggiungere da tre a cinque millilitri di tampone HBSS integrato con antibiotici per lasciare i pezzi di tessuto inumiditi. Quindi, usa un bisturi fresco per tagliare i pezzi di tessuto.

Quindi, usa un bisturi con una lama curva per tritare il tessuto rimanente in piccoli pezzi. Trasferire i pezzi di tessuto tritati in una provetta di dissociazione tissutale riempita con terreno di coltura cellulare preriscaldato. Dissociare i pezzi di tessuto tritato utilizzando un dissociatore tissutale, insieme a un kit di dissociazione tumorale per tessuti umani seguendo le istruzioni del produttore.

Il primo passo critico è quello di elaborare e microdissezionare correttamente il campione chirurgico al fine di ottenere pezzi di tessuto con le dimensioni e il tipo di tessuto corretti. Dopo aver dissociato i pezzi di tessuto, centrifugarlo a temperatura ambiente a 300 volte la gravità per un minuto. Quindi, utilizzare una pipetta sierologica per aggiungere 10 millilitri di DMEM Low medium preriscaldato alla provetta MACS.

Quindi, versare la sospensione cellulare dalla provetta su un filtro cellulare con pori di 100 micrometri posizionato sopra una provetta da centrifuga da 50 millilitri. Pipettare altri 10 millilitri di DMEM Low medium nella provetta MACS per eliminare le cellule aggiuntive dalla provetta attraverso il filtro nella provetta da centrifuga. Una volta filtrata l'intera sospensione cellulare, lavare il filtro cellulare con altri 10 millilitri di DMEM Low medium.

Centrifugare la sospensione cellulare a temperatura ambiente a 300 volte la gravità per sette minuti. Quindi, scartare il surnatante una volta terminata la centrifugazione. Quindi, sciogliere il pellet cellulare in cinque millilitri di terreno EBM-2-MV integrato con antibiotici e preriscaldato nella stessa provetta da centrifuga da 50 millilitri.

Rimuovere la soluzione di rivestimento dal pallone di coltura e trasferire la sospensione cellulare direttamente in un pallone di coltura T-25 mantenuto a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Quando la confluenza raggiunge circa l'80-90%aggiungere un millilitro di Accutase per staccare le cellule nel pallone. Quindi, lasciare le celle con l'Accutase per 10 minuti.

Quindi, aggiungere quattro millilitri di terreno EBM-2-MV mantenuto a 37 gradi alle celle. Quindi, utilizzare un dispositivo di conteggio automatico delle cellule con una gamma da 10 a 25 micrometri per contare le cellule. Il secondo passaggio più critico sono tutti i passaggi in cui le celle devono essere divise.

La stima del punto temporale corretto richiede esperienza. Se la divisione è troppo precoce, le cellule moriranno. Se la scissione è troppo tardiva, le cellule endoteliali raggiungeranno la senescenza o la crescita eccessiva dei fibroblasti sarà un problema.

Quindi, centrifugare le celle a temperatura ambiente a 250 volte la gravità per quattro minuti ed espellere il surnatante alla fine della corsa. Quindi, sciogliere il pellet della cella nel tampone FACS preriscaldato. Quindi, aggiungere gli anticorpi di colorazione FACS alle cellule.

Mescolare e successivamente incubare a temperatura ambiente per un totale di 15 minuti. Dopo la metà di questo periodo di incubazione, sbattere una volta la provetta. Utilizzare una pipetta sierologica per aggiungere due millilitri di tampone FACS alla sospensione cellulare marcata.

Quindi, centrifugare la sospensione cellulare a temperatura ambiente a 250 volte la gravità per quattro minuti e decantare il surnatante al termine della centrifugazione. Quindi, aggiungere due millilitri di tampone FACS per sciogliere il pellet cellulare e centrifugare la sospensione cellulare a temperatura ambiente per quattro minuti a 250 volte la gravità. Quindi, risospendere il pellet in 500 microlitri di terreno EBM-2-MV integrato con antibiotici.

Quindi, trasferire le celle allo strumento di smistamento FACS. Identificare le cellule triplo positive e lasciarle seminare nel piatto di coltura a 24 pozzetti riempito con terreno EBM-2-MV fresco e preriscaldato. Coltivare le cellule per le successive 48 ore, quindi rinnovare il terreno.

Continuare a cambiare il mezzo ogni due giorni fino a quando la confluenza raggiunge il 90-100% in cinque o 10 giorni. Quindi, espandere la popolazione cellulare in base al piatto di coltura desiderato. Quindi, raccogliere una volta raggiunta la confluenza e procedere verso la caratterizzazione.

In primo luogo, il campione tumorale ottenuto viene dissociato e seminato in una piastra di coltura cellulare. Le cellule non aderenti vengono lavate via e le cellule aderenti vengono coltivate all'80-90% di confluenza prima della selezione FACS. Successivamente, viene eseguita l'analisi FACS per identificare la popolazione del tumore vitale immunomarcato e delle cellule endoteliali normali.

Per fare ciò, viene eseguita una tripla marcatura specifica per anticorpi accoppiati a fluorocromo delle cellule endoteliali normali e tumorali per essere selezionate attraverso FACS. In media, il 3,6 e il 5,6% dell'intera popolazione cellulare selezionata sono rispettivamente cellule tumorali ed endoteliali normali. Successivamente, per identificare l'espressione dei marcatori delle cellule endoteliali, le cellule endoteliali normali e tumorali ottenute vengono sottoposte a immunocitochimica.

Le immagini qui mostrano cellule endoteliali normali e tumorali CD31-positive. Quindi, l'RNA viene isolato dalla popolazione CD31-positiva di cellule endoteliali e sottoposto a RT-qPCR per identificare gli altri marcatori specifici delle cellule endoteliali. Dal grafico viene rilevata anche l'espressione di marcatori di cellule endoteliali, come CD105, VE-caderina e fattore di von Willebrand, ma manca l'espressione di marcatori da popolazioni cellulari potenzialmente contaminanti, indicando la purezza delle colture cellulari endoteliali isolate.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa tre settimane se eseguita correttamente. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché richiede esperienza con colture cellulari endoteliali primarie per stimare quando e a quali rapporti le cellule possono essere divise o essere ulteriormente elaborate per l'analisi di smistamento FACS. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia del carcinoma del colon-retto perché le colture cellulari possono essere utilizzate per identificare i meccanismi della tumorigenesi, della risposta al trattamento o della resistenza nel carcinoma del colon-retto.

Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo letto diversi rapporti in letteratura che indicavano problemi con la creazione di cellule endoteliali veramente pure e vitali da tumori solidi umani. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché le fasi di microdissezione o lavorazione dei tessuti per l'analisi di smistamento FACS o l'ulteriore suddivisione delle cellule endoteliali richiedono esperienza per stimare il punto temporale corretto. Durante il tentativo di questa procedura, è importante prima stabilire una rete cooperativa funzionale con chirurgia, patologia e registro tumori.

Inoltre, dovresti essere addestrato all'esercizio fisico per lavorare con colture di cellule endoteliali primarie, poiché queste cellule sono fragili. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare le cellule endoteliali dal carcinoma colorettale umano e dal corrispondente colon normale.